盛瑜，白麗丹，段懿涵，安麗萍，郭笑，王曼力

（北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

隨著生活節(jié)奏的加快，越來(lái)越多的人處于亞健康狀態(tài)，亞健康狀態(tài)的眾多臨床表現(xiàn)中以“無(wú)法解釋的疲勞”最為常見(jiàn)。疲勞常會(huì)導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的繼發(fā)性問(wèn)題，如焦慮、抑郁、認(rèn)知障礙、睡眠質(zhì)量差、身體功能障礙、能量失衡，甚至能夠引發(fā)與生物調(diào)節(jié)和免疫系統(tǒng)有關(guān)的嚴(yán)重疾病[1-2]。疲勞已成為威脅人類健康的一個(gè)重大問(wèn)題。因此，通過(guò)有針對(duì)性地補(bǔ)充外源性營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑或藥物以延緩或防止疲勞的發(fā)生，是解決疲勞以及調(diào)節(jié)亞健康狀態(tài)的有效途徑之一[3]。

疲勞不僅與現(xiàn)代生活方式引起的壓力水平升高有關(guān)，而且通常伴隨著機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力下降[4]。正常的疲勞，通常發(fā)生在強(qiáng)烈的體力勞動(dòng)之后，可視為一個(gè)機(jī)體保護(hù)信號(hào)，提示機(jī)體需要休息[5]。導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)制復(fù)雜，包括：代謝產(chǎn)物如乳酸（lactate，LA）和尿素氮（urea nitrogen，UN）的過(guò)量產(chǎn)生和積累導(dǎo)致肌肉衰竭；活性氧（reactive oxygen species，ROS）在肌肉或其他相關(guān)器官（如肝臟）中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和損傷；肝臟和肌肉的血氧濃度平衡和糖原內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變降低了機(jī)體運(yùn)動(dòng)的可持續(xù)性和運(yùn)動(dòng)后的恢復(fù)等[6]。近年來(lái)的臨床應(yīng)用表明，一些復(fù)方或單方中草藥通過(guò)消除上述代謝物、減少氧化應(yīng)激，改善糖原代謝等途徑預(yù)防和緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞，可見(jiàn)中草藥在抗疲勞和提高運(yùn)動(dòng)能力方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。

北蟲草（Cordyceps militaris）作為藥材和民間滋補(bǔ)食品在東亞地區(qū)廣為應(yīng)用，中醫(yī)認(rèn)為，其入肺腎二經(jīng)，可補(bǔ)肺陰和腎陽(yáng)。據(jù)報(bào)道，北蟲草提取物（Cordyceps militaris fruit body extract，CM）及其多糖（polysaccharide from C.militaris，PCM）具有顯著的抗疲勞功效[7-8]。刺五加（Acanthopanax senticosus）作為藥物的應(yīng)用歷史十分悠久，在歷代本草著作中均有記載，其具有“補(bǔ)中、益精、堅(jiān)筋骨、強(qiáng)志意”的功效[9]。研究發(fā)現(xiàn)，刺五加莖皮提取物（extracts of stem bark from Acanthopanax senticosus，ASSE）具有抗疲勞作用，能提高運(yùn)動(dòng)耐力[10]。

本課題組基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞的病因病機(jī)的研究，結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)養(yǎng)生理論，將北蟲草與刺五加進(jìn)行配伍，制備了北蟲草刺五加組合物（Cordyceps militaris Acanthopanax senticosus composition，CAC）。本研究通過(guò)檢測(cè)小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間、力竭游泳時(shí)間及小鼠體內(nèi)血乳酸（lactic acid，LA）、血乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肝糖原（liver cogen，LG）、肌糖原（muscle glycogen，MG）等指標(biāo)考察該組合物對(duì)小鼠的抗疲勞作用，并通過(guò)檢測(cè)小鼠肝臟中總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD），丙二醛（malondialdehyde，MDA），活性氧（reactive oxygen species，ROS）的活性或含量，以及磷酸化-蛋白激酶B（phosphorylated-protein kinase B，p-AKT）、磷酸化-糖原合成酶激酶（phosphorylated-glycogen sythesis kinase-3，p-GSK3β） 和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子 4（glucose transporter 4，GLUT4）蛋白的表達(dá)情況，探究北蟲草刺五加組合物抗疲勞的可能作用機(jī)制，以期為該組合物作為抗疲勞功能性食品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北蟲草刺五加組合物（CAC）：由北華大學(xué)藥學(xué)院研發(fā)制備，其中原料藥材北蟲草購(gòu)自沈陽(yáng)聚鑫北蟲草菌業(yè)有限公司、刺五加購(gòu)自國(guó)藥控股濰坊有限公司。

血清尿素氮（BUN）、乳酸（LA）、乳酸脫氫酶（LDH）、肝糖元（LG）、肌糖元（MG）、丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒：南京建成生物工程研究所；活性氧簇（ROS）試劑盒：酶聯(lián)生物公司；βactin、p-AKT（Ser 473）、p-GSK3β（Ser 9）、GLUT4 兔抗鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）：ABclone公司。

SPF級(jí)雄性ICR小鼠：4～5周齡，體重18 g～22 g，40只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK（吉）-2016-0003，長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2550型）：SHIMADZU公司；酶標(biāo)儀（Infinite M200型）：TECAN公司；低溫高速離心機(jī)（5810型）：EPPENDORF公司；電子分析天平（ME55）：METTLER TOLEDO 公司；自動(dòng)疲勞轉(zhuǎn)棒儀（ZB-200）：成都泰盟軟件有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥

SPF級(jí)健康雄性ICR小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按每組10只隨機(jī)分成4組，并結(jié)合中藥配伍組方劑量及人體給藥劑量的5、10、20倍設(shè)計(jì)小鼠給藥劑量，即空白對(duì)照組（記為CON）、北蟲草刺五加組合物低劑量組[low dosage of CAC，LCAC，50 mg/（kg·d）]、北蟲草刺五加組合物中劑量組 [medium dosage of CAC，MCAC，100 mg/（kg·d）]、北蟲草刺五加組合物高劑量組[high dosage of CAC，HCAC，200 mg/（kg·d）]，每天進(jìn)行灌胃給藥，其中CON組灌胃給藥生理鹽水，連續(xù)給藥5周。每間隔10 d稱重，觀察給藥后小鼠體重，精神狀態(tài)，攝入食水量，毛色變化等情況。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)方案Fig.1 Experiment scheme

1.3.2 小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

連續(xù)給藥第29天時(shí)，給藥30 min后，將各組小鼠置于轉(zhuǎn)速為30 r/min轉(zhuǎn)棒疲勞儀上，進(jìn)行小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練，1次/d，連續(xù)3 d。第32天，給藥30 min后，進(jìn)行正式轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)，將小鼠放置于轉(zhuǎn)速以1 r/min遞增至30 r/min的電動(dòng)轉(zhuǎn)棒疲勞儀上，開(kāi)啟電源，以3 min內(nèi)不落降為標(biāo)準(zhǔn)，記錄小鼠的疲勞轉(zhuǎn)棒時(shí)間[11]。

1.3.3 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

連續(xù)給藥第35天時(shí)，末次灌胃給藥30 min后，進(jìn)行力竭負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，對(duì)小鼠進(jìn)行耐力評(píng)估。在小鼠尾部固定5%體重的鉛線，并將各給藥組小鼠輕輕置于水深40 cm、水溫（25±2）℃的恒溫游泳箱中，使其可以自由游泳。小鼠自游泳開(kāi)始至完全沒(méi)入水中7 s，不能露出水面用鼻子進(jìn)行呼吸時(shí)，可認(rèn)為小鼠達(dá)到力竭狀態(tài)，需立即將其打撈，并記錄小鼠力竭游泳時(shí)間[12]。

1.3.4 小鼠血清與組織的采集與制備

負(fù)重游泳小鼠在強(qiáng)迫游泳力竭后，休息30 min，腹腔注射20%的烏拉坦（10 mL/kg）進(jìn)行麻醉，摘除眼球，收集眼球后血管叢血液，血樣靜置10 min后，放入低溫高速離心機(jī)中，在4℃下，以3000r/min離心10min，取上清，重復(fù)1次，將兩次上清合并，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。

取血完畢后，以斷髓方式處死小鼠，并快速解剖取出肝組織和腓腸肌，并制備10%組織勻漿：稱重2 mg肝組織和腓腸肌組織，置于4 mL離心管內(nèi)，按照料液比1∶9（g/mL）加入生理鹽水，冰上充分勻漿。將組織勻漿液放入低溫高速離心機(jī)中，在4℃下以3 000 r/min離心10 min取上清，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。

1.3.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

小鼠血清中 BUN、LA、LDH，肝臟組織中 LG、ROS、MDA、T-SOD，肌肉組織中MG均按照試劑盒說(shuō)明書的方法測(cè)定。

1.3.6 Western Blot檢測(cè)

小鼠肝 AKT、GSK3β、GLUT4蛋白表達(dá)水平采用Western Blot法測(cè)定。稱取部分肝組織，加入蛋白裂解液，勻漿離心，提取總蛋白，并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，分裝樣品，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。樣品蛋白質(zhì)通過(guò)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)模2 h至聚丙二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的三乙醇胺緩沖鹽（tris buffered saline/tween，TBS-T）封閉液中封閉1 h，在4℃下一抗孵育過(guò)夜，用TBS-T洗5次，每次15 min，加入辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗，室溫（10℃～30℃）孵育 1 h，TBS-T洗5次，15min/次，按照化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行曝光，內(nèi)參βactin蛋白與目的蛋白灰度的比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 北蟲草刺五加組合物對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間的影響

疲勞轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)可直觀體現(xiàn)藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠耐力和平衡性的影響，各組小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上停留時(shí)間結(jié)果如表1所示。

表1 不同樣品對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間的影響（n=10，±s）Table 1 Effects of different samples on the rotating rod lasting time in mice（n=10，±s）

表1 不同樣品對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間的影響（n=10，±s）Table 1 Effects of different samples on the rotating rod lasting time in mice（n=10，±s）

注：給藥組與正常對(duì)照組對(duì)比，**表示差異顯著，P<0.01。

組別劑量/（mg/kg）停留時(shí)間/s CON 組 49.8±7.8 LCAC 組 50 84.5±7.4**MCAC 組 100 92.1±8.1**HCAC 組 200 96.8±4.4**

與CON組相比，LCAC組小鼠停留時(shí)間延長(zhǎng)至（84.5±7.4）s，MCAC組小鼠停留時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至（92.1±8.1）s，HCAC組小鼠停留時(shí)間達(dá)到各組最高值（96.8 ±4.4）s，并差異顯著（P<0.01），由此可見(jiàn)，北蟲草刺五加組合物對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒的停留時(shí)間提高較為明顯，同時(shí)具有劑量依賴性，該組合物具有一定的抗疲勞作用。

2.2 北蟲草刺五加組合物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

運(yùn)動(dòng)耐力可直接反映藥物或保健食品的抗疲勞活性，因此，小鼠力竭游泳試驗(yàn)被廣泛用于抗疲勞活性功效檢測(cè)[13]。北蟲草刺五加組合物對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響如表2所示。

表2 不同樣品對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響（n=10，±s）Table 2 Effects of different samples on loading swimming time in mice（n=10，±s）

表2 不同樣品對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響（n=10，±s）Table 2 Effects of different samples on loading swimming time in mice（n=10，±s）

注：給藥組與正常對(duì)照組對(duì)比，**表示差異顯著，P<0.01。

組別劑量/（mg/kg）停留時(shí)間/s CON 組 31.0±3.1 LCAC 組 50 47.5±4.7**MCAC 組 100 50.9±5.3**HCAC 組 200 52.9±3.8**

與CON組相比，LCAC組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間延長(zhǎng)至（47.5±4.7）min，MCAC組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至（50.9±5.3）min，HCAC組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間達(dá)到各組最高值（52.9±3.8）min，并差異顯著（P<0.01）。結(jié)果表明，北蟲草刺五加組合物可以延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間，具有抗疲勞活性，且中、高劑量組抗疲勞活性優(yōu)于低劑量組。

2.3 北蟲草刺五加組合物對(duì)小鼠抗疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能夠擾亂機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化能夠改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性從而阻礙蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，繼而影響肌肉細(xì)胞的正常運(yùn)作，導(dǎo)致疲勞產(chǎn)生[12]，因此，考察物質(zhì)體內(nèi)抗氧化作用的強(qiáng)弱可間接體現(xiàn)其是否具有抗疲勞作用。自由基損傷是機(jī)體產(chǎn)生疲勞的重要原因之一，ROS是細(xì)胞內(nèi)主要的氧自由基，是機(jī)體有氧代謝過(guò)程中的一種副產(chǎn)物，能反映細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)的情況[14]。MDA是機(jī)體自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量可反映細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的程度，此外，機(jī)體長(zhǎng)期處于疲勞狀態(tài)時(shí)，MDA的含量隨之升高，目前，MDA是評(píng)價(jià)疲勞狀況最常用的指標(biāo)之一[15]。T-SOD是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶類，T-SOD可通過(guò)降低機(jī)體內(nèi)自由基的活性，從而有效地減弱其對(duì)機(jī)體的破壞，T-SOD活性的提高能夠延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞[16]。本研究通過(guò)測(cè)定T-SOD活性、ROS和MDA的含量，觀察北蟲草刺五加組合物對(duì)疲勞小鼠作用，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同樣品對(duì)小鼠肝組織氧化相關(guān)指標(biāo)的影響結(jié)果（n=10，±s）Table 3 Effects of different samples on liver oxidation-related indicators（n=10，±s）

表3 不同樣品對(duì)小鼠肝組織氧化相關(guān)指標(biāo)的影響結(jié)果（n=10，±s）Table 3 Effects of different samples on liver oxidation-related indicators（n=10，±s）

注：給藥組與正常對(duì)照組對(duì)比，*表示有差異P<0.05；**表示差異顯著P<0.01；***表示差異極顯著P<0.001。

組別小鼠肝組織相關(guān)指標(biāo)T-SOD/（U/mg prot）MDA/（nmol/mg prot）ROS/（fl/mg prot）CON 組 83.53±1.15 2.39±0.28 67 917.44±4 829.47 LCAC 組 88.28±1.14*** 1.20±0.44*** 61 742.17±4 782.45*MCAC 組 100.4±1.19*** 0.91±0.28*** 58 009.06±5 144.60**HCAC 組 136.08±2.31*** 0.81±0.20*** 56 617.82±4 646.90***

由表3可知，灌胃北蟲草刺五加組合物小鼠運(yùn)動(dòng)后T-SOD水平明顯高于CON組，其中，LCAC組、MCAC組、HCAC組均極顯著高于CON組（3組均P<0.001），而灌胃北蟲草刺五加組合物小鼠運(yùn)動(dòng)后MDA水平均明顯低于CON組，其中，LCAC組、MCAC組、HCAC組均極顯著低于CON組（3組均P<0.001），此外，灌胃北蟲草刺五加組合物小鼠運(yùn)動(dòng)后ROS水平均低于CON組，其中，LCAC組低于CON組（P<0.05），MCAC組顯著低于CON組（P<0.01），HCAC組極顯著低于CON組（P<0.001），呈劑量依賴性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明北蟲草刺五加組合物能夠提高小鼠肝臟中TSOD活力，降低MDA和ROS的含量，一定程度上避免小鼠劇烈運(yùn)動(dòng)后氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，從而減輕小鼠的運(yùn)動(dòng)性疲勞。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定小鼠血清中BUN的含量，考察北蟲草刺五加組合物對(duì)小鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸代謝影響，進(jìn)而觀察其抗疲勞作用，結(jié)果見(jiàn)表4。

機(jī)體在生命活動(dòng)中需要不斷地消耗能量。糖原、脂肪和蛋白質(zhì)是機(jī)體主要的能量物質(zhì)，其中糖原在能量代謝中占主導(dǎo)位，蛋白質(zhì)僅起輔助作用。糖原主要分布于骨胳肌和肝臟，其主要作用是在運(yùn)動(dòng)期間補(bǔ)充血糖消耗，以維持機(jī)體血糖穩(wěn)定。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，血糖轉(zhuǎn)移至肌肉，形成肌糖原，肌糖原分解為肌肉運(yùn)動(dòng)提供能量，從而導(dǎo)致血糖耗盡，此時(shí)，肝糖原氧化分解為葡萄糖，并釋放入血，繼而提供血糖，據(jù)報(bào)道，肝糖原被耗盡時(shí)，機(jī)體會(huì)發(fā)生體力疲勞[17]，因此，肌糖原和肝糖元可作為反映機(jī)體疲勞程度的相關(guān)指標(biāo)。此外，機(jī)體在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌肉組織供氧不足，葡萄糖需通過(guò)無(wú)氧酵解供能，乳酸（lactic acid，LA）是糖酵解過(guò)程的終產(chǎn)物，LA堆積使機(jī)體血液pH值降低，進(jìn)而引起一系列生化改變，如神經(jīng)肌肉結(jié)點(diǎn)處興奮傳遞受阻，形成肌肉酸痛，最終產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞[18]。LA的堆積取決于其產(chǎn)生和消除的速度，LA可在乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的作用下氧化為丙酮酸并進(jìn)入線粒體進(jìn)行三羧酸循環(huán)，從而進(jìn)行消除，減少LA的堆積，減緩機(jī)體疲勞[19]。因此，通常用血清中LA水平和LDH活性反映機(jī)體無(wú)氧代謝能力、疲勞的產(chǎn)生和消除速度。綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定小鼠肝臟中肝糖原（liver cogen，LG）以及腓腸肌中肌糖原（muscle glycogen，MG）的含量，以及血清中LA和LDH的水平，考察北蟲草刺五加組合物對(duì)小鼠體內(nèi)糖原代謝影響，進(jìn)而觀察其抗疲勞作用。

表4 不同樣品對(duì)小鼠血清、肝組織、腓腸肌抗疲勞相關(guān)指標(biāo)的影響結(jié)果Table 4 Effect of different samples on anti-fatigue related indexes of mice serum，liver tissue and gastrocnemius muscle（n=10，±s）

表4 不同樣品對(duì)小鼠血清、肝組織、腓腸肌抗疲勞相關(guān)指標(biāo)的影響結(jié)果Table 4 Effect of different samples on anti-fatigue related indexes of mice serum，liver tissue and gastrocnemius muscle（n=10，±s）

注：給藥組與正常對(duì)照組對(duì)比，*表示有差異P<0.05；**表示差異顯著P<0.01；***表示差異極顯著P<0.001。

組別 血清指標(biāo) 肝臟LG/（mg/g）腓腸肌MG/（mg/g）LA/（mmol/L）LDH/（U/L）BUN/（mmol/L）CON 組 5.10±0.37 526.74±6.07 20.3±1.48 13.55±0.45 3.48±0.37 LCAC 組 4.53±0.55* 538.42±2.68*** 17.18±0.61*** 15.10±0.57*** 4.1±0.36**MCAC 組 3.65±0.39*** 541.60±4.89*** 15.08±1.00*** 15.51±0.41*** 5.27±0.34***HCAC 組 3.02±0.42*** 543.47±5.34*** 13.95±0.65*** 16.28±0.43*** 6.09±0.44***

由表4可知，灌胃北蟲草刺五加組合物低、中、高劑量小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖原LG水平均極顯著高于CON組（3組均P<0.001），同時(shí)灌胃北蟲草刺五加組合物各組小鼠運(yùn)動(dòng)后肌糖原MG水平均明顯高于CON組，其中，LCAC組顯著高于 CON組（P<0.01）、MCAC組、HCAC組均極顯著高于CON組（兩組均P<0.001）。此外，灌胃北蟲草刺五加組合物低、中、高劑量小鼠運(yùn)動(dòng)后血LA水平均低于CON組，其中，LCAC組低于CON組（P<0.05）、MCAC組、HCAC組均極顯著低于CON組（兩組均P<0.001）；灌胃北蟲草刺五加組合物低、中、高劑量小鼠運(yùn)動(dòng)后血清LDH水平均極顯著高于CON組（3組均P<0.001）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，北蟲草刺五加組合物能夠提高小鼠肝糖原和肌糖原的儲(chǔ)備，為其劇烈運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充能量，減緩疲勞發(fā)生，同時(shí)，可通過(guò)提高機(jī)體LDH活性，減少無(wú)氧糖酵解產(chǎn)物L(fēng)A的堆積，從而緩解其疲勞程度。

當(dāng)機(jī)體不斷地消耗能量，糖原和脂肪分解代謝不足以提供充足的能量時(shí)，蛋白質(zhì)分解代謝供能相應(yīng)增強(qiáng)，蛋白質(zhì)和氨基酸在分解代謝中產(chǎn)生氨并在肝臟中轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩?，尿素氮進(jìn)入血液循環(huán)形成血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），最終從腎臟排出體外。BUN含量的增加，可降低機(jī)體對(duì)負(fù)荷適應(yīng)性。據(jù)報(bào)道，運(yùn)動(dòng)后BUN清除越快，則疲勞感消除越快[20]，因此，BUN水平是判斷機(jī)體疲勞程度的主要指標(biāo)之一。

由表4可知，灌胃北蟲草刺五加組合物低、中、高劑量小鼠運(yùn)動(dòng)后BUN水平均極顯著低于CON組（3組均P<0.001）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，北蟲草刺五加組合物對(duì)于運(yùn)動(dòng)所造成的小鼠BUN水平異常升高有良好的調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)機(jī)體在運(yùn)動(dòng)時(shí)維持正常的身體機(jī)能，并在運(yùn)動(dòng)后消除疲勞。

2.4 北蟲草刺五加組合物對(duì)小鼠肝臟中糖代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

北蟲草刺五加組合物對(duì)小鼠肝臟中糖代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)表5和圖2。

表5 不同樣品對(duì)小鼠肝組織中蛋白表達(dá)的影響Table 5 Effect of different samples on the expression of proteins in liver of mice（n=10，±s）

表5 不同樣品對(duì)小鼠肝組織中蛋白表達(dá)的影響Table 5 Effect of different samples on the expression of proteins in liver of mice（n=10，±s）

注：給藥組與正常對(duì)照組對(duì)比，*表示有差異P<0.05，**表示差異顯著P<0.01。

GLUT4/β-actin/% CON 組 58.93 ±3.35 41.79±5.23 43.79±3.27 LCAC 組 75.70±2.13* 49.19±4.37 48.19±2.64 MCAC 組 74.40±3.67* 73.62±3.48** 64.57±2.72**HCAC 組 93.55±2.39** 82.66±4.75** 90.87±3.84**組別 p-AKT/β-actin/% p-GSK3β/β-actin/%

圖2 不同樣品對(duì)小鼠肝組織中蛋白表達(dá)的影響（n=10，±s）Fig.2 Effects of different samples on expression of proteins in liver of mice（n=10，±s）

在肝糖原合成的調(diào)控中，糖原合成酶（glycogen synthase，GS）發(fā)揮重要作用，其中，通過(guò)胰島素介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路可激活GS，進(jìn)而促進(jìn)糖原合成。PKB/AKT的活化能夠增加其下游糖代謝的負(fù)調(diào)節(jié)GSK3β的磷酸化，抑制其活性，并進(jìn)一步解除GSK3β對(duì)于GS的抑制，從而增加GS的活性，促進(jìn)肝細(xì)胞糖原合成[21]。此外，激活的AKT能夠增加細(xì)胞膜中的GLUT4的轉(zhuǎn)位，促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)糖的吸收[22]。因此，PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路的激活及GLUT4的膜轉(zhuǎn)位可促進(jìn)肝臟中糖原的合成，減緩機(jī)體疲勞程度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定小鼠肝臟中 p-AKT（Ser 473）、p-GSK3β（Ser 9）以及GLUT4蛋白的表達(dá)，初步探索考察北蟲草刺五加組合抗疲勞的機(jī)制。

由表5、圖4可知，灌胃北蟲草刺五加組合物低、中、高劑量小鼠運(yùn)動(dòng)后肝臟中p-AKT（Ser 473）、p-GSK3β（Ser 9）以及GLUT4蛋白的表達(dá)量均有所增加，其中LCAC和MCAC組p-AKT（Ser 473）蛋白表達(dá)均高于 CON 組（P<0.05），HCAC 組 p-AKT（Ser 473）蛋白表達(dá)顯著高于CON組（P<0.01）；MCAC和HCAC組p-GSK3β（Ser 9）和GLUT4蛋白表達(dá)均顯著高于CON組（P<0.01），LCAC組與CON組無(wú)差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，北蟲草刺五加組合物能夠通過(guò)促進(jìn)AKT/GSK蛋白的磷酸化，提高GLUT4的表達(dá)，促進(jìn)肝臟中糖原的合成，減緩疲勞發(fā)生。

3 結(jié)論

綜上所述，北蟲草刺五加組合物具有抗疲勞功效，能夠延長(zhǎng)小鼠轉(zhuǎn)棒的停留時(shí)間和力竭游泳時(shí)間，并通過(guò)提高肝臟中T-SOD活力，降低MDA和ROS的含量，減輕機(jī)體因高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激損傷，通過(guò)增加肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備，提高機(jī)體LDH活性，降低LA堆積，以及降低BUN產(chǎn)生，減緩疲勞發(fā)生。機(jī)制研究顯示，北蟲草刺五加組合物能夠通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)GSK3β磷酸化，并增加GLUT4的表達(dá)，提高肝原糖的合成，從而發(fā)揮抗疲勞的作用。