張 欣,綦曉青,繆錦來,3,鄭 洲,3*

(1.青島大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島266061;2.自然資源部 第一海洋研究所,山東 青島266061;3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室,山東 青島266061)

南極冰藻Chlamydomonassp.ICE-L是南極冰層微生物生態(tài)環(huán)境的主體,在南大洋海冰區(qū)的初級總產(chǎn)量中,冰藻的直接貢獻(xiàn)額達(dá)到25%,是南大洋重要的碳流和能量流[1]。南極冰藻的生長與海冰密切相關(guān),海水與海冰季節(jié)性交替變化是南極海洋的顯著特征,大部分南極海冰在南極短暫的夏天消失,在緊接著的冬天又重新形成[2]。因此,南極冰藻每年夏天會隨著海冰融化而從海冰鹽囊中釋放,在此過程中,南極冰藻經(jīng)歷鹽度極度稀釋、光照和紫外線突然增強的生境。冬天南極冰藻又隨海冰的形成而被嵌入到海冰鹽囊中,從而發(fā)生鹽度升高、溫度降低和光照變?nèi)醯纳匙兓痆3]?？傊?南極冰藻對海冰形成和融化時的生境適應(yīng)性調(diào)節(jié)機制是其生活史中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié),這種極端驟變環(huán)境直接影響南極冰藻的生存和活力。

為了能在海冰鹽囊中生存繁衍,南極冰藻形成了適應(yīng)低溫、高鹽等生境的復(fù)雜的生物學(xué)機制。鹽脅迫導(dǎo)致植物積累的活性氧和其他毒性物質(zhì)會破壞膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)和核酸分子[4],其中細(xì)胞膜將細(xì)胞與外界環(huán)境分隔開,南極冰藻適應(yīng)海冰環(huán)境有賴于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和膜脂的流動性[5]。膜脂中不飽和脂肪酸是維持細(xì)胞膜流動性的關(guān)鍵分子,而脂肪酸脫氫酶是不飽和脂肪酸合成途徑關(guān)鍵酶。增加膜脂中脂肪酸的不飽和度,可以降低膜脂熔點,提高細(xì)胞膜的流動性[6-7]。因此,微生物極端適應(yīng)性機制與不飽和脂肪酸關(guān)系的研究受到極大關(guān)注,目前已從多種微藻中克隆脂肪酸脫氫酶基因,其表達(dá)調(diào)控成為研究的熱點之一[7-10]。

南極冰藻能在極端驟變的海冰環(huán)境中生存繁衍,使其成為研究海洋藻類抗逆機制的良好材料[11-15]。本研究探討了高鹽環(huán)境對南極冰藻膜流動性及其脂肪酸脫氫酶基因表達(dá)的影響,不僅有助于深入了解極端海冰生境中南極冰藻細(xì)胞膜及其不飽和脂肪酸的分子調(diào)控機理,還為南極冰藻低溫脂肪酸脫氫酶的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。不飽和脂肪酸已廣泛應(yīng)用于食品、保健品和生物制藥等領(lǐng)域,可通過構(gòu)建南極冰藻低溫脂肪酸脫氫酶基因工程菌,實現(xiàn)脂肪酸脫氫酶的規(guī)?；苽?促進(jìn)不飽和脂肪酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 藻種來源與培養(yǎng)

本研究所用的南極冰藻Chlamydomonassp.ICE-L是在2001-2002年第18次南極科學(xué)考察時于南極中山站附近的海冰樣品中分離得到,現(xiàn)保存于自然資源部海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點實驗室。

利用1 000 m L三角瓶將藻種接種于滅菌海水配置的Provasoli培養(yǎng)基[16](600 m L/瓶)中,封口膜封口。在光照周期12 L∶12 D、光強1 300～1 900 lx、培養(yǎng)溫度(5±1)℃條件下培養(yǎng),每天搖晃3次使瓶內(nèi)藻體分布均勻[12]。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同鹽度條件下南極冰藻Chlamydomonassp.ICE-L生長曲線測定

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的南極冰藻接種于不同鹽度的Provasoli培養(yǎng)基中,接種密度約為5×105m L-1,共150 m L,在250 m L的三角瓶中培養(yǎng)。用NaCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的鹽度,使其鹽度梯度分別為海水鹽度(32)的0.5、1、2、3和4倍,即16、32、64、96和128。然后置于低溫光照培養(yǎng)箱內(nèi),光強為1 300～1 900 lx,光照周期12 L∶12 D,不充氣,培養(yǎng)溫度(5±1)℃,每日搖瓶3次。分別在培養(yǎng)的第0,2,4,6,8,10,12和14天取樣,每樣做3個平行,取平均值,以正常海水為對照組,使用紫外可見光分光光度計,測定OD680值。

1.2.2 細(xì)胞膜流動性的測定

離心收集不同鹽度培養(yǎng)14 d的藻體,用PBS緩沖液洗3次,重懸于50 mmol/L 的PBS緩沖液中,4 ℃下研磨10 min后10 000 g離心20 min,取上清液為細(xì)胞膜懸液進(jìn)行流動性測定。將8-苯胺基-1-萘磺酸(8-Anilino-l-Naphthalene Sulfonic aid,ANS)加入細(xì)胞膜懸液中,調(diào)整其濃度至2.5×10-5mol/L,在25 ℃溫浴30 min后,采用Hitachi F-4500型熒光分光光度計測量ANS熒光強度,具體方法參照文獻(xiàn)[17]。

1.2.3 膜脂提取

離心收集不同鹽度條件下培養(yǎng)14 d的藻體,并用4 ℃預(yù)冷的滅菌水沖洗3次,然后將藻體冷凍干燥,于-80 ℃貯存待用。稱取0.2 g干藻體,加入10 m L預(yù)冷的勻漿緩沖液。將均勻的懸浮藻液在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎,具體方法參考文獻(xiàn)[7]。取破碎好的藻物漿液,采用分級離心法制備細(xì)胞膜制劑:4 ℃,500 g離心15 min,取上清;4 ℃,2 000 g離心15 min,取上清;4 ℃,50 000 g離心30 min,取上清;4 ℃,80 000 g離心30 min,棄上清,得到的沉淀為細(xì)胞質(zhì)膜制劑。

1.2.4 脂肪酸分析

冰藻質(zhì)膜的脂肪酸提取和含量分析參照文獻(xiàn)[12]。提取的冰藻質(zhì)膜總脂樣品先甲酯化,隨后將甲酯化樣品冷卻,加入3.0 m L飽和NaCl溶液和1.0 m L正己烷,充分振蕩后靜置,取正己烷層進(jìn)行氣相色譜分析。根據(jù)質(zhì)膜脂肪酸的色譜結(jié)果參照標(biāo)準(zhǔn)品和碳鏈長度值確定脂肪酸種類,對各組分峰面積積分,歸一法分析計算各脂肪酸組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.5 不同鹽度條件下南極冰藻Chlamydomonassp.ICE-L脂肪酸脫氫酶的脅迫誘導(dǎo)

對不同鹽度培養(yǎng)的南極冰藻分別在0,2,6,12,24,48,96(4 d),144(6 d),192(8 d)和288 h(12 d)取樣進(jìn)行熒光定量分析,每個樣設(shè)3個重復(fù),以正常海水鹽度(32)培養(yǎng)的樣品作為對照組,研究不同鹽度脅迫對脂肪酸脫氫酶基因Δ9Ci FAD,Δ6Ci FAD,Δ12Ci FAD,ω3Ci FAD1和ω3Ci FAD2表達(dá)的影響。先按照TransZol說明書步驟提取南極冰藻RNA,檢測RNA 的完整性、濃度和純度符合要求后,再利用PrimescriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Ta KaRa)試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反轉(zhuǎn)錄好的樣品于-20℃保存?zhèn)溆?。采用實時熒光定量PCR 檢測不同鹽度下南極冰藻脂肪酸脫氫酶的表達(dá),相關(guān)基因的定量引物和實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系同參考文獻(xiàn)[7]和[12],引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

2 結(jié) 果

2.1 不同鹽度下南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L的生長曲線

南極冰藻在不同鹽度條件下的生長情況(圖1)顯示,其在鹽度16,32,64,96和128 條件下均能夠生長。在正常海水鹽度32中,南極冰藻生長最快,在第12天達(dá)到平臺期;在鹽度16條件下,細(xì)胞的生長趨勢與正常海水條件基本相同;在鹽度64和96條件下,南極冰藻生長較慢,在第8天到達(dá)平臺期;在鹽度128條件下,細(xì)胞的生長受到抑制。與正常海水處理相比,隨著鹽度的增加,南極冰藻的生長速率逐漸降低。

2.2 不同鹽度條件下南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L的流動性

不同鹽度條件下南極冰藻細(xì)胞膜ANS相對熒光強度見圖2,熒光光度值波動范圍為398～528。與正常海水鹽度32相比,隨著鹽度升高,熒光光度值呈下降趨勢,在鹽度128條件下,熒光光度值始終保持最低,且變化最小;在低鹽度16 條件下,熒光光度值與正常海水條件下相比有所降低。在不同鹽度條件,在培養(yǎng)2 h和6 h時熒光光度值較培養(yǎng)144 h時低。

圖1 不同鹽度條件下南極冰藻生長曲線Fig.1 Growth curve of Antarctic ice algae under different salinity conditions

圖2 不同鹽度條件下南極冰藻細(xì)胞膜ANS相對熒光強度Fig.2 ANS relative fluorescence intensity of the cell membrane of Antarctic ice algae membrane under different salinity condition

2.3 南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L細(xì)胞膜總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

不同鹽度條件下南極冰藻細(xì)胞膜總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)實驗結(jié)果(圖3)顯示,在正常海水鹽度(32)條件下細(xì)胞膜總脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低,脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.6%;在鹽度16培養(yǎng)條件下,脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值14.3%,為正常條件的1.7倍;在鹽度64,96和128培養(yǎng)條件下,隨著鹽度的升高,脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高,其中在鹽度128條件下,脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到13.5%,為正常條件下的1.6 倍。

2.4 不同鹽度條件下南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L細(xì)胞膜脂肪酸組成變化

南極冰藻細(xì)胞膜由10多種脂肪酸組成,主要為多不飽和脂肪酸(Polyunsaturaled Fatty Acid,PUFA),其質(zhì)量分?jǐn)?shù)能達(dá)到57.1%～62.9%,其中C18∶3,C20∶3和C20∶5是3種最主要的PUFA;單不飽和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acids,MUFA)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.4%～29.5%,主要為C18∶1和C18∶1(cis9);飽和脂肪酸(Saturated Fatty Acid,SFA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最少,為11.1%～16.5%左右,主要包括其中C18∶0和C20∶30,還有少量的C12∶0 和C14∶0等短鏈脂肪酸。由不同鹽度條件下的南極冰藻細(xì)胞膜脂肪酸組成變化(圖4)可知,在高于或低于正常海水鹽度的條件下,膜脂中總多不飽和脂肪酸(Tatal Polyunsaturated Fatty Acids,TPUFA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所增加;在高鹽度(128)和低鹽度(16)條件下,TPUFA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為62.5%和62.85%;隨著鹽度的升高,膜脂中總單不飽和脂肪酸(Total Monounsaturated Fatty Acids,TMUFA)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)先升高后下降,在鹽度64條件下,TMUFA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值(29.51%);在正常海水鹽度條件下,膜脂中總飽和脂肪酸(Total Saturated Fatty Acids,TSFA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(16.52%),其他鹽度條件下,TSFA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所下降。

圖3 不同鹽度下南極冰藻細(xì)胞膜總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Total lipid content of Antarctic ice algae membrane under different salinity condition

圖4 不同鹽度條件下南極冰藻細(xì)胞膜脂肪酸組成變化Fig.4 Fatty acid compositions of Antarctic ice algae membrane under different salinity condition

2.5 不同鹽度對脂肪酸脫氫酶基因表達(dá)的影響

在高鹽度條件下,Δ9Ci FAD的表達(dá)量在前12 h內(nèi)持續(xù)增加,其中在鹽度96和128條件下培養(yǎng)12 h后,其表達(dá)量最大,分別為對照組的4.6和5.5倍,隨后Δ9Ci FAD的表達(dá)量有所降低,但其表達(dá)水平仍高于正常條件的表達(dá)水平(圖5)。在高鹽度條件下培養(yǎng)144(6 d)～192 h(12 d),Δ6Ci FAD的表達(dá)量隨鹽度(64和96)的升高有所升高,鹽度繼續(xù)升高至128時其表達(dá)量有所下降,隨后Δ6Ci FAD的表達(dá)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(圖6)。在高鹽度條件下培養(yǎng)6 h 內(nèi),Δ12Ci FAD表達(dá)量有所上調(diào),其后其表達(dá)變化趨勢與Δ6Ci FAD相似;不同的鹽度條件下Δ12Ci FAD表達(dá)量最大的時間有所不同,在鹽度128條件下培養(yǎng)的第8天時達(dá)到峰值,為對照組的6.5倍;在鹽度64和96條件下培養(yǎng)的第12天時達(dá)到峰值,分別為對照的6.7倍和6.9倍;在低鹽度條件下,Δ12Ci FAD的表達(dá)量總體呈現(xiàn)增長的趨勢,在鹽度16條件下培養(yǎng)的第8天時達(dá)到最高值,為對照組的9.6 倍(圖7)。ω3Ci FAD1 在高鹽條件下表達(dá)上調(diào),在鹽度96 和128 培養(yǎng)2 h,ω3Ci FAD1的表達(dá)量迅速增加到4.2倍和3.5倍,之后培養(yǎng)至第12天表達(dá)量稍有下降水平,但仍保持在較高表達(dá)水平(圖8)。在高鹽條件下,ω3CiFAD2的表達(dá)量變化趨勢與ω3CiFAD1相似,而在低鹽條件下,ω3CiFAD2的表達(dá)更為活躍,表達(dá)量上調(diào),在第4天時達(dá)到峰值,為對照組的4.8倍(圖9)。

圖5 不同鹽度下南極冰藻脂肪酸脫氫酶基因Δ9CiFAD 的表達(dá)變化Fig.5 Expressions of fatty acid desaturases geneΔ9Ci FAD of Antarctic ice algae under different salinity conditions

圖6 不同鹽度下南極冰藻脂肪酸脫氫酶基因Δ6CiFAD 的表達(dá)變化Fig.6 Expressions of fatty acid desaturases geneΔ6Ci FAD of Antarctic ice algae under different salinity condions

圖7 不同鹽度下南極冰藻脂肪酸脫氫酶基因Δ12CiFAD 的表達(dá)變化Fig.7 Expressions of fatty acid desaturases geneΔ12Ci FAD of Antarctic ice algae under different salinity conditions

圖8 不同鹽度下南極冰藻脂肪酸脫氫酶基因ω3CiFAD 1的表達(dá)變化Fig.8 Expressions of fatty acid desaturases geneω3Ci FAD 1 of Antarctic ice algae under different salinity conditions

圖9 不同鹽度下南極冰藻脂肪酸脫氫酶基因ω3CiFAD 2的表達(dá)變化Fig.9 Expressions of fatty acid desaturases geneω3Ci FAD 2 of Antarctic ice algae under different salinity conditions

3 討 論

南極冰藻能夠在高鹽度的海冰鹽囊中旺盛生長,鹽度是影響其生存的關(guān)鍵因素之一:在鹽度32時,最適宜南極冰藻Chlamy domonassp.ICE-L生長;在高鹽度128時,南極冰藻的生長受到抑制,在其他鹽度下均能生長和存活;在低鹽度16時南極冰藻生長狀況良好,與正常海水鹽度下的南極冰藻生長狀況相近。南極冰藻對鹽度的耐受力遠(yuǎn)高于普通海洋微藻,這可能與其適應(yīng)南極極端驟變海冰環(huán)境有關(guān)。南極氣候異常寒冷,海冰的理化性質(zhì)季節(jié)性變化和晝夜變化劇烈,在海冰溶解過程中,鹽度極度稀釋,而在海水成冰時,鹽分被排斥在冰晶外形成鹽囊和鹽通道,導(dǎo)致鹽度急劇升高,海水鹽度一般為34～35,海冰中的鹽囊和鹽通道可達(dá)到普通海水的5倍[3]。在長期進(jìn)化過程中,南極冰藻形成了適應(yīng)極端海冰生境的特殊生理生化機制,從而能在海冰鹽囊中生存繁衍[19]。

膜結(jié)構(gòu)是一個動態(tài)的平衡體系,其成分可隨外界環(huán)境變化進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整。與正常海水鹽度32相比,在高鹽度條件下,隨著鹽度的升高,南極冰藻細(xì)胞膜熒光光度值呈下降的趨勢,說明細(xì)胞膜流動性隨鹽度的升高而增強,這與康亦兼等[20]與程書梅等[21]對高鹽條件下酵母細(xì)胞膜的流動性研究結(jié)果一致;在低鹽度16條件下,南極冰藻細(xì)胞膜熒光光度值比正常海水條件下的熒光值降低,表明其細(xì)胞膜流動性有所增加,可能與其適應(yīng)海冰融化時的低鹽環(huán)境有關(guān)。在不同鹽度條件下,南極冰藻細(xì)胞膜熒光光度值波動范圍較小,說明其膜流動性比較穩(wěn)定,能夠適應(yīng)南極海水成冰和海冰融化時海水鹽度的劇烈變化,維持南極冰藻的生理活性。

脂肪酸是南極冰藻及其細(xì)胞膜的主要成分,其含量組成與海冰鹽度變化密切相關(guān)。在低鹽和高鹽環(huán)境中,南極冰藻細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸含量增加,提高了膜脂的不飽和度,這與南極冰藻可在低鹽和高鹽環(huán)境下維持其質(zhì)膜流動性相一致。南極冰藻細(xì)胞膜的脂肪酸組成較多,主要以多不飽和脂肪酸(PUFA)為主,這對細(xì)胞在低溫和高鹽條件下維持細(xì)胞膜的流動性發(fā)揮著重要作用。在高鹽度條件下南極冰藻細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的含量升高,能夠降低南極冰藻細(xì)胞膜的相變溫度,使其在海冰環(huán)境下維持細(xì)胞膜流動性,保護細(xì)胞隔間及胞器不受損傷,從而維持南極冰藻的生理功能[6-7]。

南極冰藻脂肪酸脫氫酶基因的表達(dá)調(diào)控模式與海冰鹽度環(huán)境有關(guān)[22]。Δ9脂肪酸脫氫酶催化棕櫚酰Co A(C16∶0)和硬脂酰Co A(C18∶0)的第9、10位碳原子之間脫氫形成一個雙鍵,合成棕櫚油酸(C16∶1)與油酸(C18∶1),是不飽和脂肪酸合成的限速酶[12];在高鹽和低鹽環(huán)境中,Δ9Ci FAD基因的表達(dá)量快速升高,且變化趨勢與細(xì)胞膜流動性的變化趨勢是一致的,表明其可快速響應(yīng)外界的鹽度壓力,調(diào)節(jié)南極冰藻細(xì)胞膜的流動性。Δ12脂肪酸脫氫酶是在油酸(C18∶1)的Δ12位脫氫引入雙鍵形成亞油酸(C18∶2);Δ6脂肪酸脫氫酶是以C18∶2 為底物,合成C18∶3n-6 的限速酶[12];在長時間的高鹽處理后,Δ12Ci FAD和Δ6Ci FAD表達(dá)量升高,它們可能在南極冰藻應(yīng)對鹽度壓力后期發(fā)揮重要作用;ω3脂肪酸脫氫酶是?；?脂脫氫酶的一種,以C18∶2作為底物,在C15位脫氫形成C18∶3n-3[12];在高鹽壓力環(huán)境中ω3Ci FAD1表達(dá)量高,可以保護南極冰藻細(xì)胞免受高鹽傷害,而在低鹽環(huán)境下ω3Ci FAD2表達(dá)量高,有利于南極冰藻適應(yīng)海冰融化時的低鹽環(huán)境。

4 結(jié) 語

南極冰藻Chlamydomonassp.ICE-L能夠在高鹽環(huán)境中維持細(xì)胞膜流動性有助于其適應(yīng)極端海冰環(huán)境。南極冰藻細(xì)胞膜流動性在高鹽環(huán)境中波動范圍不大,細(xì)胞膜保持了動態(tài)的穩(wěn)定以維持細(xì)胞正常的生理功能。在高鹽環(huán)境中,南極冰藻通過增加細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度來增加細(xì)胞膜的流動性,從而增強對極端環(huán)境的適應(yīng)性。在高鹽條件下,南極冰藻Δ9Ci FAD基因的表達(dá)量在短時間內(nèi)迅速升高,Δ12Ci FAD和Δ6Ci FAD對環(huán)境變化的時間稍微滯后,ω3Ci FAD1在高鹽環(huán)境表達(dá)量升高,而ω3Ci FAD2在低鹽環(huán)境中表達(dá)量升高,不同鹽度條件下南極冰藻脂肪酸脫氫酶的表達(dá)變化與其細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化趨勢基本一致。由此可知,在高鹽環(huán)境脅迫下南極冰藻通過提高脂肪酸脫氫酶基因的表達(dá)量來增加脂肪酸脫氫酶的合成,以增加不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù),降低膜脂的熔點,從而提高細(xì)胞膜的流動性。這不僅有助于揭示極端海冰環(huán)境中南極冰藻細(xì)胞膜流動性及其不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的協(xié)同調(diào)控機制,還為南極冰藻脂肪酸脫氫酶的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ),對油料植物基因工程和抗凍耐鹽作物選育等具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

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