彭 姣，張彩猛，孔祥珍，華欲飛，陳業(yè)明

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

芝麻是我國重要的油料作物之一。目前芝麻油的生產(chǎn)方法主要有水代法和壓榨法[1]。水代法主要是通過高溫炒籽使蛋白質(zhì)變性，經(jīng)石磨研磨后加水，利用油料中非油成分對油和水的親和力的不同以及油水密度差得到油。水代法得到的油香味濃郁，但是蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重，可利用率低。壓榨法又分為熱榨法和冷榨法。熱榨法出油率高，但蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重。冷榨法得到的餅變性程度低，最大程度保留了油中的熱敏性營養(yǎng)成分，但出油率低，需要多級壓榨提高出油率[2]。

基于綠色、健康、安全的特點(diǎn)，水酶法制取芝麻油開始在實(shí)驗(yàn)室被廣泛研究[3]。水酶法主要是利用商業(yè)蛋白酶水解阻止油釋放的蛋白，使油能夠聚集破乳。其中破壞的一部分蛋白就是油體蛋白。脂肪主要存貯在油體中[4]。油體蛋白與單分子磷脂組成生物膜將脂肪包裹住[5]。油體蛋白主要包括油質(zhì)蛋白(oleosin)、油體鈣蛋白(caleosin)和油體固醇蛋白(steroleosin)[6]。商業(yè)蛋白酶把油體蛋白和吸附在油體外的油體外源性蛋白水解后，油從油體內(nèi)部被釋放出來。水酶法的優(yōu)點(diǎn)是低溫保證了蛋白質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)不被破壞，缺點(diǎn)是需要添加商業(yè)酶，需要維持一定的pH和溫度，經(jīng)濟(jì)成本高[7]，且將蛋白質(zhì)水解成肽，要想利用肽需要進(jìn)行脫鹽脫色等工序，步驟煩瑣且成本高。

近年來有文獻(xiàn)報(bào)道在植物種子內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)源性蛋白酶，且發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性蛋白酶能夠水解油體蛋白和油體外源性蛋白，而且這種水解有利于破乳。在大豆油體中，發(fā)現(xiàn)存在水解24 kDa和18 kDa油質(zhì)蛋白的半胱氨酸蛋白酶，能夠促進(jìn)破乳[8]。在花生中也發(fā)現(xiàn)存在一種天冬氨酸蛋白酶，可以在一定條件下水解油體中的油體外源性蛋白和油體蛋白，并發(fā)現(xiàn)在花生紅衣和內(nèi)源性蛋白酶的協(xié)同作用下，使得粗油體破乳率高達(dá)87%[9]。有研究人員通過添加酶抑制劑發(fā)現(xiàn)在芝麻發(fā)芽時(shí)有絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶活性表征[10]。近年來有研究表明芝麻油質(zhì)蛋白在35℃和pH 6.5時(shí)被未知的內(nèi)源性蛋白酶水解得很快。電泳條帶的變化表明，油質(zhì)蛋白在約9 h時(shí)幾乎完全消失，在特定水解條件下破乳率高達(dá)98%[8]。但是對于芝麻油體蛋白酶的性質(zhì)以及影響內(nèi)源性蛋白酶破乳的因素還未有人探究。本文利用離心將生芝麻漿分為3層：上浮層、清液層和沉淀層。上浮層為粗油體層，用于油的提取，沉淀層可以作為品質(zhì)和色澤較好的蛋白產(chǎn)品。本文主要是通過電泳探究粗油體中內(nèi)源性蛋白酶的水解最適pH及溫度，在此條件下以破乳效果評價(jià)破乳pH、水解時(shí)間、固形物含量、粒徑及蛋白質(zhì)含量對油體破乳的影響，為降低經(jīng)濟(jì)成本，不添加商業(yè)蛋白酶的水酶法提油提供工藝基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

芝麻(水分含量(5.86±0.19)%，蛋白質(zhì)含量(19.00±0.12)%，粗脂肪含量(47.16±0.21)%)，購于河南省駐馬店市；蔗糖、氫氧化鈉、鹽酸為分析純，購于國藥集團(tuán)；尼羅紅、異硫氰酸熒光素(FITC)以及其他電泳試劑，購于美國Sigma公司；10～250 kDa標(biāo)準(zhǔn)蛋白，購于美國Bio-Rad公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

上海瀘西90型磁力攪拌器，梅特勒臺(tái)式pH計(jì)，九陽JYL-Y5破壁料理機(jī)，日本Himac CR-21GⅡ冷凍離心機(jī)，Mini-PROTEAN型垂直電泳儀，ChemiDoc XRS+凝膠成像儀，美國安捷倫Agilent 1100高效液相色譜儀，美國布魯克多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀，德國徠卡TCS-P8激光共聚焦顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗油體的制備

將芝麻浸泡于其5倍質(zhì)量的去離子水中，于4℃放置18 h。后經(jīng)手工脫皮，再用20%的蔗糖浮選，挑選去皮后的芝麻仁，用去離子水水洗3遍后，按照芝麻仁與去離子水質(zhì)量比1∶4添加新鮮的去離子水，使用破壁料理機(jī)以18 000 r/min的速度打漿2 min，用四層紗布過濾除去濾渣，濾液即為生芝麻漿。將生芝麻漿置于冷凍離心機(jī)中，保持4℃，4 000 r/min離心15 min，收集上浮層，即為粗油體。測得粗油體中固形物含量為61.86%，蛋白質(zhì)含量為1.35%。

1.2.2 不同粒徑粗油體的制備(見圖1)

參照圖1，進(jìn)行不同粒徑的粗油體的制備，以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同粒徑粗油體的制備流程

1.2.3 不同蛋白質(zhì)含量粗油體的制備

將1.2.1制備的粗油體分成兩份，一份作為樣品1，一份按照1∶9添加去離子水，置于4℃、6 500 r/min離心20 min，取上浮。再將上浮分成兩份，一份作為樣品2，一份按照1∶9添加去離子水，置于4℃、6 500 r/min離心20 min，取上浮，作為樣品3。將3份樣品稀釋至固形物含量為50%，并測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 Tricine-SDS-PAGE

將0.5 mL Tricine-SDS-PAGE樣品緩沖液(0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)，1% SDS，2%巰基乙醇(非還原電泳不添加)和0.02%溴酚藍(lán))與0.5 mL樣品稀釋液混合[11]，置于沸水中煮3 min，作為還原性Tricine-SDS-PAGE上樣樣品。根據(jù)Schagger[12]的方法，使用16%的丙烯酰胺分離膠和4%的丙烯酰胺濃縮膠進(jìn)行電泳。加入10 μL樣品于電泳泳道中，并以30 V的恒定電壓進(jìn)行電泳約1 h，待所有蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠后，以100 V的恒定電壓進(jìn)行電泳，直至電泳結(jié)束。后經(jīng)過固定，考馬斯亮藍(lán)G-520染色后，再脫色。然后使用Image Lab 3.0軟件分析條帶強(qiáng)度。

1.2.5 內(nèi)源性蛋白酶水解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布分析

采用體積排阻-高效液相色譜(SEC-HPLC)進(jìn)行分析。將1.2.1制備的粗油體稀釋至蛋白質(zhì)含量為0.4%，在最適條件下水解0～9 h。取樣后用0.22 μm濾膜過濾，得到的清液作為液相樣品。使用安捷倫高效液相色譜儀對水解后的粗油體過濾樣品進(jìn)行相對分子質(zhì)量分布檢測。色譜柱選用TSK gel G2000SWXL(300 mm×7.8 mm)；流動(dòng)相為三氟乙酸-乙腈-水(體積比0.1∶45∶55)，流速0.5 mL/min；紫外檢測波長214 nm；檢測溫度為室溫，進(jìn)樣量20 μL[13]。

1.2.6 粒徑的測定

將1.2.2得到的樣品(三次粗油體)用Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)稀釋20倍，攪拌均勻后，用多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀測定其粒徑。

1.2.7 激光共聚焦分析

將1.2.2得到的樣品(三次粗油體)用Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)稀釋20倍，輕微攪拌均勻后，取0.5 mL該樣品，加0.5 μL 0.1%的尼羅紅和10 μL的FITC，混勻，制片，置于激光共聚焦顯微鏡下分析。

1.2.8 粗油體的破乳

將1.2.1制備的粗油體調(diào)整固形物含量，在最適條件下經(jīng)內(nèi)源性蛋白酶水解后調(diào)整體系pH后置于4 000 r/min離心15 min，取上層游離清油并稱重。按下式計(jì)算破乳率?？疾旃绦挝锖?、pH、粒徑及蛋白質(zhì)含量對破乳的影響。

破乳率=游離油質(zhì)量/(樣品質(zhì)量×樣品中粗脂肪含量)×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)源性蛋白酶水解pH對芝麻蛋白水解的影響

將1.2.1制備的粗油體稀釋至蛋白質(zhì)含量為0.4%后，分別調(diào)pH至3～11，置于40℃下水解2 h后取樣進(jìn)行還原性Tricine-SDS-PAGE，結(jié)果見圖2。

注：M.Marker;C.空白(原始粗油體稀釋樣品)。下同。

芝麻粗油體中的蛋白除了包括組成油體結(jié)構(gòu)的油體蛋白，還吸附著一些油體外源性蛋白。芝麻油體蛋白包括油質(zhì)蛋白(oleosin-H,17 kDa; oleosin-L, 15 kDa)[14]，油體鈣蛋白(caleosin，27 kDa)和油體固醇蛋白(steroleosin-A，39 kDa；steroleosin-B，41 kDa)。吸附在油體的油體外源性蛋白主要是11S、7S和2S等。由圖2可以看出，11S主要是酸性肽鏈(A，30～40 kDa)和堿性肽鏈(B，20～25 kDa)通過二硫鍵鏈接而成[14-15]。2S清蛋白的相對分子質(zhì)量在4～9 kDa。對圖2中空白對照泳道進(jìn)行Image Lab灰度分析發(fā)現(xiàn)11S占油體外源性蛋白的75%以上，因此將11S(B)作為油體外源性蛋白的水解代表?xiàng)l帶，考察其在不同pH下的水解速度，并對17 kDa的油質(zhì)蛋白水解速度進(jìn)行研究，結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH條件下水解2 h后20 kDa和17 kDa蛋白條帶灰度分析

從圖3可以看出，以20 kDa(B)條帶為代表的油體外源性蛋白在40℃、pH 3時(shí)水解速度最快，2 h 能水解約80%。而pH 4是水解油質(zhì)蛋白最佳pH，在2 h后17 kDa油質(zhì)蛋白幾乎完全水解。油體外源性蛋白在40℃時(shí)，pH 3時(shí)水解速度最快，在高于pH 3的條件下，水解速度隨著pH的提高逐漸降低，在高于pH 4時(shí)，油體外源性蛋白水解急劇減弱。油質(zhì)蛋白在pH 4～6時(shí)水解速度較快，與油體外源性蛋白水解特性相似，隨著pH向堿性方向偏移，水解速度大大降低。綜合考慮油質(zhì)蛋白和油體外源性蛋白的水解程度，選擇pH 4為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的水解pH。

2.2 內(nèi)源性蛋白酶水解溫度對芝麻蛋白水解的影響

將1.2.1制備的粗油體稀釋至蛋白質(zhì)含量為0.4%后調(diào)節(jié)pH至4，分別置于30～80℃水解2 h，取樣進(jìn)行還原性Tricine-SDS-PAGE，并研究了不同溫度下20 kDa和17 kDa蛋白的水解速度，結(jié)果分別見圖4、圖5。

圖4 不同溫度下水解2 h后粗油體還原性Tricine-SDS-PAGE圖

圖5 不同溫度下水解2 h后20 kDa和17 kDa蛋白條帶灰度分析

從圖4、圖5可以看出，pH 4條件下，溫度從30℃升高至50℃，油質(zhì)蛋白和油體外源性蛋白水解速度逐漸加快，但是隨著溫度的繼續(xù)上升，水解速度明顯下降。在50℃時(shí)，油質(zhì)蛋白和油體外源性蛋白的水解速度都是最快的，在此溫度下水解2 h后，油質(zhì)蛋白17 kDa和15 kDa完全水解，且油體外源性蛋白也水解了70%左右。因此，可以說50℃是芝麻粗油體中內(nèi)源性蛋白酶在pH 4時(shí)的最適水解溫度。

2.3 內(nèi)源性蛋白酶水解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布

采用1.2.5方法對在50℃、pH 4條件下水解不同時(shí)間的樣品進(jìn)行SEC-HPLC分析，結(jié)果分別見圖6、表1。

圖6 不同水解時(shí)間水解產(chǎn)物的液相色譜圖

表1 不同水解時(shí)間的水解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量占比

從圖6可知，相對于0 h的樣品，其他時(shí)間段的水解樣品在500～5 000 Da總體信號明顯要強(qiáng)。且可以發(fā)現(xiàn)隨著水解時(shí)間的延長，500～1 000 Da處的信號響應(yīng)值越來越大，代表著500～1 000 Da的小分子肽越來越多，說明內(nèi)源性蛋白酶使得芝麻蛋白水解，更多的水溶性小分子蛋白產(chǎn)生釋放到水溶液中。從表1可知，隨著水解時(shí)間的延長，小于1 000 Da的小分子蛋白占比越來越大，相對分子質(zhì)量在5 000～12 400 Da的蛋白占比越來越小，以及大于12 400 Da的蛋白只出現(xiàn)在0 h和1 h。結(jié)果說明隨著水解時(shí)間的延長體系中大分子蛋白逐漸被內(nèi)源性蛋白酶水解成小分子蛋白。

2.4 破乳pH對油體破乳的影響

將1.2.1制備的粗油體于50℃、pH 4下水解4 h，分別調(diào)pH至3～11，離心，取游離油，計(jì)算破乳率，結(jié)果見圖7。

圖7 破乳pH對破乳率的影響

從圖7可以看出，隨著pH的增加，破乳率先緩慢上升后快速下降，在pH 5時(shí)達(dá)到最大，在97%左右。吳海波等[16]在探究水酶法中pH對于大豆油乳狀液破乳的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在pH 3和pH 4時(shí)，破乳效果最好，能達(dá)到100%。Chabrand 等[17]利用水酶法提取大豆油，將乳狀液水解后，置于 50℃、pH 4.5下3 h，破乳率最高可達(dá) 83%。這些研究主要是利用在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近降低乳狀液穩(wěn)定性的原理。因?yàn)榇蟛糠值鞍椎牡入婞c(diǎn)是pH 4.5，因此在pH 4.5附近，蛋白質(zhì)不帶電互相聚集，進(jìn)而促使油滴聚合，油滴平均粒徑增大，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性降低。但是由于水解條件、樣品對象、酶、水解程度、水解產(chǎn)物及其性質(zhì)的不同，導(dǎo)致在pH 4.5略有偏移，與本實(shí)驗(yàn)在pH 5時(shí)破乳率最大的結(jié)果是相符的。在pH 8時(shí)，完全不破乳。但是在pH 9～11出現(xiàn)了疑似游離油中夾帶其他物質(zhì)且與未破乳層分界不明。

2.5 水解時(shí)間對油體破乳的影響

將1.2.1制備的粗油體于50℃、pH 4下水解0～7 h，調(diào)節(jié)pH至5，離心，取游離油，計(jì)算破乳率。將不同水解時(shí)間的粗油體稀釋至蛋白質(zhì)含量為0.4%，進(jìn)行還原性Tricine-SDS-PAGE，結(jié)果見圖8。水解時(shí)間對破乳率的影響見圖9。

從圖8、圖9可以看出，隨著水解時(shí)間的延長，芝麻蛋白逐漸被水解，破乳率逐漸增加。芝麻蛋白不水解，調(diào)pH至5，是無法破乳的。也驗(yàn)證了存在內(nèi)源性蛋白酶水解芝麻蛋白，且有助于破乳。我們發(fā)現(xiàn)在0～2 h隨著油質(zhì)蛋白的水解，破乳率從0增長到87%，但水解時(shí)間繼續(xù)延長，破乳率增長趨于平緩，且對應(yīng)電泳圖上在2 h時(shí)油質(zhì)蛋白基本消失，繼續(xù)水解，油體外源性蛋白開始大量水解，但是對破乳率貢獻(xiàn)并不大。考慮到游離油風(fēng)味和經(jīng)濟(jì)成本，選定2 h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的水解時(shí)間。

圖8 粗油體50℃、pH 4條件下不同水解時(shí)間的還原性Tricine-SDS-PAGE圖

圖9 水解時(shí)間對破乳率的影響

2.6 固形物含量對油體破乳的影響

將1.2.1制備的粗油體用去離子水稀釋至固形物含量分別為60%、50%、40%、30%、20%。置于50℃、pH 4水解2 h，調(diào)pH至5，離心，取游離油，計(jì)算破乳率，結(jié)果見圖10。

圖10 固形物含量對破乳率的影響

從圖10可知，固形物含量從20%增加到50%，破乳率從30%增加到88%。但是固形物含量繼續(xù)增加到60%，破乳率略有降低。這與趙路蘋[8]研究的結(jié)果一致。固形物含量過高不利于破乳，這可能是因?yàn)樗趾窟^低，導(dǎo)致體系黏度變大，流動(dòng)性變差，不利于乳狀液中游離油的獲取[18]。

2.7 粒徑對油體破乳的影響

采用1.2.2方法制備不同粒徑的粗油體，并采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)第一次粗油體粒徑最大，其次是第二次粗油體，第三次粗油體粒徑最小，且前兩次粗油體的不均勻程度大于第三次粗油體(見圖11)。通過粒徑測定可知，第一次粗油體粒徑在1.4 μm左右，第二次粗油體粒徑在900 nm左右，第三次粗油體的粒徑約600 nm(見圖12)。第一次粗油體在50℃、pH 4水解2 h，破乳率可達(dá)88%，第二次粗油體同樣條件下破乳率約80%，而第三次粗油體破乳率大大降低，只有55%左右(見圖13)。這可解釋為隨著油質(zhì)蛋白水解，芝麻粗油體發(fā)生聚集。粒徑越大，油滴相互碰撞機(jī)會(huì)增加，從而加速破乳。

圖11 三次粗油體的激光共聚焦圖

圖12 三次粗油體的粒徑分布

圖13 三次粗油體的破乳率對比

2.8 蛋白質(zhì)含量對油體破乳的影響

采用1.2.3方法制備固形物含量為50%，不同蛋白質(zhì)含量的3個(gè)粗油體樣品，于50℃、pH 4下水解2 h,調(diào)pH至5，離心，取游離油，計(jì)算破乳率，結(jié)果見表2。

表2 蛋白質(zhì)含量與破乳率關(guān)系

從表2可知，隨著蛋白質(zhì)含量的降低，破乳率逐漸提高。當(dāng)固形物含量控制在50%，蛋白質(zhì)含量為0.81%時(shí)，破乳率達(dá)到90.70%。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)含量低，覆蓋在油滴表面的蛋白質(zhì)減少，有利于油滴的聚集。

3 結(jié) 論

粗油體中存在內(nèi)源性蛋白酶，且此蛋白酶在pH 3時(shí)傾向于水解油體外源性蛋白，且水解速度最快；在pH 4～6時(shí)，傾向于水解油質(zhì)蛋白，且17 kDa的水解速度較15 kDa的快；在pH 4時(shí)，水解最適溫度是50℃。粗油體在50℃、pH 4條件下水解，高效液相色譜分析表明，隨著水解時(shí)間的延長，小分子水溶性蛋白逐漸增加。破乳實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)水解有利于破乳。在樣品水解后，pH 5條件下破乳率最高。固形物含量為50%時(shí)，破乳率最大；粒徑越大越容易破乳；蛋白質(zhì)含量越低越容易破乳。將粗油體固形物含量調(diào)至50%，在50℃、pH 4下水解2 h，調(diào)pH至5后，破乳率能達(dá)到88%。研究結(jié)果為實(shí)際生產(chǎn)利用內(nèi)源性蛋白酶破乳工藝提供了基礎(chǔ)。