劉培，王立銘，劉瑩,2*，來魯華,2,3**

（1.北京大學化學與分子工程學院 分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國家重點實驗室 北京分子科學國家研究中心，北京 100871；2. 北京大學定量生物學中心，北京 100871；3. 北京大學-清華生命科學聯(lián)合中心，北京 100871）

別構(gòu)（又稱“變構(gòu)”）調(diào)控（allosteric regulation）是指效應分子結(jié)合在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上不同于底物位點的別構(gòu)位點（allosteric site），通過多種信號傳導途徑而導致蛋白質(zhì)活性改變的過程[1]。作為一種細胞內(nèi)有效的調(diào)控蛋白質(zhì)功能的方式，別構(gòu)調(diào)控在很多的生物過程中發(fā)揮著重要作用，包括酶催化[2]、信號傳導[3]、轉(zhuǎn)錄調(diào)控[4]、代謝調(diào)控[5]、協(xié)同進化[6]等。自50多年前提出別構(gòu)效應以來，除了別構(gòu)調(diào)控的詳細機制尚未研究清楚，別構(gòu)概念、實驗和理論研究[7-8]都有很大進展。

別構(gòu)調(diào)控在蛋白質(zhì)中廣泛存在，因此針對別構(gòu)位點進行藥物設計為控制蛋白質(zhì)活性提供了另外一條途徑。藥物根據(jù)其作用機制可以分為正構(gòu)藥物（orthosteric drug）和別構(gòu)藥物（allosteric drug）。正構(gòu)藥物結(jié)合在蛋白質(zhì)的活性位點，占據(jù)底物或輔基的結(jié)合位點，通過阻礙底物或者輔基與蛋白質(zhì)的結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)的活性；別構(gòu)藥物則通過結(jié)合在非活性位點來改變或者阻斷催化或者底物的結(jié)合來發(fā)揮作用。目前除了在美國上市的18種別構(gòu)調(diào)控劑，大部分已上市藥物為正構(gòu)藥物。相對于正構(gòu)藥物，別構(gòu)藥物有著如下優(yōu)勢：1）選擇性高。正構(gòu)位點藥物，由于其同家族蛋白活性位點的保守性，存在選擇性的問題；別構(gòu)藥物則由于結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)保守性低，因而副作用更小。2）別構(gòu)藥物和底物可以同時發(fā)揮作用，其調(diào)控功能具有上限性，毒性小。3）別構(gòu)位點提供了新的結(jié)合位點。從功能上講，別構(gòu)藥物既可以下調(diào)蛋白的活性成為抑制劑，也可以上調(diào)蛋白活性成為激活劑。目前已有多種針對不同靶標的別構(gòu)調(diào)控分子被發(fā)現(xiàn)，包括G蛋白偶聯(lián)受體、離子通道、酶以及其他的靶標，然而大部分別構(gòu)調(diào)控分子還是通過高通量實驗篩選獲得[9]，別構(gòu)調(diào)控分子的理性設計和發(fā)現(xiàn)仍頗具挑戰(zhàn)性。

近年來有關(guān)別構(gòu)調(diào)控分子的理性設計和發(fā)現(xiàn)取得了令人鼓舞的成果，詳見近期綜述[1,7,10-12]。筆者實驗室對于別構(gòu)調(diào)控的研究源于對于人類花生四烯酸（AA）代謝網(wǎng)絡調(diào)控的研究，為了有效控制炎性分子的產(chǎn)生，需要上調(diào)網(wǎng)絡中的一些靶標，而酶的激活只能通過別構(gòu)調(diào)控來實現(xiàn)[13-14]，筆者實驗室發(fā)展了別構(gòu)位點預測方法和別構(gòu)調(diào)控分子的理性設計方法，并在一些重要靶標上獲得了上調(diào)的別構(gòu)分子。本文將主要介紹別構(gòu)位點的預測與確認，以及別構(gòu)調(diào)控分子的發(fā)現(xiàn)實例。

1 基于理論計算的別構(gòu)位點發(fā)現(xiàn)

理性設計別構(gòu)調(diào)控分子，首先需要尋找靶標的別構(gòu)位點（見圖1）。雖然原則上所有的蛋白質(zhì)都是別構(gòu)的[15]，但是被實驗確認的別構(gòu)位點數(shù)量有限，目前最大的別構(gòu)蛋白數(shù)據(jù)庫（allosteric database，ASD）也只收錄了1 949個蛋白質(zhì)[10]。近十幾年來，很多研究者也一直在關(guān)注如何發(fā)現(xiàn)潛在的別構(gòu)口袋。發(fā)現(xiàn)別構(gòu)口袋的方法可以分為實驗（包括高通量篩選、點突變、核磁馳豫擴散實驗和氘氫交換質(zhì)譜等）和理論計算兩大類[7,16]。單純開展實驗工作的研究，一方面工作量很大，另一方面實驗發(fā)現(xiàn)具有偶然性；而理論計算方法在降低成本的同時可以大幅提高別構(gòu)位點發(fā)現(xiàn)的成功率，有利于別構(gòu)抑制劑的機制的探究，因此，需要發(fā)展基于理論計算的別構(gòu)位點預測方法。

圖 1 理性設計別構(gòu)調(diào)控分子的流程Figure 1 Workflow of rational design of allosteric modulators

當已知蛋白質(zhì)活性和非活性2種狀態(tài)的結(jié)構(gòu)時，可以根據(jù)這2種結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變情況進行別構(gòu)位點預測。Qi等[17]和Ma等[18]發(fā)展了利用粗粒化二態(tài)Gō模型預測蛋白質(zhì)別構(gòu)口袋的方法。首先用二態(tài)Gō產(chǎn)生蛋白質(zhì)活性構(gòu)象和非活性構(gòu)象的平衡系綜，然后在探測到的蛋白質(zhì)表面可成藥結(jié)合位點（非活性位點）內(nèi)，用微擾的方法改變殘基之間的相互作用模擬小分子的結(jié)合過程。若微擾的施加導致蛋白質(zhì)構(gòu)象系綜發(fā)生變化，那么此微擾施加的位點便可能是一個潛在的別構(gòu)位點。利用這種方法，結(jié)合筆者實驗室發(fā)展的口袋探測程序CAVITY[19-20]，成功發(fā)現(xiàn)了大腸埃希菌中D-3-磷酸甘油酸脫氫酶（E.coli D-3-phosphoglycerate dehydrogenase，PGDH）的新的別構(gòu)位點，并在此基礎上經(jīng)計算虛擬篩選和實驗獲得了別構(gòu)抑制劑[17,21]。這種預測蛋白質(zhì)別構(gòu)口袋的方法需要已知所研究蛋白質(zhì)的2種構(gòu)象及活性有差別的狀態(tài)，故其應用范圍有局限性。

大多數(shù)情況下并不知道所研究的蛋白質(zhì)是否會被別構(gòu)調(diào)控，更沒有調(diào)控后的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可用。針對這種情況，Ma等[22]假設蛋白質(zhì)正構(gòu)位點和別構(gòu)位點運動上的強相關(guān)性是一種普遍存在的現(xiàn)象，可用于別構(gòu)位點預測，并采用粗?；母咚咕W(wǎng)絡模型對這種相關(guān)性進行了研究。他們在測試23個聚集狀態(tài)為單體的別構(gòu)蛋白質(zhì)的24個已知別構(gòu)口袋后發(fā)現(xiàn)，其中23個已知別構(gòu)口袋與其對應的正構(gòu)口袋在運動上顯示了強相關(guān)性。隨后他們又分析了幾種多聚體別構(gòu)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其正構(gòu)口袋與別構(gòu)口袋也有很強的相關(guān)性。并且這種結(jié)果不依賴于蛋白質(zhì)的初始結(jié)構(gòu)，具有魯棒性?；谶@些結(jié)果開發(fā)了一種在已知一種蛋白質(zhì)構(gòu)象的情況下，可以快速預測蛋白質(zhì)別構(gòu)口袋的理論計算方法和程序CorrSite。

為方便用戶使用，以上的程序CAVITY和CorrSite已集成在CavityPlus上[23]。CavityPlus是一個Web在線計算平臺，使用蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息作為輸入，提供蛋白質(zhì)口袋檢測和各種功能分析。該平臺應用CAVITY來檢測給定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面上的潛在結(jié)合位點，并根據(jù)配體性和可成藥性評分對其進行排名?？梢允褂?個子模塊CavPharmer[24]、CorrSite[22]和CovCys[25]進一步分析這些潛在的結(jié)合位點：CavPharmer使用基于受體的藥效團建模程序Pocket以自動提取口袋內(nèi)的藥效團特征；CorrSite可以識別潛在的別構(gòu)配體結(jié)合位點；CovCys則能自動檢測可藥用的半胱氨酸殘基，可在設計共價別構(gòu)分子時用于尋找合適的共價結(jié)合位點。

其他研究團隊也通過不同計算策略開發(fā)出多種類型的別構(gòu)位點預測方法[26-31]。在這些預測方法中，筆者實驗室開發(fā)的CorrSite表現(xiàn)出其優(yōu)越性：與基于二態(tài)Gō模型預測別構(gòu)口袋的方法相比[17]，CorrSite只需蛋白質(zhì)任意一種活性狀態(tài)的結(jié)構(gòu)即可，使用范圍更廣；與利用分子動力學（molecular dynamics，MD） 模擬來預測別構(gòu)口袋的方法相比[26-27]，CorrSite耗時很短，使用方便；與僅基于結(jié)構(gòu)的方法相比[28]，CorrSite考慮到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中各個部分的相互作用；與同樣使用正則模式分析（normal mode analysis，NMA）來鑒定蛋白質(zhì)別構(gòu)位點的PARS（Protein Allosteric and Regulatory Sites）方法相比[29]，CorrSite的算法更為簡單，正確率也更高[22]。不過，受限于當時可用的蛋白數(shù)量以及計算量，CorrSite存在一定的局限性，這也是進行別構(gòu)位點預測研究遇到的共性的問題。隨著已知別構(gòu)蛋白質(zhì)復合物結(jié)構(gòu)數(shù)量的增加，CorrSite可以在更大的數(shù)據(jù)集上進行驗證和優(yōu)化。

目前，基于蛋白質(zhì)動力學的別構(gòu)位點研究受到很多關(guān)注，例如結(jié)合口袋特征及NMA分析進行蛋白質(zhì)別構(gòu)位點預測的方法AllositePro表現(xiàn)出較好的預測效果[32]；Yu 等[30]研究了計算原子運動相關(guān)性時的角度問題；Zhang等[31]在2019年發(fā)表的一篇綜述中提出蛋白質(zhì)在進化過程中利用蛋白質(zhì)內(nèi)在動力學來調(diào)控別構(gòu)與正構(gòu)功能。基于蛋白質(zhì)動力學相關(guān)性的別構(gòu)位點預測方法，在多個體系的別構(gòu)調(diào)控分子設計中得到了成功應用。

2 別構(gòu)調(diào)控分子的理性設計實例

在找到靶標的別構(gòu)位點之后，通過計算與實驗驗證相結(jié)合的方法有望發(fā)現(xiàn)別構(gòu)調(diào)控分子。下面介紹筆者實驗室近年的研究進展。

2.1 別構(gòu)激活劑的發(fā)現(xiàn)

與抑制劑的發(fā)現(xiàn)相比，蛋白質(zhì)激活劑的發(fā)現(xiàn)更加困難，難點一在于很難通過計算預測別構(gòu)分子與靶蛋白結(jié)合后起上調(diào)或下調(diào)的作用；難點二在于激活劑往往使得蛋白質(zhì)處于能量較高、更加動態(tài)的活性構(gòu)象，因此不能穩(wěn)定在單一構(gòu)象的狀態(tài)，這使得激活劑與靶蛋白的復合物晶體結(jié)構(gòu)解析更為困難。目前，發(fā)現(xiàn)激活劑的主要途徑依舊是高通量篩選，也有一些理性設計激活劑的例子被報道，如SIRT6激活劑的發(fā)現(xiàn)[33]等，尚無普遍適用的開發(fā)激活劑的方法。

2.1.1 磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶激活劑 磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase 4，GPx4），是一個含有硒的谷胱甘肽過氧化物酶。GPx4與細胞膜修復、炎癥及鐵死亡抑制等諸多生物調(diào)控過程相關(guān)[34]。上調(diào)GPx4的活性對于炎癥[13,35]以及鐵死亡相關(guān)的疾病治療[36]有益。因此，開發(fā)GPx4激活劑對于相關(guān)的疾病治療具有重要意義。

Li等[37]使用CorrSite[22]和CAVITY[20]在GPx4的三維結(jié)構(gòu)上成功發(fā)現(xiàn)了一個新的別構(gòu)位點（見圖2A）。預測的別構(gòu)位點Cavity打分最高且CorrSite得分為1.5（CorrSite方法中通常將CorrSite得分大于 0.5的口袋預測為潛在的別構(gòu)位點）。該別構(gòu)位點處于底物位點的背面，由3個酸性殘基（Asp21、Asp23和 Asp101）、2個 堿 性 殘 基（Lys31和Lys90）和7個非極性殘基（Ile22、Ala93、Ala94、Val98、Phe100、Met102和 Phe103） 包 圍。 通 過對SPECS化合物庫進行計算虛擬篩選挑選后購買的251個化合物進行酶活測試，最終得到激活劑分子PKUMDL-LC-001（1）?；衔?以劑量依賴性方式將人源GPx4 的U46C突變體（human GPx4 U46C mutant，hGPx4-C）的酶活性提高到原始酶活性的263%，其與hGPx4-C的平衡解離常數(shù)（KD）為（63±5）mol · L-1。對該化合物進行結(jié)構(gòu)修飾后，得到活性提高的化合物1d4（2，見圖2B），其達到150%激活所需的濃度為20 mol · L-1。突變實驗中，將別構(gòu)口袋中的關(guān)鍵氨基酸Asp21和Asp23突變后測試發(fā)現(xiàn)，化合物1和2對 2個單突變（D21A和D23A）和1個雙突變（D21A/D23A）激活活性降低，證實化合物1和2結(jié)合在所預測的別構(gòu)位點上（見圖2C）；敲除GPx4后，化合物1和2對于細胞提取物的激活效果消失，證明其在細胞中的特異性。化合物1對于鐵死亡的抑制、對于AA代謝網(wǎng)絡中炎癥前脂質(zhì)中間體的抑制以及對于核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路的抑制均進一步證實其作用于GPx4。

圖 2 磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶別構(gòu)激活劑的理性設計[37]Figure 2 Rational design of glutathione peroxidase 4 activators[37]

2.1.2 15-脂氧合酶激活劑 人網(wǎng)狀細胞15-脂氧合酶（15-lipoxygenase，15-LOX）是相對分子質(zhì)量為75 000的脂肪酸雙加氧酶，其產(chǎn)物15-羥基二十碳四烯酸（15-HETE）可以進一步轉(zhuǎn)換為具有抗炎活性和消炎能力的脂蛋白（lipoxins，LXs）[38]。上調(diào)15-LOX可以促進抗炎因子生成且同時減少促炎因子[13]，是潛在的治療炎癥相關(guān)疾病的靶點。另外，15-LOX與癌癥[39]和鐵死亡[40]密切相關(guān)。因此，針對15-LOX設計的激活劑，既能夠作為分子探針工具研究其功能也能夠開發(fā)為治療相關(guān)疾病的藥物。

Meng等[41]應用MutInf方法[27]尋找與15-LOX底物結(jié)合位點二面角運動相關(guān)性高的殘基，并結(jié)合CAVITY[20]判斷這些殘基是否適于形成可成藥口袋，成功地在15-LOX底物口袋附近找到一個新的別構(gòu)位點cavity 1。隨后，筆者實驗室使用CorrSite[22]對15-LOX所有的潛在別構(gòu)口袋進行了預測，cavity 1的CorrSite得分為1.1，排名第三。與MutInf方法相比，CorrSite方法耗時少且使用方便。

筆者實驗室通過對cavity 1使用SPECS化合物庫進行計算虛擬篩選和實驗研究，得到1個激活劑和11個抑制劑分子，其中激活劑分子PKUMDL_MH_1001（3）的半數(shù)激活常數(shù)（AC50）為（6.8± 0.4） mol · L-1，KD為（3.9±0.1）mol · L-1。虛擬篩選后對化合物進行活性測試，獲得了另外2個激活劑分子。將激活劑與抑制劑化合物的結(jié)構(gòu)進行比對后發(fā)現(xiàn)，激活劑分子中均包含可以與帶負電殘基形成強氫鍵的正電性基團。隨后，筆者實驗室對15-LOX的別構(gòu)激活及抑制機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)激活劑與Asp277形成氫鍵后可以穩(wěn)定15-LOX活性構(gòu)象，減少底物自抑制的作用；而抑制劑傾向于使活性位點口袋的“開合運動”受到阻礙[42]。突變實驗表明化合物3對于15-LOX的突變體R242A和D277A的激活活性大幅下降，驗證了化合物3結(jié)合在所預測的別構(gòu)位點（見圖3）。此外，在人的中性粒細胞、人全血和小鼠腹膜炎模型中，化合物3不僅增加了15-LOX的產(chǎn)物15-HETE水平，還減少了促炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。更有意義的是，化合物3與5-LOX或COX抑制劑的聯(lián)合使用可平衡AA代謝網(wǎng)絡中的不同途徑，這為阻斷炎癥的新策略提供了依據(jù)。

圖 3 15-脂氧合酶激活劑的發(fā)現(xiàn)[41]Figure 3 Discovery of 15-lipoxygenase activator [41]

2.2 別構(gòu)抑制劑的發(fā)現(xiàn)

2.2.1D-3-磷酸甘油酸脫氫酶別構(gòu)抑制劑D-3-磷酸甘油酸脫氫酶（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）催化生物體內(nèi)合成絲氨酸的第一步反應，是絲氨酸合成的決速步驟。PHGDH在癌癥的發(fā)展中起著重要作用；PHGDH的基因敲除或使用PHGDH的小分子抑制劑都會大幅抑制對PHGDH敏感的細胞在體內(nèi)或體外的生長，對PHGDH不敏感的細胞系受到的影響則較小[43]。靶向PHGDH的抑制劑有著廣泛的應用前景。由于PHGDH的底物口袋小，輔基NAD+在細胞中的濃度達到毫摩爾級，正構(gòu)位點的抑制劑面臨選擇性差而無體內(nèi)活性的問題。因此，針對PHGDH設計別構(gòu)抑制劑是一種有效的策略。

考慮到PHGDH的全長結(jié)構(gòu)尚未解出，Wang等[44]利用現(xiàn)有的僅包含2個結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（Pdb code：2g76）使用CAVITY[20]程序進行了別構(gòu)口袋的預測，并獲得了2個別構(gòu)口袋（位點Ⅰ和位點Ⅱ，見圖4）。位點Ⅰ靠近活性位點和NAD+/NADH輔因子結(jié)合位點，位點Ⅱ靠近底物結(jié)合域。隨后，筆者實驗室對SPECS化合物庫進行了計算虛擬篩選，得到1個結(jié)合在位點Ⅰ的化合物PKUMDLWQ-2101（4）和3個結(jié)合在位點Ⅱ的化合物：PKUMDL-WQ-2201（5）、PKUMDL-WQ-2202、PKUMDL-WQ-2203。其中活性最好的化合物4和5對 PHGDH 的 IC50為（34.8±3.6） 和（35.7±8.6 ）mol · L-1，二者與 PHGDH的KD分別為（0.56±0.10）和（66.9±1.9） mol · L-1。突變實驗中，化合物4對于突變位置在別構(gòu)位點Ⅰ的PHGDH突變體R134A和K57AT59A，化合物5對于對于突變位置在別構(gòu)位點Ⅱ的PHGDH突變體T59A和T56AK57A的抑制活性均大幅降低，驗證了化合物4和5分別結(jié)合在別構(gòu)位點Ⅰ和位點Ⅱ。在細胞實驗中，化合物4和5對PHGDH敏感性細胞系MDA-MB-468的EC50分別為 7.7 和 6.9 mol · L-1，同時對 PHGDH 不敏感性細胞系呈現(xiàn)出很好的選擇性，表明在細胞中化合物4和5靶向作用于PHGDH。研究發(fā)現(xiàn)，這2個化合物在PHGDH敲除后的細胞中均無特異性活性；二者還減少了絲氨酸合成通路及其下游通路的代謝產(chǎn)物的量，與PHGDH基因敲除的影響類似。此外，二者在動物實驗中也展現(xiàn)出了對于腫瘤組織的抑制效果。

2.2.2 保羅樣激酶1的非ATP競爭型抑制劑 保羅樣激酶1（Polo-like kinase 1，PLK1）是哺乳動物細胞中參與多步有絲分裂的賴氨酸/蘇氨酸激酶，其結(jié)構(gòu)包括識別底物的調(diào)控結(jié)構(gòu)域（Polo-box domain，PBD）和催化底物的激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD）。研究表明人源PLK1在多種惡性腫瘤中過表達[45]，抑制PLK1可以抑制癌細胞的生長[46-47]，因此，PLK1被認為是一個潛在的抗腫瘤靶標。已有的PLK1抑制劑主要作用于KD的ATP結(jié)合口袋，是ATP競爭型抑制劑。該類抑制劑活性高但選擇性低，作為藥物使用產(chǎn)生的不良反應較多，而非ATP競爭型抑制劑能夠提高選擇性以及延緩突變[48]。

Yun 等[48]使用CAVITY[20]對PLK1晶體結(jié)構(gòu)進行了可成藥性口袋分析計算，在ATP結(jié)合位點的附近發(fā)現(xiàn)了全新的別構(gòu)口袋（見圖5A）。通過對別構(gòu)口袋中的位點Ⅱ進行虛擬篩選并進行PLK1體外酶活性測試，發(fā)現(xiàn)了多個活性化合物。其中活性最好的化合物6對全長PLK1酶活的IC50為（13.1± 1.7）mol · L-1，與 ATP沒有競爭性結(jié)合（見圖5B）。

圖 4 D-3-磷酸甘油酸脫氫酶別構(gòu)抑制劑研究[44]Figure 4 Study on D-3-phosphoglycerate dehydrogenase allosteric inhibitors[44]

圖 5 保羅樣激酶1別構(gòu)抑制劑研究[48]Figure 5 Study on Polo-like kinase 1 allosteric inhibitors [48]

3 結(jié)論和展望

筆者實驗室開發(fā)了預測別構(gòu)位點的方法，預測了GPx4、15-LOX、PHGDH和PLK1中的別構(gòu)位點，并分別針對這些位點成功發(fā)現(xiàn)了別構(gòu)調(diào)控分子。

在過去的幾十年里，基于結(jié)構(gòu)的藥物設計大大加速了藥物發(fā)現(xiàn)的進程。別構(gòu)藥物相對于正構(gòu)藥物所具有的高選擇性和抗耐藥性受到很多關(guān)注。越來越多的別構(gòu)藥物正被發(fā)現(xiàn)，別構(gòu)藥物涉及的靶標也從最初的G蛋白偶聯(lián)受體和激酶擴展到現(xiàn)在的14種蛋白類別[10]，也有不少別構(gòu)調(diào)控分子被發(fā)現(xiàn)。盡管有這些成功的例子，但是基于結(jié)構(gòu)的別構(gòu)藥物設計依然具有很大的挑戰(zhàn)性。主要在于以下3個方面：

1）別構(gòu)位點的預測。其一，目前有很多方法和軟件用于別構(gòu)位點預測，但因已知的適合用來訓練和測試的別構(gòu)蛋白的樣本數(shù)量及計算量有限，這些預測方法本身的精度及適用性存在差異，還需要其他更多的研究來證明其有效性。其二，選擇什么樣的構(gòu)象開始進行預測是研究人員在進行別構(gòu)藥物設計時遇到的首要問題。最近，張健研究組發(fā)現(xiàn)，當?shù)鞍踪|(zhì)中正構(gòu)和變構(gòu)位點之間的距離小于5 ?時，選擇結(jié)合底物的蛋白構(gòu)象作為基于結(jié)構(gòu)的變構(gòu)藥物篩選的初始輸入，有助于發(fā)現(xiàn)變構(gòu)藥物[49]。本文介紹的例子中，2個例子（PHGDH和PLK1）使用結(jié)合底物的蛋白構(gòu)象作為初始輸入，而預測得到的別構(gòu)位點都在活性位點附近，支持了此結(jié)論。其三，在別構(gòu)藥物設計中，有些別構(gòu)口袋在apo（不結(jié)合別構(gòu)藥物的構(gòu)象）狀態(tài)時不存在（hidden allosteric site），這種情況下可能需要進行大規(guī)模分子動力學模擬，結(jié)合馬爾科夫狀態(tài)模型（Markov state model）以獲得潛在的別構(gòu)位點[8]。

2）別構(gòu)藥物的優(yōu)化（hit-to-lead optimization）。首先，別構(gòu)藥物的活性往往低于正構(gòu)藥物。由于別構(gòu)藥物的活性與其親和力并無直接關(guān)系，用傳統(tǒng)的方法對別構(gòu)藥物優(yōu)化時，雖然可以提升藥物分子的親和力，但并不一定提升活性，因此產(chǎn)生“flat SAR”或者“l(fā)imited SAR”的現(xiàn)象。其次，別構(gòu)調(diào)控分子細微的差別即可能導致發(fā)揮的功能不同，理解別構(gòu)分子的機制對于別構(gòu)藥物優(yōu)化非常重要。 例如，筆者實驗室的Bi等[50]在大腸埃希菌趨化研究中發(fā)現(xiàn)的化學效應分子（chemo effectors）類似物CHDCA和cis-PDA，二者分別是大腸埃希菌Tar受體的拮抗劑（antagonist）和引誘-劑（attractant），其結(jié)構(gòu)差別只是后者多了一個N H基團，通過與Tar受體的相互作用比較發(fā)現(xiàn)，引誘劑都是在合適的位置（靠近Tyr149和Gln152）有1個氫鍵供體基團作為信號的觸發(fā)基團。因此，別構(gòu)調(diào)控分子發(fā)揮的作用可以分為兩部分：一部分用于與受體結(jié)合；另一部分起到信號觸發(fā)（trigger）的作用。類似的情況也在15-LOX激活劑的介紹部分提到過，即當結(jié)合在別構(gòu)位點的分子沒有帶正電時成為抑制劑，而當帶正電時就成為激活劑。綜上，別構(gòu)分子的優(yōu)化復雜且富有挑戰(zhàn)性。

3）相對于正構(gòu)位點，別構(gòu)位點的成藥性往往更差，別構(gòu)位點計算虛擬篩選的成功率也遠低于正構(gòu)位點，從而限制了別構(gòu)藥物的多樣性。

別構(gòu)藥物的發(fā)展面臨著種種挑戰(zhàn)，但是其在一些新的方向越來越受到關(guān)注。比如，開發(fā)別構(gòu)共價藥物，可以保留別構(gòu)藥物的優(yōu)勢，同時也可以增加藥物-靶標配體的半衰期從而降低毒性[51]。筆者實驗室所開發(fā)的CovCys程序可以探測蛋白質(zhì)中能夠形成共價的半胱氨酸[25]，該程序也已集成在CavityPlus中供直接使用[23]。另外，在開發(fā)別構(gòu)藥物對于蛋白-蛋白相互作用界面的調(diào)控[52]，不可成藥靶標的調(diào)控[53]，通過別構(gòu)研究老藥新用[54-55]以及理解中草藥在治療復雜疾病時所發(fā)揮的作用[56]等方面也有進展。從系統(tǒng)生物學及別構(gòu)網(wǎng)絡（allonetwork）的角度進行別構(gòu)藥物的設計將會影響未來的藥物發(fā)現(xiàn)和發(fā)展。