周顯鳳，倪賢生

(傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究基地，江西省動(dòng)物源與媒介生物性傳染病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，南昌 330038)

BK多瘤病毒(BK polyomavirus,BKV)是多瘤病毒家族成員之一，人群感染率高達(dá)90%，因能導(dǎo)致腎移植受者病毒性腎病而備受關(guān)注[1]。BKV原發(fā)感染時(shí)會(huì)出現(xiàn)“流感樣”癥狀，感染后通常潛伏于人泌尿系統(tǒng)上皮細(xì)胞中，腎臟移植后免疫抑制劑使用是導(dǎo)致BKV活化的重要因素，血液中持續(xù)的高病毒載量會(huì)引起腎移植組織損傷從而導(dǎo)致病毒性腎病(BKV-associated nephropathy,BKVAN)[2]。腎移植受者中約有近10%的患者發(fā)展為BKVAN，深入了解BKV的生物學(xué)特征及其與宿主的關(guān)系對(duì)預(yù)防疾病的發(fā)生和控制疾病進(jìn)程至關(guān)重要。近幾年，有關(guān)BKV microRNA(miRNA)在病毒感染與宿主免疫的研究不斷增多，提示BKV miRNA在疾病診治、預(yù)防和控制中起關(guān)鍵作用。

1 BKV生物學(xué)特征及流行病學(xué)

BKV是1971年從腎小管狹窄的腎移植患者中分離到的第一個(gè)人多瘤病毒，病毒命名來(lái)源于患者名字的首字母“BK”[3]。BKV是乳頭狀多瘤空泡病毒科、多瘤病毒家族的一種亞型[4]。BKV是雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其基因組大約5 kb，按功能分為3個(gè)區(qū)域：早期表達(dá)區(qū)域(大T、小T抗原)、非編碼控制區(qū)(non-coding control region,NCCR)以及晚期表達(dá)區(qū)域(病毒衣殼蛋白VP1-VP3編碼區(qū))，晚期表達(dá)區(qū)域含有一個(gè)miRNA轉(zhuǎn)錄子，其與早期轉(zhuǎn)錄T抗原mRNA的3′端互補(bǔ)(封四圖1A)，被認(rèn)為參與調(diào)控病毒早期基因表達(dá)和復(fù)制；成熟的3p和5p miRNA來(lái)源關(guān)于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體miRNA(pre-miRNA)(封四圖1B)[5-7]。

自BKV發(fā)現(xiàn)以來(lái)，至今一共有13種人多瘤病毒被發(fā)現(xiàn)并命名[4]。BKV原發(fā)感染多在10歲以前，傳播機(jī)制仍不清楚，可能經(jīng)有呼吸道或者口腔傳播[8]。據(jù)血清流行病學(xué)調(diào)查顯示兒童在5歲以前的BKV血清陽(yáng)性率高達(dá)50%，成人中的感染率高達(dá)90%以上[9]。對(duì)于免疫功能健全的人群，絕大部分終身都不會(huì)出現(xiàn)明顯的BKV感染癥狀或體征，但病毒可以一直潛伏在泌尿系統(tǒng)上皮細(xì)胞中。當(dāng)機(jī)體免疫力低下，如HIV感染或器官移植后，潛伏在尿路上皮和腎小管上皮中的BKV被激活，開(kāi)始高水平的病毒復(fù)制，大量復(fù)制的病毒顆粒從尿路中排泄，造成BKV尿癥(viruria)[10-12]。在腎移植受者中，隨著病程的進(jìn)展，BKV會(huì)進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核進(jìn)行大量復(fù)制產(chǎn)生子代病毒，引起細(xì)胞壞死使組織發(fā)生免疫性、炎癥性侵潤(rùn)；當(dāng)腎小管上皮細(xì)胞脫落和基底膜暴露時(shí)，病毒開(kāi)始破壞腎小管毛細(xì)血管進(jìn)入血液，導(dǎo)致病毒血癥(viremia)，約有20%的腎移植受者會(huì)出現(xiàn)viremia。當(dāng)BKV在血液中持續(xù)高病毒載量表達(dá)，將進(jìn)一步破壞移植腎組織導(dǎo)致腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化，最終形成病毒性腎病(BKVAN)——BKV造成的最典型的疾病特征[13-15]。此外，出血性膀胱炎(HC)是造血干細(xì)胞移植(HSCT)受體中公認(rèn)的BKV相關(guān)并發(fā)癥。越來(lái)越多的研究[16-17]證據(jù)表明，BKV編碼的miRNA參與調(diào)控病毒早期轉(zhuǎn)錄、病毒復(fù)制以及病毒免疫逃逸從而導(dǎo)致病毒活化和疾病惡化。

2 BKV編碼的miRNA

miRNA是一類(lèi)單鏈、非編碼的RNA分子，長(zhǎng)度一般為20～23個(gè)核苷酸。miRNA不編碼蛋白，而是通過(guò)與mRNA的3’端非編碼區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，降解或抑制mRNA的翻譯來(lái)抑制基因的表達(dá)，從而參與細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。目前，編碼miRNA的病毒主要是皰疹病毒科的病毒如EB病毒、卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)、人巨細(xì)胞病毒(MCV)和1型單純皰疹病毒(HSV-1)以及多瘤病毒科[18-21]。2005年SULLVIAN等[22]通過(guò)基因組掃描和前體miRNA預(yù)測(cè)得出與多瘤病毒SV40早期轉(zhuǎn)錄有關(guān)的段片段RNA為病毒編碼的miRNA，隨后miRNA相繼在包括BKV的其他多瘤病毒中報(bào)道[23]。目前已經(jīng)確定的多瘤病毒編碼的miRNA及相關(guān)功能[5-7,24-25]總結(jié)如下，見(jiàn)表1。

表1 多瘤病毒miRNA及主要功能

2.1 BKV miRNA參與調(diào)控病毒復(fù)制

雖然多瘤病毒miRNA主要參與下調(diào)早期轉(zhuǎn)錄子翻譯等功能，但這些miRNA功能的具體機(jī)制尚不清楚。迄今為止，科研人員在不斷探索這些未知的機(jī)制機(jī)理。SULLIVAN 等[22]研究發(fā)現(xiàn)SV40編碼miRNA既能調(diào)節(jié)病毒早期基因表達(dá)，也參與宿主免疫逃逸。SEO等[23]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究顯示BKV和JCV編碼miRNA抑制病毒早期基因表達(dá)從而影響病毒的復(fù)制水平。BROEKEMA等[26-27]還發(fā)現(xiàn)BKV編碼的miRNA與病毒潛伏機(jī)制有關(guān)，他們認(rèn)為高水平表達(dá)的miRNA通過(guò)與早期T抗原mRNA 3’端互補(bǔ)控制病毒的復(fù)制。TIAN等[28]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BKV microRNA通過(guò)抑制T抗原介導(dǎo)的自調(diào)控降低病毒的復(fù)制水平。

BKV基因組根據(jù)NCCR區(qū)的基因結(jié)構(gòu)可分為原型(Archetype)和重排型(Rearranged)，原型因在健康人群和病毒致病人群中均被發(fā)現(xiàn)而被認(rèn)為是病毒的傳播型，重排型往往在病毒治病的人群中檢測(cè)到而被定性為致病型或者活化型。原型BKV NCCR結(jié)構(gòu)可以分為O,P,Q,R,S共5個(gè)序列模塊(圖1A)，重排型則是這些序列模塊的部分重復(fù)或者缺失[29-30]。BROEKEMA等[5]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明miRNA主要負(fù)責(zé)控制原型BKV的病毒復(fù)制，使其長(zhǎng)期保持潛伏感染狀態(tài)(封四圖2)。BROEKEMA等[5]還推斷miRNA表達(dá)受NCCR區(qū)相關(guān)啟動(dòng)子的影響，并認(rèn)為除NCCR區(qū)啟動(dòng)子以外可能在晚期DNA鏈中還隱藏著能啟動(dòng)miRNA表達(dá)的啟動(dòng)子。目前，未見(jiàn)其他有關(guān)病毒潛伏機(jī)制的報(bào)道，關(guān)于miRNA與病毒潛伏機(jī)制的關(guān)系仍然需要更多的實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)。

2.2 BKV miRNA參與病毒免疫逃逸

病毒miRNA除參與病毒復(fù)制調(diào)控意外，還與病毒逃逸宿主免疫有關(guān)。以往關(guān)于皰疹病毒的研究[31-32]表明，由3種不同的皰疹病毒(EBV、KSHV和HCMV)編碼的3種不同的病毒miRNA可以選擇性地靶向應(yīng)激誘導(dǎo)配體MICB，而不是其他應(yīng)激誘導(dǎo)配體，如ULBPs或MICA。MICB被NK細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞表達(dá)的強(qiáng)大殺傷受體NKG2D所識(shí)別。因此，病毒miRNA對(duì)MICB的下調(diào)導(dǎo)致感染細(xì)胞從NKG2D介導(dǎo)的免疫識(shí)別和消除中逃逸[33-35]。由于人類(lèi)多瘤病毒和皰疹病毒與人類(lèi)宿主共存，它們均可以在免疫抑制條件下引起嚴(yán)重疾病。再者，因?yàn)锽KV和JCV編碼miRNAs，所以研究人員推測(cè)BKV和JCV miRNA也可以靶向NKG2D配體，以逃避NKG2D介導(dǎo)的病毒清除。BAUMAN等[7]發(fā)現(xiàn)BKV 3p miRNA特異性下調(diào)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)配體ULBP3的表達(dá)導(dǎo)致降低NKG2D受體依賴(lài)的NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷性；反之，病毒miRNA收到抑制會(huì)恢復(fù)配體ULBP3的表達(dá)，從而促進(jìn)NK細(xì)胞毒作用。因此，開(kāi)發(fā)miRNA靶向藥物用于精準(zhǔn)治療病毒性腎病及相關(guān)多瘤病毒疾病具有廣闊的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。

2.3 臨床樣本BKV miRNA檢測(cè)對(duì)疾病進(jìn)展的診斷價(jià)值

當(dāng)前沒(méi)有針對(duì)BKVAN的特效治療藥物，減少移植后免疫抑制劑的使用是控制病毒活化和疾病進(jìn)程的主要手段[12]。既然miRNA參與調(diào)控病毒宿主免疫，且于病毒活化相關(guān)聯(lián)，那么定量檢測(cè)臨床樣本BKV miRNA含量是否有助于了解病毒活化狀態(tài)及疾病進(jìn)程是值得探討的議題。HUANG等[36]對(duì)腎移植患者移植手術(shù)后不同時(shí)期的血液和尿液開(kāi)展了BKV miRNA的定量檢測(cè)，同時(shí)還分析了血、尿BKV miRNA與病毒基因組和VP1 mRNA的定量關(guān)系。其結(jié)果提示BKV優(yōu)選3p miRNA參與宿主細(xì)胞mRNA調(diào)控，并認(rèn)為BKV miRNA介導(dǎo)NKG2D配體ULBP3下調(diào)的免疫逃逸影響遠(yuǎn)大于其抑制病毒復(fù)制的作用，提示miRNA表達(dá)水平可與病程進(jìn)展相關(guān)。因此，血、尿以及其他臨床標(biāo)本病毒miRNA的定量檢測(cè)對(duì)輔助疾病診斷具有重要的價(jià)值[16,37]。無(wú)論如何，miRNA的檢測(cè)需要靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法，同時(shí)臨床樣本的保存條件也是影響miRNA檢測(cè)精度和真實(shí)度的重要因素。因此，對(duì)于腎移植受者來(lái)講，除了目前最新的臨床診療規(guī)范(2019版)推薦的尿液“誘餌細(xì)胞”(decoy cells)顯微鏡檢、血尿病毒載量監(jiān)測(cè)以及活組織檢查外，同時(shí)開(kāi)展病毒miRNA監(jiān)測(cè)用于輔助診斷具有實(shí)質(zhì)的臨床價(jià)值，同時(shí)利用接受者操作特性(ROC)曲線評(píng)估各指標(biāo)的診斷靈敏度，為提出更合理且可操作的臨床和實(shí)驗(yàn)診斷標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)。

3 小結(jié)

近年來(lái)，隨著實(shí)體器官移植手術(shù)的廣泛開(kāi)展，新型強(qiáng)效免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用以及檢測(cè)手段的革新，BKV 致病率不斷升高。腎移植術(shù)后BKV 致病率升高尤為突出，由其導(dǎo)致的BKVAN已成為移植腎失功的重要原因之一。

BKVAN 的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，容易與移植物排斥反應(yīng)或其他疾病相混淆，尤其是急性排斥反應(yīng)，后者治療需要增加免疫抑制強(qiáng)度以降低機(jī)體免疫導(dǎo)致的排斥反應(yīng)，而B(niǎo)KVAN的預(yù)防治療恰恰相反，必須降低免疫抑制強(qiáng)度，以期部分恢復(fù)機(jī)體抗病毒免疫能力。所以，正確診斷并及時(shí)干預(yù)有助于改善移植受者的預(yù)后。血、尿BKV病毒載量監(jiān)測(cè)是作為BKVAN風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的主要指標(biāo)，當(dāng)血BKV DNA載量>1.0×104copies·mL-1時(shí)，病變發(fā)展為BKVAN的風(fēng)險(xiǎn)極高，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高達(dá)80%以上[12]。因?yàn)锽KV miRNA表達(dá)發(fā)生在病毒復(fù)制前，且反映了病毒基因表達(dá)情況，可以作為病毒活躍復(fù)制的指征。其次，BKV miRNA序列非常保守，開(kāi)發(fā)miRNA診斷方法可以有效覆蓋所有基因型BKV。

盡管BKV miRNA參與病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制及宿主免疫逃逸的相關(guān)研究關(guān)注度不斷提升，但目前的研究結(jié)論仍無(wú)法明確其調(diào)控機(jī)制。miRNA靶向序列眾多，BKV miRNA除靶向病毒本身早期T抗原mRNA和ULBP3外，是否還參與調(diào)控其他的細(xì)胞mRNAs是值得深入探索的方向?？傊?，深入研究BKV microRNA參與宿主和病毒之間的相互作用將對(duì)病毒性腎病早期診斷、治療和預(yù)防提供新的思路。