王薛雪，李 莎，任戰(zhàn)坤，王 瑞，詹伊婧，符 嬋，徐 虹

(1.南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211800；2.南京軒凱生物科技有限公司，江蘇 南京 211800)

皮膚作為人體抵御外界侵害的第一道防線，易受外界影響而導致光老化，紫外線照射產(chǎn)生的過量自由基是皮膚光老化的主要原因[1-2]。自由基具有高度的活潑性和極強的氧化反應能力，能通過氧化作用攻擊皮膚細胞內的生物大分子，如核酸、蛋白質、糖類和脂質等，使之發(fā)生變性、交聯(lián)或斷裂[1-2]，造成皮膚在分子、細胞及組織器官水平的各種損傷[3-4]，加速皮膚衰老進程甚至誘發(fā)各種疾病[5-6]。皮膚成纖維細胞由于具有分泌膠原、保持細胞彈性和支持表皮細胞等作用[7]，是進行體外抗衰老研究的常用對象。因此，尋找天然抗氧化物用于修復皮膚光老化問題已成為目前的研究熱點之一，受到人們的廣泛關注。

近年來，隨著酶、活性肽、多糖等抗氧化活性功能的不斷發(fā)掘，天然高分子抗氧化劑得到廣泛研究[7-9]。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由微生物發(fā)酵制備的一種天然帶負電荷的高分子聚合物材料，因其強大的保水能力而廣泛應用于保濕型化妝品中，其分子量最高可達2.0×106[10]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)γ-PGA具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(·DPPH)的能力[11]，但其抗氧化、抗皮膚光老化效果及與γ-PGA分子量的關系尚未明確。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

γ-PGA，南京軒凱生物科技有限公司；抗壞血酸(VC)、焦性沒食子酸(鄰苯三酚)、濃鹽酸、H2O2、FeSO4·7H2O、水楊酸、乙醇均為分析純，中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、·DPPH、DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰酶-EDTA、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、透明質酸(HA)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2(MTT)均為生物試劑，上?；瘜W試劑公司；小牛血清，杭州四季青生物工程有限公司；一氧化氮(NO)檢測試劑盒、DCFH-DA熒光探針，南京建成生物工程研究所；去離子水，實驗室自制。

752 s型紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；HH-3A型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；KQ5200型超聲波清洗器，南京實驗儀器廠；BSA224S型分析天平，上海天平儀器廠；SW-CJ-1B型標準型凈化工作臺，蘇州凈化設備廠；紫外光輻照計，北京師范大學光電儀器廠；Heracell 150i型細胞培養(yǎng)箱、MultiskanGO酶標儀、Lumina熒光分光光度計，Thermo公司。

1.2 實驗方法

(1)

式中：A1為鄰苯三酚自氧化的反應速率，A2為加入γ-PGA后的鄰苯三酚自氧化的反應速率。

1.2.2 ·OH清除率測定

·OH清除率的測定采用Fenton反應法[13]，以VC為陽性對照。反應體系:0.50 mL的9 mmol/L FeSO4溶液，0.50 mL的9 mmol/L水楊酸乙醇溶液和2.50 mL的γ-PGA溶液或VC溶液，混合均勻后，加入0.5 mL 8.8 mmol/L的H2O2，置于37 ℃中水浴15 min。取出后待冷卻至室溫，在510 nm下測其吸光度，具體計算見式(2)。

(2)

式中：B1為加入γ-PGA的吸光度，B2為用水代替H2O2溶液的吸光度，B0為不加γ-PGA的吸光度。

1.2.3 ·DPPH清除率測定

·DPPH清除率的測定參照Zeng等[14]采用的方法。反應體系:0.05 mg/mL ·DPPH的乙醇溶液0.50 mL，加入2.5 mLγ-PGA溶液或VC溶液，以2.5 mL的去離子水代替γ-PGA溶液為對照組。避光反應10 min后在519 nm下測其吸光度，具體計算見式(3)。

(3)

式中：C1為加入γ-PGA的吸光度，C2為用乙醇溶液代替·DPPH溶液的吸光度，C0為不加γ-PGA的吸光度。

1.2.4 小鼠皮膚成纖維細胞的培養(yǎng)及實驗分組

實驗采用L929小鼠皮膚成纖維細胞，在標準實驗條件下培養(yǎng)：使用含100 g/L小牛血清和10 g/L的青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，置于37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2、飽和濕度的生化培養(yǎng)箱中，每隔2～3 d更換一次培養(yǎng)基，細胞使用0.25%胰酶-EDTA消化傳代。細胞存活率檢測采用96孔板進行，接種密度為2×104個/孔；細胞形態(tài)觀察、細胞內活性氧(ROS)水平及細胞內NO水平均采用6孔板進行，細胞接種密度為2.5×106個/孔，待細胞完全貼壁后，進行分組處理。

實驗分組為正常對照組(CK組)、光老化模型組(UV組)和γ-PGA處理組。細胞培養(yǎng)至完全貼壁后，棄去培養(yǎng)基，每孔均加入100 μL(96孔板)或1 mL(6孔板)的PBS，再進行紫外UVA照射[15](輻照距離為10 cm，輻照時間為30 min，輻照劑量為5 J/cm2)，棄去PBS，每孔均先加100 μL(96孔板)或1 mL(6孔板)的不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，后按組處理，CK組和UV組加入100 μL(96孔板)或1 mL(6孔板)PBS，γ-PGA組各加100 μL(96孔板)或1 mL(6孔板)不同分子量1 mg/mL的γ-PGA溶液(γ-PGA溶液采用0.22 μm的濾頭過濾除菌)共同培養(yǎng)24 h。

1.2.5 細胞存活率的測定

采用MTT法進行細胞存活率檢測[16]，于96孔板中分組處理的細胞培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，37 ℃避光反應4 h后吸棄上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，微量振蕩10 min使結晶紫充分溶解，于590 nm下測其吸光度，具體計算見式(4)。

(4)

式中：T為UV組或γ-PGA組細胞的吸光度，C為CK組細胞的吸光度。

1.2.6 細胞形態(tài)觀察

采用倒置生物顯微鏡觀察不同處理組的L929細胞形態(tài)并拍照記錄。

1.2.7 細胞中ROS水平測定

6孔板中分組處理的細胞培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入1 mL的10 μmol/L DCFH-DA熒光探針，37 ℃孵育30 min后收集細胞，用熒光分光光度計進行熒光檢測，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm[17]。

1.2.8 細胞中NO水平測定

6孔板中分組處理的細胞培養(yǎng)24 h后，吸取上清液培養(yǎng)基，收集細胞，1 000 r/min離心5 min后棄去上清液，用之前吸取的上清液培養(yǎng)基將細胞吹打重懸，反復凍融3次以裂解細胞，12 000 r/min離心5 min后收集裂解產(chǎn)物備用。NO含量的檢測使用NO檢測試劑盒，在波長550 nm處[9]，用酶標儀測定吸光度。

1.2.9 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均來自3次以上平行實驗，采用PASW軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，單因素方差分析進行顯著性檢驗，P<0.05則認為結果具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 清除的能力

分別測定不同分子量的γ-PGA不同濃度的溶液對超氧陰離子自由基的清除能力，結果見圖1。

圖1 γ-PGA對的清除能力

2.2 清除·OH的能力

分別測定不同分子量的γ-PGA不同濃度的溶液對·OH的清除能力，結果見圖2。

圖2 γ-PGA對·OH的清除能力

由圖2可知，不同分子量的γ-PGA對·OH都具有較強的清除作用，且隨著γ-PGA濃度的增加，清除效果逐漸增強。在低質量濃度(<0.6 mg/mL)情況下，γ-PGA-1.5、30、60和100的最高清除率分別為90.03%、95.26%、82.18%和92.48%；在質量濃度為0.6 mg/mL時，各分子量的γ-PGA都可以清除80%以上的·OH，其中γ-PGA-30的清除率最佳；在高質量濃度(>0.8 mg/mL)情況下，不同分子量的γ-PGA對·OH的清除效果相近，在質量濃度為0.8 mg/mL時，γ-PGA-1.5、30、60和100的清除率分別為94.28%、95.75%、96.56%和92.64%，清除率都可以達到90%以上，與VC清除率相近。其中，6.0×105的γ-PGA在質量濃度為1 mg/mL時，最高清除率可達97.55%。γ-PGA對·OH超強的清除能力很有可能是γ-PGA螯合了溶液中的Fe2+，阻斷了·OH的生成所導致的[19]。

2.3 清除·DPPH的能力

分別測定不同分子量的γ-PGA不同濃度的溶液對·DPPH的清除能力，結果見圖3。

圖3 γ-PGA對·DPPH的清除能力

由圖3可知，不同分子量的γ-PGA對·DPPH都具有一定的清除作用，但在實驗濃度區(qū)間內，各分子量γ-PGA對·DPPH的清除率與濃度沒有明顯的線性關系，所以認為·DPPH清除率與γ-PGA的濃度不相關。同時從圖3可以明顯看出，各分子量γ-PGA對·DPPH的清除率(從大到小)：γ-PGA-30、γ-PGA-1.5、γ-PGA-60、γ-PGA-100，其中3.0×105的γ-PGA對·DPPH的清除效果最好，遠高于其他分子量的γ-PGA，其在質量濃度為5 mg/mL時，清除率達到74.64%。γ-PGA-30對·DPPH優(yōu)異的清除效果可能是其在溶液中的高級結構，而不是γ-PGA本身所導致的[20]。

2.4 對光老化細胞的修復作用

紫外照射會嚴重損傷真皮層中的成纖維細胞，皮膚成纖維細胞的增殖能力對皮膚的正常修復起著決定性作用。分別測定不同分子量γ-PGA對紫外照射后的L929細胞的修復作用，結果如圖4所示。

由圖4可知：紫外光照射后立即加入γ-PGA溶液，可以一定程度恢復因紫外線造成的細胞損傷，降低細胞的死亡率。與正常組的細胞存活率100%相比，紫外線造成了細胞較大的損傷，UV組的細胞存活率顯著降低(P<0.01)，僅為55.37%，γ-PGA對細胞的修復效果(從大到小)為γ-PGA-30、γ-PGA-60、γ-PGA-1.5、γ-PGA-100，結果具有顯著差異性(P<0.05)。

*表示P<0.05 vs.CK；**表示P<0.01 vs.CK；#表示P<0.05 vs.UV；##表示P<0.01 vs.UV

與CK組相比，UV組細胞數(shù)量明顯減少，且少部分細胞脫離貼壁狀態(tài)，懸浮于培養(yǎng)基中，部分貼壁的細胞梭型不明顯，細胞邊緣不清晰。紫外照射后加入γ-PGA的細胞形態(tài)較UV組都有一定程度的改善，細胞數(shù)量有所增加，懸浮細胞減少，貼壁的細胞梭型明顯。說明γ-PGA能有效修復光老化細胞，其中γ-PGA-30的細胞形態(tài)呈現(xiàn)清晰的不規(guī)則多邊形，圓形的懸浮細胞較其他組少許多，與CK組相似，細胞排列緊密，數(shù)量也比其他γ-PGA組多，這與MTT的結果相符合，因此認為γ-PGA-30對光老化細胞的修復作用最佳。

2.5 對光老化細胞中ROS及NO含量的影響

紫外照射會導致細胞中的氧自由基ROS、氮自由基NO含量明顯上升，細胞中自由基含量的多少對光老化皮膚修復作用的評價有著重要意義。分別測定不同分子量γ-PGA對紫外照射后的L929細胞中ROS及NO含量的影響，結果如圖5所示。

圖5 γ-PGA對光老化細胞中ROS、NO含量的影響

由圖5可知，與CK組相比，UV組細胞中的ROS、NO含量顯著上升(P<0.01)。而γ-PGA的加入可以減少細胞中的ROS、NO含量。γ-PGA可以顯著抑制紫外照射造成的ROS含量上升(P<0.01)，γ-PGA組的ROS含量低于UV組，其中γ-PGA-30組細胞內的ROS相對含量為210.9，只有UV組的一半，其他分子量的γ-PGA的結果更接近CK組。表明γ-PGA可以有效抑制小鼠光老化細胞中ROS含量的增加，減輕紫外對細胞造成的氧化損傷。

γ-PGA的加入可以顯著抑制紫外照射造成的NO含量上升(P<0.01)，γ-PGA組的NO含量比UV組明顯降低，其中γ-PGA-1.5、γ-PGA-30組細胞內的NO含量不到UV組的一半，甚至略低于CK組。表明γ-PGA可以有效抑制小鼠光老化細胞中NO含量的增加，從而修復紫外照射導致的細胞氧化損傷。其中γ-PGA-30對光老化細胞的修復作用最為明顯，這可能是因為γ-PGA-30在溶液中具有獨特的易于清除自由基的三維結構。

3 結論

2)紫外光照射后立即加入γ-PGA溶液，可以一定程度修復光老化細胞的損傷，降低細胞的死亡率，其中分子量為3.0×105的γ-PGA對光老化細胞的修復作用最佳。

3)γ-PGA可以顯著減少光老化細胞中ROS、NO含量的上升，從而修復光老化細胞的氧化損傷，其中分子量為3.0×105的γ-PGA對光老化細胞中ROS、NO含量上升的抑制效果最為明顯。