《中國(guó)防癆雜志》編輯委員會(huì)

中國(guó)醫(yī)療保健國(guó)際交流促進(jìn)會(huì)結(jié)核病防治分會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)和臨床專業(yè)學(xué)術(shù)部

結(jié)核病(TB)是嚴(yán)重威脅人類健康的呼吸道傳染病。TB發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸取決于入侵結(jié)核分枝桿菌(MTB)的數(shù)量、毒力及機(jī)體免疫抵抗力[1]。因此，對(duì)TB患者免疫狀況的評(píng)估和了解其臨床免疫學(xué)特征是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析患者外周血淋巴細(xì)胞亞群是目前臨床評(píng)估免疫功能的方法之一，有助于了解患者當(dāng)前的免疫狀態(tài)、免疫功能和免疫平衡，為臨床制定免疫干預(yù)措施、觀察療效及判斷預(yù)后等方面提供實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)依據(jù)。該項(xiàng)目在免疫性疾病、血液病、腫瘤和艾滋病等臨床應(yīng)用廣泛[2-5]，但在TB臨床的應(yīng)用較有限，認(rèn)識(shí)不足[6-7]。淋巴細(xì)胞亞群分析涉及多個(gè)指標(biāo)，各指標(biāo)之間關(guān)系復(fù)雜，如何正確解讀、客觀分析、科學(xué)判斷結(jié)果，指導(dǎo)TB臨床診斷和治療，對(duì)于TB防控具有現(xiàn)實(shí)意義。為此，《中國(guó)防癆雜志》編輯委員會(huì)、中國(guó)醫(yī)療保健國(guó)際交流促進(jìn)會(huì)結(jié)核病防治分會(huì)基礎(chǔ)和臨床專業(yè)學(xué)術(shù)部組織專家共同擬定《結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)及臨床應(yīng)用專家共識(shí)》，提出可供臨床借鑒的具體建議。

臨床常用的淋巴細(xì)胞亞群分析項(xiàng)目

目前，臨床常規(guī)分析的人類外周血淋巴細(xì)胞亞群根據(jù)其細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)獨(dú)特的分化抗原(cluster of differentiation，CD)的表達(dá)可分為：T淋巴細(xì)胞(CD3+)、B淋巴細(xì)胞(CD19+)和自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞(CD3-CD16+CD56+)。正常情況下，T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的65%以上，主要由αβT細(xì)胞(按T細(xì)胞受體分類)構(gòu)成(占T細(xì)胞總數(shù)的90%～95%)，是人類最重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其包括輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(CD3+CD4+CD8-，也稱CD4+T細(xì)胞)、細(xì)胞毒/抑制性T細(xì)胞(CD3+CD8+CD4-，也稱CD8+T細(xì)胞)、雙陽(yáng)性T細(xì)胞(CD3+CD4+CD8+，簡(jiǎn)稱DPT細(xì)胞)、雙陰性T細(xì)胞(CD3+CD4-CD8-，簡(jiǎn)稱DNT細(xì)胞)和NK樣T細(xì)胞(CD3+CD16+CD56+，簡(jiǎn)稱NKT細(xì)胞)等亞群。目前，通過(guò)FCM可分析各淋巴細(xì)胞亞群的相對(duì)計(jì)數(shù)(百分比)和絕對(duì)計(jì)數(shù)。

一、檢測(cè)原理

應(yīng)用各種熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體分別結(jié)合待檢測(cè)血液標(biāo)本中各類淋巴細(xì)胞膜表面或胞內(nèi)獨(dú)特的CD，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀將染色后的血液細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用一定壓力將待檢測(cè)樣品壓入流式細(xì)胞儀流動(dòng)室，待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過(guò)流式照射室檢測(cè)區(qū)域。激光照射到細(xì)胞上發(fā)生散射和折射，即產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光兩種信號(hào)，熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞表面的抗原量。通過(guò)流式細(xì)胞儀識(shí)別和分辨這些熒光，實(shí)現(xiàn)對(duì)各類淋巴細(xì)胞分化抗原的定量檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)不同標(biāo)記的細(xì)胞亞群的熒光強(qiáng)度，可判斷目的細(xì)胞群在總淋巴細(xì)胞群中的百分比。而應(yīng)用細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)管進(jìn)一步分析血細(xì)胞樣本，根據(jù)管中準(zhǔn)確定量的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參熒光微球數(shù)，可對(duì)淋巴細(xì)胞各個(gè)亞群進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)。

二、檢測(cè)方法

參考原中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2011年12月14日發(fā)布的中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS/T 360—2011 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》[8]進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析、相對(duì)計(jì)數(shù)和絕對(duì)計(jì)數(shù)。

1.淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)計(jì)數(shù)法：在普通上樣管中加入熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體，然后加入抗凝血樣本，渦旋混勻，室溫避光放置15 min；加入溶血素，渦旋混勻，室溫避光放置10 min；離心棄掉上清液；加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌，渦旋混勻，離心棄上清；加入PBS，混勻，上機(jī)檢測(cè)。在操作系統(tǒng)中輸入基本信息，設(shè)置模板圈門，分別圈出總淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞(CD3+)、輔助性T細(xì)胞(CD3+CD4+)、殺傷抑制性T細(xì)胞(CD3+CD8+)、NKT細(xì)胞(CD3+CD16+CD56+)、NK細(xì)胞(CD3-CD16+CD56+)、B細(xì)胞(CD3-CD19+)，獲取淋巴細(xì)胞門下至少5000個(gè)細(xì)胞，在軟件中即可獲得各個(gè)亞群占總淋巴細(xì)胞群的相對(duì)百分比。

2.淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)法：在絕對(duì)計(jì)數(shù)管中加入熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體，然后于管中反向加入50 μl抗凝血樣本，渦旋混勻，室溫避光放置15 min；加入450 μl溶血素，渦旋混勻，避光放置10 min 后，再次混勻后上機(jī)檢測(cè)；在上述相對(duì)計(jì)數(shù)法設(shè)置的模板下增加熒光微球門，在淋巴細(xì)胞門下獲取至少5000個(gè)細(xì)胞，在軟件中獲得各個(gè)亞群占總淋巴細(xì)胞群相對(duì)百分比的同時(shí)，獲得各亞群細(xì)胞獲取數(shù)與熒光微球獲取數(shù)。依據(jù)絕對(duì)計(jì)數(shù)管中準(zhǔn)確定量的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參熒光微球總數(shù)，通過(guò)如下公式計(jì)算各細(xì)胞亞群絕對(duì)值：亞群細(xì)胞數(shù)/μl=(亞群細(xì)胞獲取數(shù)×熒光微球總數(shù))/(熒光微球獲取數(shù)×樣本量)。

三、檢測(cè)報(bào)告內(nèi)容

應(yīng)用FCM常規(guī)分析下列淋巴細(xì)胞亞群：T細(xì)胞(CD3+、CD4+、CD8+、DPT、 DNT和NKT)、NK細(xì)胞和B細(xì)胞后，建議報(bào)告各個(gè)細(xì)胞亞群細(xì)胞的相對(duì)計(jì)數(shù)(百分比)和絕對(duì)計(jì)數(shù)。常見的檢測(cè)報(bào)告內(nèi)容見圖1。

四、檢測(cè)注意事項(xiàng)

1.流式檢測(cè)儀器及抗體試劑的質(zhì)量保證：保證流式檢測(cè)儀器的正常運(yùn)行，以及淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑質(zhì)量可靠是臨床獲得客觀、穩(wěn)定的檢測(cè)數(shù)據(jù)的前提條件。因此，建議所使用的流式細(xì)胞儀和淋巴細(xì)胞亞群試劑盒均需獲得臨床醫(yī)療注冊(cè)證書。

2.標(biāo)本采集[8]：FCM檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群采用外周血標(biāo)本，建議抗凝劑首選乙二胺四乙酸鹽(EDTA-K2/EDTA-K3)，該抗凝標(biāo)本在室溫下保存12～24 h，不超過(guò)30 h，以免粒細(xì)胞減少；也可選擇肝素鈉或檸檬酸鈉抗凝，該標(biāo)本可在室溫下保存48 h。標(biāo)本中極少的凝血塊均會(huì)造成結(jié)果的差異，因此檢測(cè)前應(yīng)該仔細(xì)觀察標(biāo)本是否有凝血。

3.審核內(nèi)容：建議檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)審核人員應(yīng)對(duì)檢驗(yàn)過(guò)程中的關(guān)鍵步驟進(jìn)行審核，如模板的設(shè)置、采集的細(xì)胞數(shù)和熒光微粒數(shù)、散射光模式、所有的設(shè)門等。

相對(duì)計(jì)數(shù)︵百分比︶{絕對(duì)計(jì)數(shù){編號(hào) 檢測(cè)項(xiàng)目單位參考范圍1總T淋巴細(xì)胞百分比%50～842輔助性/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞百分比%27～513細(xì)胞毒/抑制性T淋巴細(xì)胞百分比%15～444CD4+/CD8+0.71～2.785雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞百分比%0～4.06雙陰性T淋巴細(xì)胞百分比%2.0～7.07NK樣T淋巴細(xì)胞百分比%2～138總B淋巴細(xì)胞百分比%5～189NK細(xì)胞百分比%7～4010總T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)個(gè)/μl955～286011輔助性/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)個(gè)/μl550～144012細(xì)胞毒/抑制性T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)個(gè)/μl320～125013NK樣T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)個(gè)/μl40～30014總B淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)個(gè)/μl90～56015NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)個(gè)/μl150～1100圖1 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)報(bào)告內(nèi)容

4.報(bào)告結(jié)果的參考值范圍：臨床檢驗(yàn)結(jié)果的參考值范圍是臨床醫(yī)生合理地解釋結(jié)果、判斷患者免疫狀況正常與否的重要標(biāo)準(zhǔn)。臨床實(shí)驗(yàn)室為臨床醫(yī)生提供的參考值范圍應(yīng)正確適用，以免誤診或漏診，導(dǎo)致錯(cuò)誤的治療。目前，國(guó)內(nèi)FCM淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的參考值范圍來(lái)源以試劑及儀器廠家說(shuō)明書居多，少數(shù)實(shí)驗(yàn)室自己確定，也有根據(jù)其他實(shí)驗(yàn)室所提供的參考值范圍。然而參考值范圍尤其是絕對(duì)計(jì)數(shù)的參考值范圍受性別、年齡、種族、營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境差異的人群，以及儀器類型及試劑來(lái)源的不同而存在差異[9-13]。因此，建議各實(shí)驗(yàn)室需針對(duì)不同型號(hào)的儀器和不同廠家的試劑科學(xué)合理地建立區(qū)域人群淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的參考值范圍及評(píng)價(jià)體系，男性和女性、成人和兒童應(yīng)分別建立參考值范圍[14-15]，每年還應(yīng)采用20名健康人血液標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證和調(diào)整。

淋巴細(xì)胞亞群分析在TB患者臨床診療中的應(yīng)用

TB的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫功能失衡有關(guān)，機(jī)體免疫系統(tǒng)在TB的發(fā)病、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸方面扮演重要的角色，直接影響患者預(yù)后。淋巴細(xì)胞通過(guò)多種功能效應(yīng)在感染性疾病中起著抵抗侵入病原菌的重要作用，淋巴細(xì)胞亞群的改變會(huì)影響肺部疾病的發(fā)生和發(fā)展。檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群水平對(duì)了解TB患者機(jī)體免疫功能、判斷病情嚴(yán)重程度及評(píng)估預(yù)后等方面都有重要意義。因此，對(duì)淋巴細(xì)胞亞群分析在TB患者臨床診療中的應(yīng)用提出以下意見和建議。

一、評(píng)估TB患者的免疫狀況

下列TB患者有必要進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析，以輔助臨床客觀評(píng)價(jià)患者免疫狀況，合理制定治療方案，適時(shí)進(jìn)行免疫干預(yù)，調(diào)節(jié)患者的免疫功能，促進(jìn)患者早日康復(fù)。

1.老年TB患者：我國(guó)第五次流行病學(xué)抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者中老年人(>60歲)所占比率高達(dá)48.8%[16]。50%左右的老年肺結(jié)核患者各淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)均低于健康人，尤其是CD3+、CD4+、CD8+、NKT和B淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯低于中青年患者[14,17]；而反映固有免疫的NK細(xì)胞與年齡無(wú)明顯相關(guān)性，說(shuō)明老年肺結(jié)核患者由于適應(yīng)性免疫功能降低[18]，因而通常癥狀不典型、耐藥率高、化療后痰菌涂片陰轉(zhuǎn)率低、不良反應(yīng)多、治療效果差、病程長(zhǎng)[19]。因此，建議在老年TB患者中進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析以了解其免疫狀況，更好地應(yīng)對(duì)和控制TB。

2. 活動(dòng)性TB患者：1/3～1/2的活動(dòng)性TB患者外周血中各淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)均低于健康人，病情越嚴(yán)重，下降越明顯，如耐多藥或病變范圍廣泛的TB患者各淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)均明顯降低[20-26]。復(fù)治肺結(jié)核患者各淋巴細(xì)胞亞群降低的發(fā)生率和降低的程度均高于初治肺結(jié)核患者[27]。因此，建議病情嚴(yán)重的活動(dòng)性TB患者進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析，以判斷是否需進(jìn)行免疫干預(yù)。

3. 糖尿病并發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核患者：糖尿病患者并發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核的發(fā)病率增高，其代謝紊亂及免疫損傷等發(fā)病機(jī)制促進(jìn)了肺結(jié)核的發(fā)病和發(fā)展。反之，TB也加重了糖尿病患者的代謝紊亂，近10%的初治肺結(jié)核患者并發(fā)糖尿病。糖尿病與活動(dòng)性肺結(jié)核之間由于血糖水平、機(jī)體免疫力等因素相互作用，構(gòu)成了互為因果的惡性循環(huán)。糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)降低的發(fā)生率明顯高于未并發(fā)糖尿病的肺結(jié)核患者；其中CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)降低的程度也明顯高于未并發(fā)糖尿病的肺結(jié)核患者[28]。糖尿病并發(fā)TB患者的NKT細(xì)胞百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯高于沒有糖尿病的TB患者[29]。因此，建議糖尿病并發(fā)活動(dòng)性TB患者進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析。

4. HIV與MTB雙重感染者：HIV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞明顯下降，并發(fā)MTB感染可提高HIV病毒的侵襲和復(fù)制能力，并提高CD4+T淋巴細(xì)胞對(duì)HIV的易感性，加速HIV感染的疾病進(jìn)程[30]。HIV與MTB雙重感染者艾滋病發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)高，TB已成為艾滋病高流行地區(qū)的最重要的單一死因。有效的抗結(jié)核治療可使HIV感染與艾滋病并發(fā)肺結(jié)核患者的淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)恢復(fù)正常，提高其細(xì)胞免疫功能，并可使TB得到良好的控制，從而改善預(yù)后，提高生存質(zhì)量、延長(zhǎng)壽命[31]。因此，建議HIV與MTB雙重感染者進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析，以了解患者的免疫狀況和監(jiān)測(cè)治療效果。

5. 其他：并發(fā)腫瘤、貧血、低蛋白血癥等重癥TB患者各淋巴細(xì)胞亞群降低的發(fā)生率和降低的程度均明顯高于未并發(fā)的肺結(jié)核患者[32-33]。因此，建議并發(fā)腫瘤、貧血、低蛋白血癥等重癥TB患者也進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析，以便適時(shí)干預(yù)和提高治療效果。

二、監(jiān)測(cè)肺結(jié)核患者的治療效果

臨床上TB尤其是MDR-TB、重癥TB患者均可能出現(xiàn)各淋巴細(xì)胞亞群的百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)和功能的改變。TB患者接受有效化療后，其淋巴細(xì)胞亞群百分比尤其是絕對(duì)計(jì)數(shù)若改善或恢復(fù)正常，一般療效較好、康復(fù)快、預(yù)后好[34-35]；其淋巴細(xì)胞亞群百分比尤其是絕對(duì)計(jì)數(shù)若沒有改善，一般療效較差，病程長(zhǎng)、預(yù)后差，且有反復(fù)發(fā)作的可能[34]。因此，建議上述活動(dòng)性TB患者治療前、后進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析，以作為制定免疫治療方案的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和監(jiān)測(cè)療效的指標(biāo)。

三、TB患者進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的指征

鑒于以上觀點(diǎn)，建議活動(dòng)性TB患者在治療前后進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的指征為：(1)老年活動(dòng)性TB患者；(2)復(fù)治、久治不愈的TB患者；(3)病變范圍廣泛的、病情嚴(yán)重的TB患者；(4)并發(fā)反復(fù)感染、嚴(yán)重感染，尤其并發(fā)HIV感染的TB患者；(5)并發(fā)糖尿病的活動(dòng)性TB患者；(6)并發(fā)腫瘤、貧血、低蛋白血癥的活動(dòng)性TB患者；(7)有免疫缺陷病家族史、長(zhǎng)期使用免疫抑制劑的活動(dòng)性TB患者。

TB患者淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的判讀及其臨床意義

機(jī)體的免疫狀況決定了MTB感染后TB的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，T淋巴細(xì)胞亞群與細(xì)胞免疫功能有關(guān)，B淋巴細(xì)胞與體液免疫功能有關(guān)，NK細(xì)胞與非特異性自然殺傷活性有關(guān)[36-38]。在現(xiàn)有科學(xué)證據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)應(yīng)用FCM檢測(cè)TB患者淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果的判讀及其臨床意義提出以下意見和建議。

1. 總T淋巴細(xì)胞(CD3+)：T淋巴細(xì)胞參與機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答，外周血CD3+百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)值低于參考范圍，說(shuō)明T淋巴細(xì)胞數(shù)可能減少，提示可能存在免疫功能低下?；顒?dòng)性TB患者CD3+T細(xì)胞的百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)值可能沒有明顯變化，也可能降低，而且病情越嚴(yán)重，下降越明顯[20,24,39]；如低蛋白血癥、貧血、并發(fā)糖尿病、耐多藥或病變廣泛的TB患者，其外周血CD3+T細(xì)胞數(shù)明顯降低[21,28,40]；≥60歲TB患者的CD3+T細(xì)胞百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)可能明顯低于<60歲的患者[19,41]。CD3+T細(xì)胞的百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)值明顯下降，說(shuō)明患者出現(xiàn)明顯的免疫抑制。

2. 輔助性/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+CD8-)：CD4+T淋巴細(xì)胞在TB病程各個(gè)階段均發(fā)揮主要的抗結(jié)核作用[42]。CD4+T淋巴細(xì)胞主要輔助其他細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答效應(yīng)或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。目前CD4+T細(xì)胞根據(jù)誘導(dǎo)因子和分泌因子的不同，主要分為輔助性T細(xì)胞(helper T cells, Th)1、Th2、Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (regulatory T cells, Treg)等4類。Th1細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素(IL)-2、γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能激活巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞殺傷細(xì)菌的功能，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)；Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子主要激活體液免疫系統(tǒng)，也引起超敏反應(yīng)炎癥[43]?；顒?dòng)性TB患者CD4+T細(xì)胞百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)可能低于健康人，病情越嚴(yán)重，下降越明顯，如低蛋白血癥、貧血、并發(fā)糖尿病、耐多藥或病變廣泛的TB患者CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯降低[21-24,28,32,39-40,44]；此外，≥60歲TB患者的CD4+T細(xì)胞百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)可能明顯低于<60歲的患者[41]。CD4+T細(xì)胞百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯下降，表明CD4+T細(xì)胞功能缺失，將削弱機(jī)體抗MTB的保護(hù)性防御機(jī)制，是TB患者免疫狀態(tài)惡化的一種表現(xiàn)形式。潛伏性結(jié)核感染者若出現(xiàn)外周血CD4+T細(xì)胞耗竭，就易導(dǎo)致MTB再活化[45]。

3. 細(xì)胞毒/抑制性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+CD4-)：CD8+T淋巴細(xì)胞主要執(zhí)行細(xì)胞免疫功能，是排斥同種異體移植物、殺傷細(xì)菌、病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞。其可以特異性地識(shí)別內(nèi)源性抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC) Ⅰ類分子復(fù)合物，進(jìn)而殺傷靶細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)寄生病原體的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)。殺傷機(jī)制主要有兩種：一是分泌穿孔素、顆粒酶、顆粒溶素及淋巴毒素等物質(zhì)直接殺傷靶細(xì)胞；二是通過(guò)Fas/FasL途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[46]?；顒?dòng)性TB患者CD8+T細(xì)胞百分比可能沒有明顯變化，或明顯增高，這是由于CD4+T細(xì)胞百分比明顯降低所致[21-22,39]?；顒?dòng)性TB患者CD8+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)可能低于或高于健康人，也可能無(wú)明顯變化，與患者病情相關(guān)；CD8+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)無(wú)論是增高還是降低均預(yù)示可能預(yù)后不良，需進(jìn)行免疫干預(yù)。病情越嚴(yán)重(如老年、低蛋白血癥、貧血、并發(fā)糖尿病或病變廣泛的TB患者)，下降越明顯[20,25,28]。CD8+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯下降，表明機(jī)體調(diào)動(dòng)CD8+T細(xì)胞直接殺滅胞內(nèi)外MTB而導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞大量消耗，是TB患者免疫狀態(tài)惡化的一種表現(xiàn)形式[46]。若發(fā)病早期不及時(shí)對(duì)患者進(jìn)行治療和免疫干預(yù)，可能導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)不斷下降，從而導(dǎo)致病情加重或呈慢性感染。CD8+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)增高可能是患者M(jìn)TB負(fù)荷高所致，可能預(yù)示患者對(duì)化療反應(yīng)遲緩[47]。

4. CD4+/CD8+比值：顯示輔助性/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞與細(xì)胞毒/抑制性T淋巴細(xì)胞之間功能平衡狀態(tài)，是評(píng)價(jià)人體免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)。CD4+/CD8+比值升高提示免疫功能亢進(jìn)，見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病等。CD4+/CD8+比值減低提示免疫抑制，艾滋病患者的CD4+/CD8+比值多在0.5以下?；顒?dòng)性TB患者CD4+/CD8+比值可能正常、減少或增高，取決于患者CD4+、CD8+T細(xì)胞下降的程度[21,39]。若CD4+/CD8+比值低于健康人，表明CD4+T細(xì)胞較CD8+T細(xì)胞下降明顯[48]；病情嚴(yán)重的患者CD4+/CD8+比值可能高于病情較輕的患者，可能是因?yàn)镃D8+T細(xì)胞較CD4+T細(xì)胞下降明顯所致[49]。

5. 雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞(DPT細(xì)胞，CD3+CD4+CD8+)：正常人外周血中DPT細(xì)胞極少，但是在重癥肌無(wú)力、原發(fā)性免疫性血小板減少癥、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病中表達(dá)增高。肺結(jié)核患者外周血DPT細(xì)胞具有抗結(jié)核免疫力，活動(dòng)性TB患者DPT細(xì)胞百分比可能正常、增高或減少[50]，其絕對(duì)計(jì)數(shù)可能明顯降低，提示抗結(jié)核免疫力下降，其變化的臨床意義尚需進(jìn)一步探討。

6. 雙陰性T淋巴細(xì)胞(DNT細(xì)胞，CD3+CD4-CD8-)：DNT細(xì)胞具有免疫抑制功能并能誘導(dǎo)耐受，抑制具有相同T細(xì)胞受體的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的功能，以預(yù)防體內(nèi)過(guò)度亢進(jìn)的細(xì)胞免疫應(yīng)答所造成的免疫損傷。外周血DNT升高主要見于臨床炎癥性疾病，包括感染性和非感染性疾病，如：肺部細(xì)菌性感染、全身性病毒感染、胸膜炎、創(chuàng)傷、急性扁桃體炎等疾?。淮送?，青少年患者的增高幅度較其他年齡段的患者高。DNT細(xì)胞是急性感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷等患者體內(nèi)免疫功能狀態(tài)和病情監(jiān)測(cè)的一個(gè)新指標(biāo)。活動(dòng)性TB患者DNT細(xì)胞百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)可能減少，病情越嚴(yán)重，下降越明顯，可能是因?yàn)闄C(jī)體通過(guò)DNT數(shù)量下降使機(jī)體免疫抑制功能降低，以提高M(jìn)TB清除能力[50]；≥60歲TB患者的DNT細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)可能明顯低于<60歲的患者[51]。

7. NKT細(xì)胞(CD3+CD56+CD16+)：NKT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中的一個(gè)比較特殊的亞群，兼具T細(xì)胞和NK細(xì)胞的某些特性，是一類在固有免疫和適應(yīng)性免疫之間起橋梁作用的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，活化后能迅速分泌一些具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子并且具有潛在的細(xì)胞毒效應(yīng)；參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)、維持免疫穩(wěn)定，參與體液免疫應(yīng)答或細(xì)胞免疫應(yīng)答，能防止自身免疫性疾病的發(fā)生，并在抗感染、抗結(jié)核和抗腫瘤免疫及防止器官移植排斥中發(fā)揮重要作用[52-53]。原發(fā)性肺結(jié)核NKT細(xì)胞數(shù)一般無(wú)明顯變化[26]，其他類型的活動(dòng)性TB尤其是血行播散性肺結(jié)核患者NKT細(xì)胞百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯增高[22-23,26,54-55]，糖尿病并發(fā)TB患者的NKT細(xì)胞百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯高于沒有糖尿病的TB患者[29]，這可能是由于體內(nèi)MTB含量高、分布廣泛，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生NKT細(xì)胞抗結(jié)核。但隨著病情加重NKT細(xì)胞會(huì)逐漸減少。

8. NK細(xì)胞(CD3-CD56+CD16+)：NK細(xì)胞是固有免疫的關(guān)鍵組成部分，但也發(fā)揮適應(yīng)性免疫作用，其主要功能為殺死各種腫瘤細(xì)胞和某些感染細(xì)菌、病毒的細(xì)胞，所以在抗腫瘤和抗感染防御疾病中起主要作用；它還可以分泌IFN-γ等細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答調(diào)控[56]。原發(fā)性肺結(jié)核NK細(xì)胞百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)一般無(wú)明顯變化[26,47]，其他類型的活動(dòng)性TB患者NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)可能明顯減少，其自然殺傷功能也可能明顯降低[22]；而且病情越嚴(yán)重，下降越明顯；復(fù)治肺結(jié)核患者的NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯低于初治肺結(jié)核患者；血行播散性肺結(jié)核及肺外結(jié)核患者NK細(xì)胞百分比或絕對(duì)計(jì)數(shù)降低的發(fā)生率和降低程度均明顯高于單純肺結(jié)核患者[26]。

9. B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)：B淋巴細(xì)胞活化后轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，分泌抗體，主要執(zhí)行體液免疫功能，在抗結(jié)核感染中發(fā)揮主要作用。B細(xì)胞也參與結(jié)核肉芽腫形成，B細(xì)胞功能缺陷的宿主更易受到MTB感染、TB易感性增加[57]?；顒?dòng)性TB患者病情嚴(yán)重時(shí)(如并發(fā)糖尿病、貧血、低蛋白血癥或病變廣泛的患者)B淋巴細(xì)胞百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)均明顯下降，而且隨著患者年齡增長(zhǎng)而逐漸降低，尤其是60歲以上的患者下降明顯[22,49,58]。

對(duì)TB患者淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)與分析的建議和展望

1. 合理選擇淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)與分析的方法：相對(duì)計(jì)數(shù)法是分析各亞群細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞數(shù)的百分比，結(jié)果易受各類細(xì)胞亞群變化的影響；而絕對(duì)計(jì)數(shù)法可了解各類細(xì)胞亞群的獨(dú)立變化，一種淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)的變化不會(huì)影響其他細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)的變化，但可能影響淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)計(jì)數(shù)的變化，因此，只分析各淋巴細(xì)胞亞群的百分比不能客觀、準(zhǔn)確地反映TB患者的免疫功能狀況，建議同時(shí)檢測(cè)與分析淋巴細(xì)胞亞群的相對(duì)計(jì)數(shù)和絕對(duì)計(jì)數(shù)。

2.TB患者進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的建議：原則上免疫功能受損者均應(yīng)常規(guī)評(píng)估淋巴細(xì)胞亞群，但目前TB患者的免疫功能評(píng)價(jià)在臨床上并未獲得廣泛重視；因此，建議活動(dòng)性TB患者尤其是存在下列情況的患者應(yīng)進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析：(1)并發(fā)反復(fù)感染、嚴(yán)重感染及多種病原體與特殊病原體感染者，尤其是并發(fā)HIV感染的患者[31]；(2)常規(guī)抗結(jié)核治療效果不佳的患者，除了考慮耐藥等原因外還應(yīng)考慮是否存在宿主免疫功能受損；(3)并發(fā)嚴(yán)重的過(guò)敏性疾病或自身免疫性疾病的患者，可能存在免疫自穩(wěn)和耐受功能受損[59]；(4)并發(fā)血液系統(tǒng)腫瘤或者其他腫瘤及實(shí)體瘤患者，可能存在免疫監(jiān)視功能受損[33]；(5)其他特殊情況，即TB患者血常規(guī)中淋巴細(xì)胞明顯異常、家族成員中有免疫缺陷病史、長(zhǎng)期使用免疫抑制劑者，以及TB并發(fā)糖尿病、低蛋白血癥及貧血的患者[28,32,60]。

3. 建立新的基于多色FCM檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群的方法：目前臨床檢測(cè)分析淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)目和分類有限，對(duì)淋巴細(xì)胞亞群功能的評(píng)價(jià)不足，尚缺乏將T細(xì)胞亞群表型和功能聯(lián)合分析的工具，而不能完全滿足臨床需求；需研發(fā)新的針對(duì)TB患者臨床免疫學(xué)特征的淋巴細(xì)胞亞群的分析指標(biāo)和方法，以指導(dǎo)臨床診療。

隨著FCM在TB患者檢測(cè)中的不斷研究和應(yīng)用，相信這項(xiàng)技術(shù)能夠?yàn)門B臨床診斷和治療提供更多有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)依據(jù)。

參與討論與撰寫本共識(shí)的主要單位和專家(排名不分先后)：100091 北京，解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心 全軍結(jié)核病研究所(吳雪瓊、白雪娟、梁建琴、張俊仙)；200433 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病中心(肖和平、范琳)；101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院(初乃惠、張宗德、黃海榮、逄宇)；100035 北京，《中國(guó)防癆雜志》期刊社(薛愛華、李敬文、范永德)； 102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心(趙雁林)；100710 北京，中國(guó)防癆協(xié)會(huì)秘書處(成詩(shī)明)； 100035 北京市結(jié)核病控制研究所實(shí)驗(yàn)室(王甦民、丁北川)；510095 廣州市胸科醫(yī)院(譚守勇、譚耀駒)； 400036 重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心(嚴(yán)曉峰、李同心)； 710061 西安市結(jié)核病胸部腫瘤醫(yī)院(黨麗云、崔小莉)； 215007 蘇州市第五人民醫(yī)院(吳妹英、胥萍、張建平)； 410013 長(zhǎng)沙，湖南省胸科醫(yī)院 湖南省結(jié)核病防治所檢驗(yàn)科(譚云洪)； 110044 沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合病房(梁秋)； 518112 深圳市第三人民醫(yī)院結(jié)核科(鄧國(guó)防、鄧群益)；610061成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心(吳桂輝)