近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)嚴(yán)建兵教授及國(guó)內(nèi)外多家合作單位的研究成果以“High throughput CRISPR/Cas9 mutagenesis streamlines trait gene identification in maize”為題在The Plant Cell期刊發(fā)表，研究提出構(gòu)建基于先驗(yàn)知識(shí)的靶向突變體庫(kù)（knowledge-driven targeted mutagenesis），可以大大加速功能基因的挖掘。

挖掘影響重要性狀的基因是作物遺傳改良的關(guān)鍵路徑之一。然而，當(dāng)前基因克隆的方法大多費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率較低，難以滿足全球日益增長(zhǎng)的對(duì)糧食總量及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)提升的需求。當(dāng)前挖掘功能基因主要有兩種方法：一是構(gòu)建各種群體通過(guò)連鎖或關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行遺傳定位，二是借助隨機(jī)突變體庫(kù)通過(guò)對(duì)表型的大規(guī)模篩選進(jìn)而鑒定功能基因。遺傳定位十分耗時(shí)耗力，即便被寄予厚望的關(guān)聯(lián)分析也很難達(dá)到預(yù)期單基因水平的精度，依舊需要發(fā)展新的群體進(jìn)行精細(xì)定位，且發(fā)展的特定群體一般僅能針對(duì)特定性狀的特定QTL（Quantitative Trait Locus）?；谏铩⒒瘜W(xué)乃至物理技術(shù)所構(gòu)建的突變體庫(kù)已被廣泛用于作物基因挖掘，然而這一方法常常需要群體大面積種植后進(jìn)行目標(biāo)表型篩選，而缺少針對(duì)性，即便篩選到目標(biāo)表型由于單個(gè)突變植株往往攜帶數(shù)十個(gè)乃至上百個(gè)突變位點(diǎn)，依舊需要進(jìn)一步發(fā)展群體進(jìn)行功能基因篩選及驗(yàn)證。這些不足造成當(dāng)前基因克隆整體效率較低，無(wú)法通量化，成本較高。

近年來(lái)CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于靶向性及特異性非常高、操作簡(jiǎn)單快捷等優(yōu)勢(shì)已被廣泛用于各種物種的基因編輯，并已在水稻和大豆中實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的突變體資源的創(chuàng)制。但這些大規(guī)?；蚓庉嫷难芯恐饕獙RISPR/Cas9作為傳統(tǒng)突變手段的替代品，如何針對(duì)植物特性完善從靶標(biāo)設(shè)計(jì)到突變序列檢測(cè)全流程的高通量體系、降低成本、挖掘這一新興技術(shù)應(yīng)用后對(duì)基因組影響的規(guī)律等缺乏深入研究。特別是由于玉米基因組龐大復(fù)雜、可穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的品系有限、轉(zhuǎn)化效率較低等問(wèn)題，以玉米為代表探索建立相應(yīng)體系更具挑戰(zhàn)性，也更具廣泛借鑒性。

本研究中作者提出了綜合傳統(tǒng)遺傳定位和高通量靶向基因編輯加速玉米功能基因挖掘的思路，這一設(shè)想在于充分利用CRISPR/Cas9高度特異和靶向性的同時(shí)，借助先前的定位線索為每一個(gè)靶向基因提供預(yù)期的潛在表型。該研究包括三方面亮點(diǎn)。

一是探索并完善了基于CRISPR/Cas9的高通量的技術(shù)體系，大大降低了成本。例如，課題組前期完成了適用于非參考基因組高通量設(shè)計(jì)sgRNA的流程;完成了覆蓋目標(biāo)基因所需轉(zhuǎn)化事件的設(shè)計(jì)和模擬分析;通過(guò)改進(jìn)MassARRAY和靶向捕獲測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量和低成本的靶標(biāo)突變序列鑒定。

二是基于先驗(yàn)知識(shí)的靶向突變體庫(kù)是玉米功能基因挖掘的有益資源。研究人員利用近期CUBIC群體所獲大量初定位QTL及其他重要候選基因，進(jìn)行了1000多個(gè)候選基因的大規(guī)模實(shí)驗(yàn)。通過(guò)調(diào)查QTL區(qū)間所有基因突變體的表型就可以鑒定到功能基因，省去了繁雜的精細(xì)定位過(guò)程。研究人員不僅利用所獲靶向突變體庫(kù)對(duì)遺傳定位的共驗(yàn)證，還分析了同一QTL鑒定到多個(gè)功能基因、更豐富的非預(yù)期突變表型的獲得、基因冗余導(dǎo)致編輯后未有預(yù)期表型等多個(gè)案例，揭示了傳統(tǒng)基因定位克隆手段難以發(fā)現(xiàn)的科學(xué)現(xiàn)象和規(guī)律，展現(xiàn)了這一靶向突變體庫(kù)的重要價(jià)值。

三是增加了對(duì)植物基因編輯規(guī)律的認(rèn)識(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)植物基因編輯突變譜與人類細(xì)胞系一樣，且具有較高的可預(yù)測(cè)性。目標(biāo)基因的表達(dá)模式對(duì)編輯產(chǎn)物有顯著影響。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)一定頻率的以體內(nèi)異源（不同染色體）模板進(jìn)行同源重組介導(dǎo)的基因修復(fù)（homology-directed repair）現(xiàn)象，為基因敲入提供了新的思路。研究人員指出作物基因編輯過(guò)程中的脫靶頻率很低，但嵌合現(xiàn)象以及由于基因冗余帶來(lái)的額外靶點(diǎn)的存在值得高度重視。

同期的The Plant Cell雜志以“作物大規(guī)?；蚪M編輯的路線圖（A Roadmap Toward Large-Scale Genome Editing in Crops）”為題配發(fā)評(píng)論，認(rèn)為作者漂亮地展示了如何利用新的工具來(lái)進(jìn)行基因發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，總結(jié)了多個(gè)應(yīng)用場(chǎng)景，并稱該方法為“暴力破解方法（Brute-force approaches）”。

（來(lái)源：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)站）