魏鈺娟 潘曉藝 藺凌云 赟姚嘉 郝貴杰 曹 錚 夏焱春 尹文林 劉憶瀚 沈錦玉，

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201200； 2. 農業(yè)農村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室 浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室 浙江省淡水水產研究所 湖州 313001)

鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ， CyHV-2)又被稱為皰疹病毒性造血器官壞死病病毒(Herpesviral haematopoietic necrosis virus， HVHNV)(徐進等， 2013)或金魚造血器官壞死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus， GFHNV)(Jefferyet al， 2007)與鯉科魚類的其他兩種皰疹病毒CyHV-1(Carp pox)和CyHV-3(Koi herpesvirus， KHV)同屬于異皰疹病毒科(Alloherpesviridae)鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)。CyHV-2 于1992—1993 年間給日本西部養(yǎng)殖的金魚造成了巨大的經濟損失， 患病金魚死亡率高達100% (Junget al， 1995)。隨后其他國家和地區(qū)也相繼有了該 病暴發(fā)的報道， 1997 年春季在美國西海岸一循環(huán)水養(yǎng)殖場的金魚幼魚出現(xiàn)大量死亡， 死亡率高達80%以上， 后經證實其發(fā)病是由CyHV-2 感染引起的。觀賞魚的國際貿易很大程度上促進了該病的跨區(qū)域傳播， 隨后中國臺灣、澳大利亞、英國養(yǎng)殖的金魚相繼暴發(fā)該病(Stephenset al， 2004； Jefferyet al， 2007； Hansonet al， 2011)。2011 年匈牙利報道了養(yǎng)殖的銀鯽也發(fā)現(xiàn)了CyHV-2 感染。而中國大面積暴發(fā)該病始于2009年， 主要發(fā)生在江蘇省鯽魚養(yǎng)殖區(qū)射陽、大豐、寶應、高郵、東臺等地， 發(fā)病總面積在6600ha 以上， 發(fā)病嚴重的塘口死亡率高達90%， 造成的經濟損失達數(shù)億元(桂建芳， 2009； Xuet al， 2013)。與此同時， 在湖北、湖南、江西、浙江等省份， 也相繼在患病鯽魚體內檢測出CyHV-2。

細胞培養(yǎng)分離技術是病毒病診斷的經典方法， 也常被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)所推薦。CyHV-2 敏感細胞系的建立對CyHV-2 的分離、特征分析和細胞滅活疫苗研究都具有重要作用。但已有研究發(fā)現(xiàn)CyHV-2 很難在魚類病毒分離常用的細胞系中進行連續(xù)的傳代(馬杰等， 2016)， 比如胖頭鯉細胞(fathead minnow cells， FHM) (Junget al， 1995)、鯉魚上皮瘤細胞(epithelioma papulosum cyprini， EPC)、草魚卵巢細胞(grass carp ovary， CO)、草 魚 腎 細 胞(grass carp kidney， CIK)均對CyHV-2 不敏感， 僅錦鯉鰭細胞(koi fin， KF-1)能產生細胞病變效應(CPE)， 但病毒在KF-1細胞上傳至第3—5 代后， CPE消失且檢測不到病毒核酸(Junget al， 1995)。雖然已有學者建立了異育銀鯽腦組織細胞系(Maet al， 2015)和鰭條細胞系(Luet al， 2018)， 且對CyHV-2 敏感， 但由于不對外供應， 還是缺乏CyHV-2 敏感的細胞系， 限制了對CyHV-2 的研究， 因此建立對CyHV-2 敏感的細胞系并研究該細胞系的生物學特性， 對CyHV-2 進行連續(xù)傳代擴大培養(yǎng)從而深入研究病毒的特性， 具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患鯽造血器官壞死病異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)采集自江蘇鹽城某鯽魚養(yǎng)殖場。健康異育銀鯽來自于浙江省淡水水產研究所綜合試驗基地， 平均體重120±20g/尾， 實驗前于室內養(yǎng)殖水池暫養(yǎng)。L-15細胞培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、磷酸緩沖液(PBS)、胰蛋白酶-EDTA、秋水仙素均購自Sigma 公司， 胎牛血清購自GIBICO 公司， DNA 核酸提取試劑為天根產品； PCR 用rTaq 預混液購為TaKaRa 公司。細胞培養(yǎng)瓶、移液管、細胞凍存管均購自Corning 公司。

1.2 鯽魚脊髓細胞系的建立

1.2.1 原代培養(yǎng) 健康異育銀鯽以75%酒精進行體表消毒3—4 次， 無菌條件下取出異育銀鯽脊髓組織， 置于含200U/mL 青霉素和200μg/mL 鏈霉素的Hank’s 平衡鹽溶液(HBSS)中(圖1)， 清洗三次。然后將洗干凈的組織移至盛有L-15 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中進行平衡。根據(jù)Freshney(2010)和薛慶善(2001)原代培養(yǎng)法， 采用組織塊移植法進行原代細胞培養(yǎng)。將上述的脊髓組織剪成約 0.1mm3的組織塊， 然后移植到25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中， 均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底面， 倒置平放， 24°C 恒溫培養(yǎng)， 放組織塊的一面朝上， 培養(yǎng)瓶中添加3mL 含20%V/V胎牛血清、100U/mL 青霉素、100μg/mL 鏈霉素的L-15 培養(yǎng)液， 過夜， 慢慢將培養(yǎng)瓶正置過來進行培養(yǎng)， 每2—3 天更換培養(yǎng)液一次， 倒置生物顯微鏡觀察細胞生長情況。

圖1 培養(yǎng)皿中異育銀鯽脊髓組織 Fig.1 Spinal cord tissue of C. auratus gibelio in culture dish

1.2.2 傳代培養(yǎng) 參照肖藝等(2012)的方法進行細胞傳代培養(yǎng)。當細胞從組織塊中遷出單層達培養(yǎng)瓶底面積90%時， 采用胰蛋白酶消化法按1 瓶傳2 瓶的方式進行傳代， 24°C 培養(yǎng)， 待細胞再次形成單層后， 再同法進行傳代培養(yǎng)， 直至獲得穩(wěn)定傳代的異育銀鯽脊髓組織細胞系CSC。并對穩(wěn)定傳代的細胞系添加細胞凍存液后進行液氮保存。

1.2.3 細胞染色體核型分析 對處于對數(shù)生長期的CSC 細胞， 加入終濃度為0.4μg/mL 的秋水仙素， 25°C 孵育4h 后胰酶消化收集細胞， 用0.075mol/L 的KCl 溶液低滲處理25min 后加入預冷的卡諾固定液， 1000r/min離心5min去上清后再用預冷的卡諾固定液固定3 次， 每次15min。冷滴片法滴片， 干燥后用5% Giemsa 染色25min， 流水沖洗， 干燥后顯微鏡觀察。100倍油鏡下隨機選取100 個細胞， 統(tǒng)計其染色體數(shù)目。

1.3 CSC 細胞對CyHV-2 的敏感性

1.3.1 對CyHV-2 的敏感性 將鯉皰疹病毒Ⅱ型陽性的病魚腎臟、脾臟、腦、脊髓組織剪碎， 并加等體積PBS 進行勻漿， 勻漿液5000r/min 4°C 離心15min 后， 上清經0.45μm 和0.22μm 濾膜過濾， 制備成無菌組織勻漿濾液。將病毒濾液按1︰10 和1︰20的稀釋度感染培養(yǎng)至單層的CSC 細胞， 24°C 吸附1h后， 棄去病毒稀釋液， 換成血清濃度為2%的L-15 維持液繼續(xù)24°C 培養(yǎng)， 逐日觀察細胞病變情況(Wanget al， 2016)。

1.3.2 病毒的TCID50測定 在96 孔細胞培養(yǎng)板中將CSC 細胞培養(yǎng)至單層細胞， 用維持液將CyHV-2 感染CSC 細胞7d 后的病毒裂解液作連續(xù)10 倍稀釋， 即10-1、10-2……10-10， 每個稀釋度取100μL 加入96孔細胞培養(yǎng)板中， 每個稀釋度作8 個重復， 并設空白細胞培養(yǎng)對照。置24°C 培養(yǎng)箱中。逐日觀察細胞病變， 并記錄細胞病變孔數(shù)。按Reed-Muench 法計算病毒滴度TCID50值。

1.3.3 CSC 對CyHV-2 傳代的穩(wěn)定性 采用CSC細胞對1.3.1分離的病毒進行傳代， 傳代至第7代次， 保存每代次的病變細胞用于CyHV-2的檢測。病變細胞的總DNA采 用 DNAzol 進 行 提 取， CyHV-2 檢 測 引 物 為： CyHV-2-366F： 5′-GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTC TAC-3′； CyHV-2-366R： 5′-CCATAGT CACCATCG TCTCATC-3′ (Waltzeket al， 2009)。

1.3.4 CSC 病變細胞的電鏡觀察 將感染第7 代CyHV-2 的CSC 病變細胞經2%戊二醛固定液(pH 7.2， 0.1mol/L PBS 緩沖液配制)預固定， 1%四氧化鋨固定液后固定， 再經脫水包埋后進行超薄切片， 3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后， 透射電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 原代細胞特征

采用含20%胎牛血清的L-15 培養(yǎng)液， 對處理成小塊的異育銀鯽脊髓組織， 黏附細胞瓶后， 于24°C 進行恒溫靜止培養(yǎng)， 3—4d 后有些細胞從組織 塊周圍遷出， 細胞形態(tài)呈成纖維樣(圖2)。待單層細胞長至充滿瓶底面積80%—90%時， 按1 傳2 的方式進行傳代。

圖2 原代異育銀鯽脊髓組織細胞 Fig.2 The spinal cord tissue cells of C. auratus gibelio in the primary culture

2.2 傳代細胞特征

CSC 細胞首次傳代， 約30min 可完成貼壁， 群體倍增時間為48h。連續(xù)傳代 8 次后， 傳代細胞貼壁生長速度更趨穩(wěn)定， 3d 后可形成單層細胞。在傳代至第10 代后， 逐漸減少血清含量至10%， 通過連續(xù)傳代， 采用10%胎牛血清的L-15 培養(yǎng)液， 24°C 培養(yǎng)， 可對CSC 細胞進行穩(wěn)定培養(yǎng)， 至今CSC 細胞已傳至128代。獲得穩(wěn)定傳代的第10、第50 和第100 代次CSC細胞形態(tài)見圖3， 并對CSC 細胞進行了保藏， 保藏號為CCTCC NO： C2018211。采用添加細胞凍存液， 將傳代的細胞系于液氮中進行冷凍保存。

圖3 異育銀鯽脊髓組織細胞系 Fig.3 Morphology of CSC cells

2.3 傳代細胞染色體分析

采用秋水仙素使分裂的細胞停止于分裂中期， 再通過低滲法進行染色體觀察。通過對100 個分裂相細胞的觀察， 第26 代異育銀鯽脊髓組織來源細胞的染色體數(shù)分布在152—160 之間(圖4a)， 41%的細胞都含有156 條染色體(圖4b)， 表明該細胞的宿主為三倍體異育銀鯽。

2.4 CSC 細胞對CyHV-2 的敏感性

圖4 第26 代異育銀鯽脊髓組織細胞系的染色體 Fig.4 Chromosomes of CSC cells at passage 26

圖5 CSC 細胞感染CyHV-2 后的病變特征 Fig.5 CPE features of CyHV-2 infected CSC cells

CyHV-2 陽性樣品組織勻漿液感染CSC 細胞單層(圖5a)， 并以含2%血清的L-15 維持液培養(yǎng)， 逐日觀 察細胞病變(CPE)， 感染后第3 天細胞聚合后溶解出現(xiàn)空斑(圖5b)， 感染后第5 天空斑區(qū)域擴大(圖5c)， 感染后第7 天細胞出現(xiàn)大片聚合病變(圖5d)。

2.5 傳代病毒的TCID50 測定

不同稀釋濃度的病毒裂解液接種96 孔的CSC 細胞單層后， 連續(xù)觀察9d， 記錄每個稀釋度的細胞病變孔數(shù)， 結果見表1 所示， 按 Reed-Muench 法計算， 換算成1mL 所含的TCID50為109.33/mL。

表1 TCID50 檢測 Tab.1 Detection of TCID50 in different virus dilutions

2.6 CSC 細胞對病毒傳代的穩(wěn)定性

對收集的第2—7 代次的CyHV-2 細胞培養(yǎng)物進行DNA 提取， 并進行CyHV-2 的檢測， 發(fā)現(xiàn)第2 代次至第7 代次培養(yǎng)物的總DNA， 都可擴增得到366bp的目的片段(圖6)， 表明CyHV-2 在CSC 細胞中可以穩(wěn)定傳代7 代以上。

圖6 不同培養(yǎng)代次CyHV-2 的PCR 檢測結果示意圖 Fig.6 Schematic results of PCR detection of CyHV-2 in different culture passages

2.7 鯉皰疹病毒Ⅱ型感染CSC 的電鏡觀察

通過透射電鏡觀察感染CyHV-2 后的CSC 病變細胞， 可觀察到大量直徑在128—134nm 的皰疹樣病毒粒子， 呈球形顆粒狀。說明CyHV-2 在CSC 細胞中能繁殖、擴增(圖7a， 圖7b)。

3 討論

圖7 第7 代CyHV-2 病毒感染CSC 的細胞電鏡超薄切片示意圖 Fig.7 Schematic view of ultrathin section of the 7th generation CyHV-2-infected CSC cells

魚類細胞培養(yǎng)的研究始于20 世紀60 年代， Wolf等(1962)建立了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)生殖腺細胞系RTG-2。此后， 魚類細胞系的建立及其相關研 究進展迅速， 迄今為止， 已有300 株左右來自不同品種魚類的不同組織的細胞系已被建立， 魚類細胞培養(yǎng)已成為一項重要的技術， 在病毒學、免疫學、魚類資源保護與遺傳育種、病理學、環(huán)境毒理學、魚類生理學、內分泌學和轉基因等方面的理論及應用研究中發(fā)揮作用(Lakraet al， 2011)。而鯽魚組織源的細胞系也被多位學者建立， 包括鰭條細胞系CFS、鯽魚異倍體囊胚細胞系CAB-800、鯽魚腮蓋膜細胞系HCC-87、銀鯽魚背鰭細胞系SCC-DF、鯽魚腦細胞系GiCB、鯽魚尾鰭細胞系GiCF 等(陳敏容等， 1985； 李亞男等， 1992； Hasegawaet al， 1997； Maet al， 2015； Luet al， 2018)。

原代細胞培養(yǎng)主要有組織塊貼壁法、胰蛋白酶消化法、機械分散法、絡合劑分散法等(于淼等， 2003)。常用的是組織塊貼壁法和胰蛋白酶消化法， 比較這兩種原代細胞培養(yǎng)法的優(yōu)缺點， 組織塊貼壁法更適用于不易消化的組織。根據(jù)前期對CyHV-2 在鯽魚內臟組織分布的研究發(fā)現(xiàn)， 腦和腎臟的病毒含量最高(袁雪梅等， 2019)， 此外， 皰疹病毒容易在神經細胞中進行潛伏感染(Grinde， 2013)， 因此， 本研究選擇與腦連接的脊髓組織作為原代細胞培養(yǎng)的組織源。脊髓組織質地松軟， 含有較多不易被消化的組織， 所以選擇組織塊貼壁法對鯽魚脊髓組織進行原代細胞培養(yǎng)。采用胰蛋白酶消化法對鯽魚脊髓原代細胞進行傳代培養(yǎng)， 以1︰2 的比例順利獲得傳代。細胞是否可以長期凍存和成功復蘇， 對于建立穩(wěn)定的細胞系至關重要。本實驗中， 采用液氮保存法， 選取了細胞冷凍保護液， 有效避免了因細胞在降溫過程中形成冰晶而造成的細胞損壞(陳愛平等， 2011)。

細胞系是分離病毒性病原的重要材料。而鯽魚來源的對CyHV-2 敏感的細胞系較缺乏， 制約了有關鯽魚皰疹病毒病的研究進展。本研究以鯉皰疹病毒Ⅱ型感染CSC 細胞系后， 細胞出現(xiàn)了明顯病變效應， 在感染第7 天病毒滴度達到了109.33TCID50/mL。而已報道的對CyHV-2 最敏感的細胞系， 分離的病毒最高滴度只有104.9TCID50/mL (GiCF) (Luet al， 2018) 和107.5TCID50/mL (GiCB) (Maet al， 2015)。這表明CSC細胞系擴增 CyHV-2 的能力更強， 并且分離的CyHV-2 病毒可在CSC 細胞中穩(wěn)定傳代， 傳代病毒的各代次病毒滴度穩(wěn)定。通過對固定的病變細胞進行電鏡觀察， 在細胞中觀察到大量的皰疹樣病毒顆粒， 直徑大小為 128—134nm， 病毒粒子的形狀和大小與CyHV-2 病毒一致(李茂等， 2015)。根據(jù)電鏡觀察到的病毒量， 也間接證明了病毒CyHV-2 可以在CSC 細胞中進行高效的復制。這為制備鯽造血器官壞死病細胞培養(yǎng)滅活疫苗提供了可靠的病毒復制載體。

4 結論

綜上， 本研究建立的CSC 細胞系對CyHV-2 敏感， 且病毒在該細胞系中能進行穩(wěn)定高滴度地傳代， 因此CSC 細胞系成為研究CyHV-2 復制與發(fā)病機制的有效工具， 還可用于CyHV-2 細胞培養(yǎng)滅活疫苗的制備。以此為基礎研究獲得的CyHV-2 細胞滅活疫苗將有助于我國鯽造血器官壞死病的預防和控制。