周琪，劉小萍，薄凱亮，苗晗，董邵云，顧興芳，張圣平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

0 引言

【研究意義】葉酸是人體生命活動(dòng)必需的水溶性B族維生素，其分子由蝶啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸殘基三部分組成[1]。根據(jù)取代基的不同，葉酸分為不同的種類，目前在動(dòng)植物中已發(fā)現(xiàn)的葉酸種類有50多種[2-3]。葉酸參與核苷酸的生物合成、氨基酸代謝和甲基化循環(huán)，是細(xì)胞內(nèi)主要的甲基供體，對(duì)DNA的合成、甲基化和修復(fù)至關(guān)重要[4-6]。美國(guó)食品和營(yíng)養(yǎng)委員會(huì)推薦葉酸的攝取量成年人為400 μg·d-1，孕婦為600 μg·d-1。葉酸缺乏會(huì)引發(fā)巨幼紅細(xì)胞貧血和老年人認(rèn)知功能障礙等疾病[7-8]。但人體無(wú)法自身合成葉酸，必須依賴飲食攝入。與水稻、谷子等作物相比，蔬菜中葉酸含量較高，成為人體攝入葉酸的主要來(lái)源[9-10]。由于烹飪加熱過(guò)程會(huì)導(dǎo)致葉酸降解[11-13]，黃瓜以生食為主，能使其含有的葉酸不經(jīng)烹飪降解而最大限度地保留，被人體吸收利用，成為人體補(bǔ)充葉酸的最佳選擇之一。黃瓜中葉酸合成代謝的分子生物學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，研究黃瓜果實(shí)的葉酸合成代謝具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物中葉酸代謝途徑分為喋啶分支和pABA分支[3]。GTP在細(xì)胞質(zhì)中形成喋啶，ADC在葉綠體中裂解生成pABA，隨后二者被轉(zhuǎn)入線粒體中形成二氫蝶酸，經(jīng)谷氨酸化和還原反應(yīng)形成四氫葉酸，最后通過(guò)加尾作用形成多尾葉酸[14-15]。在蝶啶分支中，GTP環(huán)化水解酶（GTPCHI）是催化第一步反應(yīng)的酶，也是該分支的限速酶，調(diào)控該酶的基因?yàn)镚CHI[16-18]。在pABA分支中，氨基脫氧分支酸合酶（ADCS）是其限速酶[19]，由基因ADCS調(diào)控合成。GTP環(huán)化水解酶與氨基脫氧分支酸合酶被認(rèn)為是限制植物葉酸合成途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶[20]。黃瓜是我國(guó)的重要蔬菜作物，尤其在設(shè)施生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位，2017年收獲面積為123.52萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)到6 482.46萬(wàn)t[21]。我國(guó)黃瓜以鮮食為主，能使其含有的葉酸得到最大限度的保留而被人體吸收利用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】模式植物擬南芥中葉酸合成代謝相關(guān)研究較為深入，關(guān)于黃瓜葉酸代謝調(diào)控以及葉酸合成關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá)分析尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究參考擬南芥調(diào)控葉酸合成代謝基因的蛋白序列，BLAST得到黃瓜的同源基因，并完成其在染色體上的定位。利用熒光定量PCR技術(shù)分析這些基因在測(cè)序黃瓜果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期以及果實(shí)葉酸含量高低差異顯著的2份材料中的表達(dá)量。通過(guò)蛋白序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)域分析以及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，分析調(diào)控葉酸合成限速步驟的關(guān)鍵酶基因的序列保守性，并克隆這兩個(gè)關(guān)鍵酶基因，分析其序列在不同材料中的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究試驗(yàn)材料為完成全基因測(cè)序的黃瓜自交系9930，以及果實(shí)葉酸含量高低差異顯著的2份自交系5G（低）和02245（高）。試驗(yàn)材料于2018年春、秋兩季種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口試驗(yàn)基地連棟大棚（北京），前期正常管理，9930黃瓜果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期葉酸含量測(cè)定：開(kāi)花前2 d、開(kāi)花當(dāng)天、開(kāi)花后7 d、開(kāi)花后14 d、開(kāi)花后21 d果實(shí)中的葉酸含量。65G和02245的果實(shí)葉酸含量測(cè)定在植株盛瓜期取樣，且選取植株中部節(jié)位、大小合適的商品瓜。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃瓜葉酸合成代謝相關(guān)基因鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[8]和TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.arabidopsis.org/）獲得擬南芥與葉酸合成代謝相關(guān)基因的蛋白序列，利用BLAST方法在黃瓜9930_V3基因組上尋找相似性較高的同源基因。再通過(guò)BLAST，將這些基因比對(duì)到擬南芥TAIR10基因組中，獲取具體的基因名稱。采用MapChart軟件繪制黃瓜葉酸代謝相關(guān)基因在染色體上的物理位置。

1.2.2 黃瓜材料取樣方式及葉酸含量測(cè)定 每一份材料3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取3條瓜，每個(gè)瓜上、中、下部位切取3個(gè)薄片，用液氮速凍。同一個(gè)生物學(xué)重復(fù)的樣品混合均勻并研磨成粉末，利用雙酶法提取葉酸，利用液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定葉酸含量[22]。

1.2.3 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 果實(shí)取樣后用錫箔紙包裹于液氮中速凍，然后用研缽將其研磨成粉末。根據(jù)TaKaRa的RNA提取試劑盒提取RNA，利用Nanodrop2000核酸儀檢測(cè)其濃度，并經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)其完整性，質(zhì)量合格的RNA可觀察到兩條清晰明亮的帶型。之后取適量的RNA，同時(shí)使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.4 黃瓜葉酸合成基因在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期及不同材料中的表達(dá)量分析 以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以黃瓜中穩(wěn)定表達(dá)的基因（Csa_2G301530）為內(nèi)參基因，針對(duì)基因功能序列分別設(shè)計(jì)引物（附表2），盡量保證引物無(wú)二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。利用TaKaRa SYBR?Premix Ex Taq?II試劑盒（北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司）對(duì)9930果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期以及果實(shí)葉酸含量高低差異顯著的65G和02245中的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，采用F=2-△△Ct法分析其表達(dá)量[23]。

1.2.5 黃瓜葉酸合成關(guān)鍵酶基因的蛋白序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 從NCBI上搜索各物種葉酸合成關(guān)鍵酶GTPCHI及ADCS同源基因的蛋白序列，利用MEGA軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用在線軟件（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）對(duì)5個(gè)結(jié)構(gòu)域氨基酸保守性進(jìn)行分析。

1.2.6 黃瓜GCHI及ADCS的克隆與序列分析 根據(jù)黃瓜基因組網(wǎng)站信息（http://cucurbitgenomics.org/organism/3），利用primer 5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增兩個(gè)基因（附表1）。建立20 μL的擴(kuò)增體系，利用高保真酶（南京諾維贊）對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件為，95℃預(yù)變性3 min，95℃變性 15 s，60℃退火 15 s，72℃延伸 3 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，10℃保存。每個(gè)擴(kuò)增的基因盡量包含部分3′UTR和5′UTR序列，對(duì)于序列過(guò)長(zhǎng)的基因設(shè)計(jì)多對(duì)引物，分段擴(kuò)增，每段接頭部分有大于100 bp的重合。

擴(kuò)增產(chǎn)物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，送至上海生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果拼接后，比對(duì)分析同一基因在不同材料中的序列差異。

1.2.7 基因的生物信息學(xué)分析 利用在線軟件Expasy（https://www.expasy.org/）預(yù)測(cè)黃瓜CsGCHI及CsADCS編碼蛋白的等電點(diǎn)及分子量等，利用在線工具WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位情況。

2 結(jié)果

2.1 黃瓜葉酸合成相關(guān)基因

擬南芥中已報(bào)道的與葉酸代謝相關(guān)的酶共14個(gè)，其中大部分酶參與葉酸合成過(guò)程，其余為葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)子或與葉酸降解相關(guān)（表1）。其中羥甲基二氫蝶呤焦磷酸激酶（HPPK）/二氫蝶呤合成酶（DHPS）是一個(gè)雙功能酶，催化兩步連續(xù)的反應(yīng)[10]。通過(guò)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲取擬南芥中調(diào)控這些酶的基因序列，經(jīng)BLAST比對(duì)尋找黃瓜中的同源基因。得到19個(gè)黃瓜中與葉酸代謝相關(guān)的基因，其中有11個(gè)（標(biāo)*）參與合成途徑，包含了葉酸從頭合成的全部反應(yīng)。

2.2 基因的染色體定位

根據(jù)各基因在染色體上的物理位置，利用MapChart軟件繪制黃瓜染色體物理圖譜并進(jìn)行基因定位（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這19個(gè)基因不均勻分布在黃瓜的7條染色體上，其中，4號(hào)和5號(hào)染色體上最多（4個(gè)），1號(hào)和3號(hào)染色體次之（3個(gè)），2、6號(hào)染色體較少（2個(gè)），7號(hào)染色體最少（1個(gè)）。除基因CsaV3_2G011840（D）、CsaV3_2G014940（E）、CsaV3_3G021950（F）外，其余大多分布在染色體長(zhǎng)、短臂的兩端。

表1 黃瓜葉酸合成相關(guān)基因Table 1 Folate metabolism related genes in cucumber

圖1 黃瓜中葉酸合成相關(guān)基因在染色體上的位置Fig.1 The position on the chromosome of genes involving in folate synthesis in cucumber

2.3 9930果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期葉酸含量及對(duì)應(yīng)時(shí)期的葉酸合成基因的表達(dá)量

測(cè)定黃瓜自交系9930果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的葉酸含量（圖2-a），結(jié)果表明，開(kāi)花當(dāng)天葉酸含量最高，為42.16 μg/100 g FW，開(kāi)花21 d的葉酸含量最低，為21.76 μg/100 g FW。葉酸含量的規(guī)律表現(xiàn)為，在開(kāi)花之前呈上升趨勢(shì)，開(kāi)花當(dāng)天達(dá)到最高，開(kāi)花之后呈下降趨勢(shì)。

圖2 黃瓜葉酸合成基因在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量Fig.2 The expression level of folate synthetic genes in cucumber fruit at different stages

分析與葉酸合成相關(guān)的11個(gè)基因在9930果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量，從表達(dá)量變化趨勢(shì)來(lái)看，在同源基因中，CsGCHI1與CsGCHI2（圖 2-c、d）、CsADCL1與CsADCL2（圖2-g、h）的趨勢(shì)一致。CsDHFR1的表達(dá)量在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，而CsDHFR2先上升后下降（圖2-e、f）。在開(kāi)花前，除基因CsDHFR1（圖2-e）外的其他基因表達(dá)量均上升，與總?cè)~酸含量呈正相關(guān)。在開(kāi)花之后，基因CsDHFR1、CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS、CsDHNA在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖2-b、e、j、l）。在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，基因CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS、CsDHNA、CsADCS與葉酸含量變化趨勢(shì)完全一致（圖2-b、i、j、l）。

2.4 果實(shí)葉酸含量高低差異顯著材料65G和02245中基因的表達(dá)量分析

分別在2018年春季和2018年秋季測(cè)定核心種質(zhì)群體[24]葉酸含量，從中挑選出在兩季中葉酸含量比較穩(wěn)定的兩份材料65G及02245，65G果實(shí)的平均葉酸含量為21.75 μg/100 g，02245果實(shí)的平均葉酸含量36.15μg/100g。差異顯著性分析表明，兩者總?cè)~酸含量具有顯著差異，且65G總低于02245（圖3-a）。測(cè)定11個(gè)葉酸合成相關(guān)基因在65G及02245中的表達(dá)量，分析發(fā)現(xiàn)，基因CsADCL1、CsADCL2、CsDHNA、CsFPGS的表達(dá)量具有顯著差異，基因CsADCS、CsDHFS、CsHPPK/CsDHPS表達(dá)量具有極顯著差異（圖3-b），且這些基因均在02245中高表達(dá)，與葉酸含量正相關(guān)。

2.5 黃瓜及其他物種GCHI蛋白質(zhì)序列分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

在細(xì)胞質(zhì)中，GTPCHI催化GTP合成甲酸和二氫蝶呤三磷酸，這一反應(yīng)是真核生物合成葉酸喋啶分支的第一步反應(yīng)，也是該分支的限速步驟[16-18]。黃瓜中控制GTPCHI合成的同源基因是CsaV3_1G041250和CsaV3_7G026240（表1）。這兩個(gè)基因與擬南芥中該基因蛋白質(zhì)序列的一致性分別為60%和61%（圖4-a）。利用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析得到除黃瓜外8個(gè)物種中該基因的蛋白序列，利用MEGA6中的Clustal W對(duì)蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，各物種中GCHI同源基因均含有兩個(gè)GTP_cyclohydroI結(jié)構(gòu)域，且無(wú)論是單子葉植物水稻、玉米還是雙子葉植物擬南芥中，該蛋白的結(jié)構(gòu)域高度保守，說(shuō)明它們可能來(lái)自共同的祖先（圖4-b）。

對(duì)各物種GCHI的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（圖4-c），發(fā)現(xiàn)同一物種或親緣關(guān)系較近的物種聚在一起，黃瓜首先與其他葫蘆科作物甜瓜、西瓜等聚在一起，說(shuō)明該基因在親緣關(guān)系較近的物種中進(jìn)化是保守的，可能行使著相同或相近的功能。

2.6 黃瓜及其他物種ADCS蛋白質(zhì)序列分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

在葉綠體中，ADCS催化葉酸前體4-氨基-4-脫氧絡(luò)合物（ADC）的生物合成，該步驟是pABA分支的限速步驟[14]，黃瓜中控制該酶合成的同源基因是CsaV3_5G036360。CsaV3_5G036360與擬南芥該基因蛋白序列的一致性為57%。同樣通過(guò)BLAST找到除黃瓜外10個(gè)物種中該基因的同源蛋白序列，蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ADCS含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括2個(gè)GATase，1個(gè)Chorismate_bind和1個(gè)Anth_synt_I_N結(jié)構(gòu)域（圖5-a），這4個(gè)結(jié)構(gòu)域在不同物種中高度保守（圖5-b—e）。

圖3 不同材料葉酸含量及基因表達(dá)量分析Fig.3 The folate content in 65G and 02245 and the expression level of folate metabolism related genes

圖5 黃瓜及其它物種ADCS蛋白序列比對(duì)以及進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Protein sequences alignment and evolutionary-tree generation of ADCS in cucumber and other species

從ADCS同源蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中可以看到，這個(gè)基因在進(jìn)化的過(guò)程中十分保守，遵循單子葉植物同源蛋白聚類到一起，雙子葉植物同源蛋白聚類到一起的進(jìn)化原則。黃瓜與同屬葫蘆科的甜瓜等聚類到一起（圖5-f）。表明這個(gè)基因在不同植物中的功能比較保守，都催化葉酸前體的合成。

2.7 黃瓜GCHI與ADCS基因全長(zhǎng)的克隆與序列分析

分別擴(kuò)增果實(shí)葉酸含量高低差異顯著的65G和02245中調(diào)控葉酸合成限速步驟的關(guān)鍵酶基因GCHI和ADCS的序列。結(jié)果表明，在兩份材料中，CsaV3_1G041250全長(zhǎng)均為3 012 bp，CDS長(zhǎng)度均為1 413 bp（附圖1）。在兩份材料中有多個(gè)SNP差異位點(diǎn)，有7處變異發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域，CDS區(qū)有3處突變未引起蛋白質(zhì)序列的改變，有3處SNP的突變導(dǎo)致了氨基酸序列的改變，第2 474 bp處，65G與02245編輯的氨基酸分別為天冬酰胺和蘇氨酸，第2 669 bp處分別為絲氨酸和酪氨酸，第3 018bp處分別為丙氨酸和纈氨酸（圖6）。在兩份材料中，CsaV3_7G026240全長(zhǎng)均為3047bp，CDS長(zhǎng)度均為1407bp，在內(nèi)含子區(qū)有一個(gè)變異，氨基酸序列無(wú)差異（附圖2）；Csa5G623430全長(zhǎng)均為7 941 bp，CDS長(zhǎng)度均為2 706 bp，變異均發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域，氨基酸序列無(wú)差異（附圖3）。

2.8 黃瓜GCHI與ADCS基因的生物信息學(xué)分析

黃瓜CsGCHI及CsADCS編碼蛋白的等電點(diǎn)（pI）及分子量預(yù)測(cè)結(jié)果表明CsGCHI等電點(diǎn)理論值為6.38，編碼468個(gè)氨基酸，估計(jì)分子量51.621 kD，總平均親水性為-0.350，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白。CsGCHI蛋白分子不穩(wěn)定參數(shù)為37.90，小于40，因此該蛋白是穩(wěn)定蛋白。CsADCS等電點(diǎn)理論值為5.88，編碼901個(gè)氨基酸，估計(jì)分子量101.17 kD，總平均親水性為-0.350，該蛋白為親水性蛋白。CsADCS蛋白分子不穩(wěn)定參數(shù)為44.31，大于40，因此該蛋白是不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位情況預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CsGCHI蛋白最可能定位于高爾基體,而CsADCS蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大。

圖6 黃瓜CsaV3_1G041250基因在65G、02245中的序列差異Fig.6 The sequence difference of CsaV3_1G041250 between 65G and 02245

3 討論

擬南芥中已報(bào)道的與葉酸代謝相關(guān)的酶有14個(gè)，分別由26個(gè)基因調(diào)控[8]。學(xué)者們利用同源比對(duì)來(lái)尋找其他作物中與葉酸代謝相關(guān)的基因，其中水稻中14個(gè)，番茄中10個(gè)。本研究獲得19個(gè)黃瓜葉酸代謝相關(guān)基因，其中11個(gè)參與葉酸合成，包括了葉酸從頭合成的全部反應(yīng)過(guò)程。這19個(gè)基因在黃瓜7條染色體上均有分布，且大多位于染色體長(zhǎng)、短臂兩端。對(duì)番茄果實(shí)葉酸合成基因表達(dá)模式的研究發(fā)現(xiàn)，基因GCHI、ADCS和ADCL隨著果實(shí)成熟，其表達(dá)量逐漸降低，基因DHFR和DHFS的表達(dá)在果實(shí)發(fā)育后期顯著升高，而其他基因在不同發(fā)育階段變化不明顯[25]。在小麥種子發(fā)育過(guò)程中，基因GCHI、ADCS的表達(dá)量逐步下降，基因FPGS在種子5—30 d的表達(dá)量維持恒定，而后迅速降低[20]。在水稻中，GCHI、ADCS和HPPK均在開(kāi)花期表達(dá)最高（不同時(shí)期表達(dá)變化5—6倍），在乳熟期（5—10 DPA）至種子成熟時(shí)期，這3個(gè)基因的表達(dá)又逐步回升。FPGS在抽穗期表達(dá)量最高而后逐步下降[26]。本研究中，在開(kāi)花之前，CsDHFR1＞CsDHFR2；在開(kāi)花之后，CsDHFR1＜CsDHFR2。推測(cè)CsDHFR1在開(kāi)花之前起主要作用，CsDHFR2在開(kāi)花之后起主要作用。在黃瓜中，基因CsADCS、CsGCHI、CsHPPK/CsDHFS與水稻中這些基因的表達(dá)趨勢(shì)類似，在開(kāi)花當(dāng)天表達(dá)量最高；基因CsFPGS也與小麥和水稻中類似，在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，推測(cè)它們可能受相同或相近的模式調(diào)控。尤為重要的是，黃瓜中存在與果實(shí)葉酸含量變化趨勢(shì)完全一致的基因CsDHNA、CsHPPK/CsDHFS、CsFPGS以及CsADCS，推測(cè)它們對(duì)不同時(shí)期葉酸含量變化趨勢(shì)起主要作用。

葉酸合成分為pABA分支和喋啶分支，pABA分支包括兩步反應(yīng)，分支酸和谷氨酰胺在氨基脫氧分支酸合成酶（ADCS）的催化下生成氨基脫氧分支酸，其產(chǎn)物在氨基脫氧分支酸裂解酶（ADCL）的催化下合成對(duì)氨基苯甲酸（pABA）[27]。黃瓜中調(diào)控這兩步反應(yīng)的基因CsADCS、CsADCL表達(dá)量在65G與02245中均具有顯著差異。喋啶分支包括4步反應(yīng)，GTP在GTPCHI的催化下形成二氫新蝶呤三磷酸（DHN-P3），DHN-P3經(jīng)兩步去磷酸化反應(yīng)生成二氫新蝶呤（DHN），DHN的側(cè)鏈在二氫新蝶呤醛縮酶（DHNA）的作用下被切除，釋放出二氫蝶啶（HMPHP）[28]。在黃瓜中，調(diào)控這4步反應(yīng)的基因僅CsDHNA在65G與02245中具有顯著差異。

隨后，pABA分支和喋啶分支的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入線粒體中合成四氫葉酸。首先二氫蝶啶在二氫蝶啶焦磷酸激酶（HPPK）的催化下生成具有活性的焦磷酸鹽化合物，然后與pABA在二氫蝶酸合酶（DHPS）的催化作用下形成二氫蝶酸（DHP）。隨后在二氫葉酸合成酶（DHFS）的催化下形成單尾形式的二氫葉酸。二氫葉酸分別在二氫葉酸還原酶（DHFR）和葉酰多谷氨酰合成酶（FPGS）的催化下形成多尾形式的四氫葉酸[29]。黃瓜中調(diào)控這幾步反應(yīng)的基因中，CsHPPK/CsDHPS、CsDHFS、CsFPGS的表達(dá)量在 65G與02245中具有顯著差異。在整個(gè)葉酸合成通路中有6個(gè)基因在65G與02245具有顯著差異，且在葉酸含量高的材料中，差異基因的表達(dá)量也高，基因的表達(dá)量與葉酸含量呈正相關(guān)。

葉酸的強(qiáng)化主要依靠過(guò)量表達(dá)葉酸合成過(guò)程中的酶實(shí)現(xiàn)，GTPCHI和ADCS分別是葉酸合成過(guò)程中喋啶分支和PABA分支的限速酶[20]。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者將控制這兩個(gè)酶的基因在擬南芥[30]、番茄[31]、水稻[32]中過(guò)量表達(dá)，葉酸含量均得到了顯著提高。因此，在植物中過(guò)量表達(dá)控制這兩個(gè)酶的基因，是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物中葉酸含量的有效途徑。本研究中，黃瓜CsGCHI兩個(gè)同源基因氨基酸序列與擬南芥中該酶氨基酸序列的同源性較高。氨基酸序列比對(duì)以及結(jié)構(gòu)域分析表明，GTPCHI的結(jié)構(gòu)在整個(gè)進(jìn)化過(guò)程中得到了很好的保存。擴(kuò)增兩份不同材料中CsGCHI基因序列，在CDS區(qū)找到6個(gè)SNP位點(diǎn)的差異，其中有3個(gè)導(dǎo)致了氨基酸序列的改變，且都發(fā)生在具有GTPCHI催化活性的保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)，但是該基因的表達(dá)量沒(méi)有差異。推測(cè)該基因可能通過(guò)氨基酸序列的改變行使功能，并進(jìn)一步影響葉酸含量。黃瓜CsADCS氨基酸序列與擬南芥中該酶氨基酸序列同源性較高，各物種中該基因的蛋白序列高度保守且都具有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，可能行使相同或相似的功能。

4 結(jié)論

本研究成功鑒定出19個(gè)不均勻分布在7條染色體上的黃瓜葉酸代謝相關(guān)基因，基因CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS、CsDHNA和CsADCS是影響黃瓜果實(shí)葉酸含量變化，導(dǎo)致葉酸含量高低顯著差異的關(guān)鍵基因。調(diào)控葉酸合成限速步驟的關(guān)鍵酶基因CsGCHI及CsADCS功能相對(duì)保守，CsGCHI在黃瓜65G、02245中有3個(gè)SNP位點(diǎn)的突變導(dǎo)致了氨基酸序列的差異。本研究明確了相關(guān)基因在黃瓜果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期以及不同材料中的表達(dá)量差異，分析了關(guān)鍵酶基因的序列差異，為揭示黃瓜葉酸合成代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所公共實(shí)驗(yàn)室韓麗妲老師及實(shí)驗(yàn)室成員萬(wàn)幸、楊敏等對(duì)黃瓜果實(shí)葉酸含量測(cè)定提供的幫助！