趙譚軍，劉麗，常亞青，湛垚垚

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

近年來(lái)，由于受到全球氣候變化、生態(tài)環(huán)境破壞、水質(zhì)污染和過(guò)度捕撈等多種因素的影響，全球漁業(yè)資源量呈逐年減少趨勢(shì)，其中，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種的種質(zhì)退化和單產(chǎn)降低問(wèn)題尤為突出，嚴(yán)重制約了漁業(yè)經(jīng)濟(jì)和水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)是進(jìn)行常規(guī)水產(chǎn)動(dòng)物繁殖、人工育種及資源保存的重要基礎(chǔ)材料，自20世紀(jì)50年代英國(guó)學(xué)者Blaxter[1]利用低溫冷凍技術(shù)首次成功冷凍保存大西洋鯡Clupeaharengus的精巢(Testis)以來(lái)，低溫保存技術(shù)已廣泛應(yīng)用于魚(yú)[2-3]、貝[4-5]、蝦[6]和蟹[7-8]等水產(chǎn)動(dòng)物的種質(zhì)資源保存和新種創(chuàng)制工作中,并取得了較為豐碩的成果。然而，傳統(tǒng)的水產(chǎn)動(dòng)物配子低溫冷凍保存技術(shù)仍不完善，存在季節(jié)依賴(lài)和配子成熟度依賴(lài)等諸多局限，難以用于保護(hù)未達(dá)到性成熟或者難以產(chǎn)生成熟配子的瀕危物種的種質(zhì)資源。

精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性動(dòng)物睪丸(Testicle)或精巢特定區(qū)域存在的一類(lèi)具有調(diào)節(jié)干細(xì)胞特性的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESs)是從動(dòng)物早期發(fā)育胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到的一類(lèi)未分化的全能性細(xì)胞[9]。研究表明，無(wú)論是精原干細(xì)胞還是胚胎干細(xì)胞均具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化等特性[10-11]。20世紀(jì)80年代，研究人員從小鼠Musmusculus體內(nèi)首次成功分離精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞[12-13]，隨后有學(xué)者提出將這兩種具有多向分化潛能的細(xì)胞作為生物的一種種質(zhì)資源進(jìn)行保存的設(shè)想。之后，對(duì)小鼠、牛Bosbubalus和豬Susscrofa等[14-21]陸生動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的低溫冷凍保存技術(shù)研究工作陸續(xù)展開(kāi)，目前，陸生動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的低溫冷凍保存技術(shù)已日趨完善和逐步成熟。

近年來(lái)，通過(guò)借鑒陸生動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞低溫冷凍的相關(guān)技術(shù)，水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的低溫冷凍保存研究也逐漸展開(kāi)并取得了一定的進(jìn)展。為了進(jìn)一步梳理近年來(lái)的相關(guān)科研成果，本文綜述了水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞冷凍保存技術(shù)及其應(yīng)用情況，以期進(jìn)一步豐富和完善水產(chǎn)動(dòng)物精子和胚胎冷凍及保存技術(shù)的資料體系，為充分利用低溫冷凍保存技術(shù)提高水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源保護(hù)和新種創(chuàng)制效率提供參考。

1 精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞基本特征

1.1 水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞

精原干細(xì)胞是存在于雄性動(dòng)物體精巢或睪丸內(nèi)的一類(lèi)能夠進(jìn)行自我更新且具有多能性分化能力的成體干細(xì)胞[22]。對(duì)于大多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物而言，精原干細(xì)胞是雄性機(jī)體內(nèi)最大的生殖細(xì)胞，且胞內(nèi)含有大量的可以為細(xì)胞分裂提供能量的線(xiàn)粒體[23-28]，但研究發(fā)現(xiàn)，魁蚶Scapharcabroughtonii和凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei這兩種水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的初級(jí)精母細(xì)胞無(wú)論在細(xì)胞體積，還是在胞內(nèi)線(xiàn)粒體的含量上都要明顯高于體內(nèi)的精原干細(xì)胞[29-30]。絕大多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物的精原干細(xì)胞在外形上呈圓形或橢圓形，但在個(gè)別蝦類(lèi)中也發(fā)現(xiàn)了多角形或卵圓形的精原干細(xì)胞[28,30](表1)。與水產(chǎn)動(dòng)物成熟的精子(直徑0.9～8.0 μm)相比，水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞的體積相對(duì)較大，其直徑一般為3.00～12.85 μm，水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞細(xì)胞核均為近圓形，核直徑通常為4.5～7.7 μm，占整個(gè)精原干細(xì)胞總體積的12.5%～70.0%。值得注意的是，不同水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞的分布位置各不相同，主要為雄性的精小葉、精小管、基底膜和精巢管(表1)。

表1 水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞形態(tài)、大小及存在位置比較Tab.1 Morphology, cell diameter and location of spermatogonial stem cells in animals in aquaculture

精原干細(xì)胞起源于動(dòng)物體內(nèi)的A型精原細(xì)胞，按照細(xì)胞形態(tài)的不同，A型精原細(xì)胞可分為未分化的單個(gè)精原細(xì)胞(Asingle，As型)、成對(duì)的精原細(xì)胞(Apaired，Apr型)和成串的精原細(xì)胞(Aaligned，Aal型)3種類(lèi)型[31]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，只有As型精原細(xì)胞才是精原干細(xì)胞，其僅占睪丸生殖細(xì)胞總數(shù)的0.02%～0.03%[31]，但是，最近研究發(fā)現(xiàn)，部分Apr型及Aal型精原細(xì)胞也具有形成克隆及自我更新等一系列干細(xì)胞的潛能[32-33]。

1.2 水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞是從動(dòng)物早期發(fā)育胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離得到的一種未分化的永久性細(xì)胞類(lèi)群[9]。哺乳動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞在形態(tài)上主要表現(xiàn)為細(xì)胞核質(zhì)比高，核仁明顯，排列緊密，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，集落呈鳥(niǎo)巢狀、饅頭狀和島狀等[34]。水產(chǎn)動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞與哺乳動(dòng)物極其相似，其細(xì)胞核占據(jù)細(xì)胞體的大部分，核仁明顯，細(xì)胞聚集呈集落樣生長(zhǎng)[34]。

與原腸期胚胎和原腸期后繼續(xù)發(fā)育的胚胎相比，胚胎干細(xì)胞具有自我復(fù)制和多潛能分化的能力，其一方面保留了自我復(fù)制能力，即在一定的培養(yǎng)條件下，胚胎干細(xì)胞可以穩(wěn)定和不斷地進(jìn)行自我復(fù)制，產(chǎn)生的新一代細(xì)胞可表現(xiàn)出與原代細(xì)胞相同的性狀、功能和基因表達(dá)圖譜[35]；另一方面，胚胎干細(xì)胞在特定條件下可以定向分化為生物體內(nèi)具有特定組織功能的細(xì)胞[36]。此外，相較于成熟精子或已經(jīng)分化的細(xì)胞而言，在相同體外條件下胚胎干細(xì)胞可操作性更強(qiáng)。如Fan等[37]和沙珍霞等[38]利用顯微注射技術(shù)分別將羅非魚(yú)Oreochromisspp.和花鱸Lateolabraxmaculatus的胚胎干細(xì)胞移植到囊胚期胚胎中并成功獲得了嵌合體幼魚(yú)，進(jìn)而證實(shí)了胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛力及其體外的可操作性。

2 干細(xì)胞分離方法及冷凍保存技術(shù)

2.1 水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞分離及冷凍保存技術(shù)

水產(chǎn)動(dòng)物研究領(lǐng)域中相繼在斑馬魚(yú)Daniorerio等模式物種[39]，以及虹鱒Oncorhynchusmykiss和羅非魚(yú)等少數(shù)重要經(jīng)濟(jì)物種[40-42]中開(kāi)展了精原干細(xì)胞研究工作，而關(guān)于這些水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞冷凍保存技術(shù)的研究則主要集中于精原干細(xì)胞的分離、冷凍保存液的配方、冷凍保存過(guò)程與方式等方面。

(1)精原干細(xì)胞的分離。大多數(shù)研究選用處于青春期或性成熟期的雄性水產(chǎn)動(dòng)物為對(duì)象。首先，解剖獲得目標(biāo)對(duì)象的睪丸或者精巢；隨后，快速破碎睪丸或者精巢組織，在破碎好的組織中加入一定量的胰蛋白酶進(jìn)行消化分離，獲得組織細(xì)胞混懸液；最后，根據(jù)不同種類(lèi)細(xì)胞的相對(duì)密度、體積、貼壁速度及表面標(biāo)記等，采用不同方法對(duì)細(xì)胞混懸液進(jìn)行分離以獲得精原干細(xì)胞。目前，用于從組織細(xì)胞混懸液中分離精原干細(xì)胞的方法主要有密度梯度離心法(Density gradient centrifugation method，DGCM)、差速貼壁法(Differential adherence method，DAM)、克隆環(huán)法(Cloning ring method，CRM)、機(jī)械法(Mechanical method，MM)和差異電鍍法(Differential plating，DP)等，其中，密度梯度離心法和差速貼壁法是兩種比較常用的方法。雖然有報(bào)道指出，克隆環(huán)法和機(jī)械法對(duì)吉富羅非魚(yú)Yoshitomitilapia的精原干細(xì)胞也有較好的分離效果[40]，但克隆環(huán)體積相對(duì)較小、操作難度較大，且每次能夠分離的精原干細(xì)胞數(shù)量較少，而機(jī)械法容易刮到其他細(xì)胞群落造成污染，因此，使用這兩種方法分離和純化精原干細(xì)胞的相應(yīng)步驟，仍需進(jìn)一步的優(yōu)化和完善。

(2)冷凍保存基礎(chǔ)液和抗凍劑。冷凍保存液可有效防止細(xì)胞膜免受冷凍降溫過(guò)程中形成的機(jī)械剪切力及胞內(nèi)胞外形成的冰晶損傷，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性[43]。用于配子和胚胎的冷凍保護(hù)液主要由基礎(chǔ)液(稀釋液)和抗凍劑組成，其中，基礎(chǔ)液(稀釋液)是為了提供體外的生存環(huán)境，抑制精子活力，防止精子被激活；抗凍劑的作用主要是保護(hù)細(xì)胞不被溫度速降過(guò)程中由冰晶產(chǎn)生的機(jī)械剪切力所損傷。目前，在冷凍保存哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞基礎(chǔ)液(稀釋液)中通用的組成成分有胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和杜氏伊格爾培養(yǎng)基/F12完全培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium/Ham’s F 12 nutrient medium，DMEM/F12)[44-46]，而水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞冷凍保存液成分較復(fù)雜，除上述哺乳動(dòng)物通用兩種成分之外，還有谷氨酰胺(Glutamine)、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)、海藻糖(Trehalose)和雞蛋黃(Egg yolk)等。不同水產(chǎn)動(dòng)物冷凍保存精原干細(xì)胞所使用的基礎(chǔ)液(稀釋液)組成差異較大，應(yīng)用最多的有胎牛血清[40-41,48]，其次還有DMEM/F12培養(yǎng)基[41,47-48]、海藻糖和雞蛋黃[42,49]，而谷氨酰胺與磷酸鹽緩沖液[47]則使用最少。在抗凍劑的選擇上，二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)是哺乳動(dòng)物與水產(chǎn)動(dòng)物在冷凍保存精原干細(xì)胞中使用最多的抗凍保護(hù)劑。如對(duì)吉富羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)Oreochromisniloticus、星塘鱧Asterropteryxsemipunctata、虹鱒和美洲鰣Alosasapidissima等水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞的冷凍保存上，均使用了終濃度為10%～12%的二甲基亞砜，另外，Lee等[49]用1.3 mol/L的甲醇(Methyl alcohol，MeOH)作為抗凍劑也取得了較好的保護(hù)效果(表2)，除此之外，還有1，2丙二醇(1，2-Propanediol，1，2-Pro)和甘油(Glycerol，Gly)等也常被作為抗凍劑使用，但在物種適用范圍上不如二甲基亞砜廣泛。

表2 水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞冷凍保存液比較Tab.2 Cryopreservation solutions of spermatogonial stem cells from animals in aquaculture

(3)精原干細(xì)胞的冷凍保存過(guò)程與方式。在冷凍過(guò)程中，隨著溫度下降，細(xì)胞內(nèi)外都會(huì)形成冰晶，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生物理傷害。研究發(fā)現(xiàn)，冰晶化只有在溫度為-60～0 ℃條件下緩慢降溫才能生成，降溫越慢，冰晶越大，在-25～-15 ℃時(shí)形成的冰晶最多，對(duì)細(xì)胞危害最大，因此，在冷凍保存過(guò)程中，盡量避開(kāi)這個(gè)有害溫度區(qū)，才能更好地保護(hù)凍存的細(xì)胞[43]。目前，液氮保存是冷凍保存精原干細(xì)胞的主要方式，在將細(xì)胞投入液氮之前，主要有平衡降溫和儀器降溫兩種降溫方法。平衡降溫法是將目標(biāo)細(xì)胞處在不同溫度節(jié)點(diǎn)進(jìn)行平衡，該方法操作簡(jiǎn)單，可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，但缺點(diǎn)是降溫速度控制不精確，該降溫法中主要的溫度節(jié)點(diǎn)有常溫(22～23 ℃)、冰上或4 ℃、-20 ℃及-80 ℃，最后投入液氮保存。但并非所有的水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞在冷凍保存過(guò)程中都選擇了所有的溫度節(jié)點(diǎn)，在首個(gè)溫度節(jié)點(diǎn)的選擇上有較大差異，如吉富羅非魚(yú)[40]與虹鱒[42]選擇在4 ℃、冰上進(jìn)行平衡處理，平衡時(shí)間分別為30、60 min,而尼羅羅非魚(yú)[41]與美洲鰣[48]則選擇-80 ℃作為首次溫度節(jié)點(diǎn)進(jìn)行平衡，平衡時(shí)間分別為12 h、24～48 h。同時(shí)，吉富羅非魚(yú)與虹鱒在后續(xù)的平衡處理中也選擇了-80 ℃進(jìn)行平衡，平衡時(shí)間分別為12 h、90 min，不同的是吉富羅非魚(yú)在-80 ℃平衡之前，還選擇在-20 ℃平衡1 h (表3)。綜上發(fā)現(xiàn)，根據(jù)可查文獻(xiàn)中所有水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的冷凍保存均選擇在-80 ℃下進(jìn)行平衡，但平衡時(shí)間有所差異，大部分選擇平衡12 h過(guò)夜的方式，如吉富羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)，不同的水產(chǎn)動(dòng)物平衡時(shí)間不同，平衡時(shí)間最短的是虹鱒，平衡90 min后投入液氮，平衡時(shí)間最長(zhǎng)的是美洲鰣，經(jīng)24～48 h緩慢降溫至-80 ℃，平衡溫度與平衡時(shí)間的長(zhǎng)短有明顯的種屬差異。儀器降溫法主要是使用程序降溫儀來(lái)完成，該方法操作簡(jiǎn)單、控溫速度精確，但較難應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)。主要步驟：設(shè)定降溫速度、降溫、液氮保存。在星塘鱧Asterropteryxsemipunctata與滿(mǎn)洲鱒精原干細(xì)胞的冷凍保存過(guò)程中，使用降溫儀以-0.5～1、-1 ℃/min的速度降溫至-80 ℃時(shí)分別平衡4～8 h、90 min，最后用液氮冷凍保存。

(4)復(fù)蘇。精原干細(xì)胞冷凍保存一段時(shí)間后進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇的方法較為一致，均使用水浴短時(shí)解凍的方法，水浴時(shí)的溫度多為25～37 ℃(表3)，但虹鱒精原干細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)水浴溫度為10 ℃[42]，可能與虹鱒是冷水性魚(yú)類(lèi)有關(guān)。

表3 水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞冷凍保存過(guò)程及方式比較Tab.3 Cryopreservation processes and methods of spermatogonial stem cells from animals in aquaculture

(5)生產(chǎn)應(yīng)用。目前，在生產(chǎn)實(shí)踐中已經(jīng)初步開(kāi)展了多個(gè)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)品種精原干細(xì)胞冷凍的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，此外，還有研究將解凍復(fù)蘇后的尼羅羅非魚(yú)、滿(mǎn)洲鱒和美洲鰣的精原干細(xì)胞通過(guò)體外移植方式，分別移植到成年羅非魚(yú)、三倍體鱒魚(yú)幼魚(yú)和斑馬魚(yú)仔魚(yú)中，發(fā)現(xiàn)這些冷凍復(fù)蘇后的精原干細(xì)胞均能正常存活并發(fā)育成正常成熟的精子[41,48-49]，這為經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)新種創(chuàng)制提供了新的基礎(chǔ)育種材料，也為保護(hù)未達(dá)到性成熟或難以產(chǎn)生成熟配子的瀕危物種的種質(zhì)資源提供了新的參考和借鑒。

2.2 水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞分離及冷凍保存技術(shù)

近年來(lái)，水產(chǎn)動(dòng)物研究領(lǐng)域已相繼在斑馬魚(yú)等[50]模式物種,以及羅非魚(yú)和花鱸等[37-38]少數(shù)重要經(jīng)濟(jì)物種中開(kāi)展了胚胎干細(xì)胞的研究工作，而對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)研究則主要集中于胚胎干細(xì)胞的分離、冷凍保存液的配方、冷凍保存過(guò)程與方式等方面。

(1)胚胎干細(xì)胞的分離。對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞進(jìn)行分離的方法主要采用早期胚胎培養(yǎng)法，即根據(jù)不同物種確定培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物)，然后將胚胎接種于飼養(yǎng)層上，待胚胎干細(xì)胞充分增殖后，挑取細(xì)胞集落再經(jīng)過(guò)胰酶消化后離散，再接種到新的飼養(yǎng)層，經(jīng)過(guò)幾次傳代篩選后即可得到大量較純的胚胎干細(xì)胞[50-51]。在哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基[15-16,52]中，通用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物有10%～15%胎牛血清、85%～90%高糖杜氏伊格爾培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為4.5 g/L)、0.1 mmol/L巰基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺和堿性成纖維生長(zhǎng)因子等。相較于哺乳動(dòng)物，水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基組成成分更為復(fù)雜，在南亞野鯪Labeorohita[50]和豹紋斑馬魚(yú)Brachydaniofrankei[51]胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中，除哺乳動(dòng)物通用的成分[胎牛血清、高糖杜氏伊格爾培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為4.5 g/L)、巰基乙醇和堿性成纖維生長(zhǎng)因子]之外，還添加了20 mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(4-hydroxyethyl piperazineethylsulfonic acid，Hepes)、100 IU/mL的青霉素、0.1 mg/nL的鏈霉素、1 mmol/L的非必需氨基酸、8 mmol/L的亞硒酸鈉和1 mmol/L的丙酮酸。其中，南亞野鯪胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中還添加了1%的胚胎提取物和10 ng/mL的人白血病抑制因子[50]，豹紋斑馬魚(yú)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了5 ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子和5 ng/mL的亮氨酸抑制因子[51]。

(2)冷凍保存基礎(chǔ)液和抗凍劑。哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞冷凍保存使用的基礎(chǔ)液(稀釋液)多采用胎牛血清和杜氏伊格爾培養(yǎng)基[15-16,52-54]，另有研究采用小牛血清(Calf serum)[54]和一些其他添加劑如谷氨酰胺(Glutamine)[52]等，而在抗凍劑上則多選用二甲基亞砜。目前，關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞冷凍保存的研究相對(duì)較少，僅見(jiàn)南亞野鯪和豹紋斑馬魚(yú)的相關(guān)報(bào)道[50-51]。其中，南亞野鯪胚胎干細(xì)胞冷凍保存中使用的基礎(chǔ)液(稀釋液)與哺乳動(dòng)物略有不同，為高糖杜氏伊格爾培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為4.5 g/L)、胎牛血清及終濃度為0.2 mol/L海藻糖的混合液，而在抗凍劑上則選擇了哺乳動(dòng)物常用的二甲基亞砜。在豹紋斑馬魚(yú)胚胎干細(xì)胞的冷凍保存中，采用了與哺乳動(dòng)物極為相似的基礎(chǔ)液(杜氏伊格爾培養(yǎng)基∶胎牛血清=4∶1)，但是在抗凍劑上則選擇了哺乳動(dòng)物中不常使用的乙二醇(Ethylene glycol，EG)[50](表4)。但就這兩種動(dòng)物胚胎干細(xì)胞冷凍保存中所用基礎(chǔ)液和防凍液與哺乳動(dòng)物之間差異的機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

表4 水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞冷凍保存液比較Tab.4 Cryopreservation solutions for embryonic stem cells from animals in aquaculture

(3)胚胎干細(xì)胞的冷凍保存過(guò)程和方式。哺乳動(dòng)物多使用程序降溫儀進(jìn)行降溫處理[15-16,52,54]，降溫過(guò)程和方式為：設(shè)定-1 ℃/min降溫速度，降溫至-80 ℃后投入液氮中冷凍保存。在水產(chǎn)動(dòng)物中僅見(jiàn)用于南亞野鯪和豹紋斑馬魚(yú)胚胎干細(xì)胞冷凍保存中。南亞野鯪[50]采用了與哺乳動(dòng)物相同的冷凍保存過(guò)程和方式。豹紋斑馬魚(yú)[51]與哺乳動(dòng)物略有差別，豹紋斑馬魚(yú)先在4 ℃平衡10 min后再進(jìn)行程序降溫，降溫速度和溫度節(jié)點(diǎn)與哺乳動(dòng)物相同。

(4)復(fù)蘇。胚胎干細(xì)胞冷凍保存一段時(shí)間后進(jìn)行復(fù)蘇，此方面研究較少，如南亞野鯪和豹紋斑馬魚(yú)胚胎干細(xì)胞冷凍保存一段時(shí)間后，進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇方式與哺乳動(dòng)物方式一致，均為37 ℃水浴短時(shí)快速解凍(表5)。

表5 水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞冷凍保存過(guò)程及方式比較Tab.5 Cryopreservation processes and methods of embryonic stem cells from animals in aquaculture

(5)生產(chǎn)應(yīng)用。目前，在水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞冷凍保存方面僅建立了南亞野鯪和豹紋斑馬魚(yú)的胚胎干細(xì)胞冷凍保存方法并小規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。但是，水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞冷凍體系仍不完善，仍有大量水產(chǎn)動(dòng)物種類(lèi)尚未進(jìn)行研究，水產(chǎn)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞冷凍保存研究仍亟待加強(qiáng)。

3 存在問(wèn)題及展望

3.1 存在問(wèn)題

水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞低溫冷凍保存技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，一方面克服了水產(chǎn)動(dòng)物配子低溫冷凍存在的季節(jié)依賴(lài)性、配子數(shù)量依賴(lài)性和配子成熟度依賴(lài)性等局限，另一方面為保護(hù)瀕危水生物種的種質(zhì)資源和豐富水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物新種創(chuàng)制基礎(chǔ)材料提供了新的思路和線(xiàn)索。然而，與哺乳動(dòng)物(人、牛和馬等)精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞低溫冷凍保存相關(guān)研究相比，水產(chǎn)動(dòng)物相關(guān)研究仍有較大差距，主要可歸因于以下3點(diǎn)：(1)水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的分離和純化方法相對(duì)單一,無(wú)法精細(xì)分離不同時(shí)期的精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，且對(duì)儀器設(shè)備、場(chǎng)地條件和操作人員技術(shù)水平的要求較高，目前僅局限于在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化程度較低；(2)缺乏評(píng)價(jià)水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞質(zhì)量的科學(xué)體系，加之目前水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的冷凍保存程序和步驟仍然比較繁瑣，因此，無(wú)法避免低質(zhì)量精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞引起的冷凍存活率低等問(wèn)題；(3)在冷凍保存液和防凍液配方方面，水產(chǎn)動(dòng)物目前仍主要借鑒哺乳動(dòng)物，但與哺乳動(dòng)物相比，水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞在滲透壓環(huán)境和激活誘導(dǎo)方式等方面均有較大差距，因此，造成水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的冷凍保存效果較差和復(fù)蘇誘導(dǎo)成活率較低。

3.2 展望

未來(lái)水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞低溫冷凍保存研究仍需著重加強(qiáng)以下4個(gè)方面的工作：(1)要著力研發(fā)適用于不同水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞分離和純化的高通量、大體積、自動(dòng)化的分離設(shè)備，制定分離不同細(xì)胞期精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的規(guī)范化方法和操作規(guī)程，不斷提高水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞冷凍保存的規(guī)?；彤a(chǎn)業(yè)化程度。(2)要針對(duì)不同水產(chǎn)動(dòng)物物種，建立有效的精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，同時(shí)，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上不斷完善和優(yōu)化不同水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的冷凍程序。(3)系統(tǒng)掌握不同水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的最適滲透壓環(huán)境和激活誘導(dǎo)方式，進(jìn)一步篩選出適合水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞低溫冷凍保存且針對(duì)性強(qiáng)、效果顯著、經(jīng)濟(jì)節(jié)約的冷凍保存液和防凍液配方。(4)廣泛開(kāi)展各種水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞冷凍保存工作，建立不同水產(chǎn)動(dòng)物精原干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的資源庫(kù)和保存平臺(tái)，為中國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物物種的種質(zhì)保存提供技術(shù)支撐。