王英燕，賈存江，張 羽，徐國華，袁 峰，耿 燕

(1.江蘇神華藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安 211600；2.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

靈芝(Ganodermalingzhi)，擔(dān)子菌門擔(dān)子菌綱多孔菌目靈芝科靈芝屬真菌，是我國中醫(yī)藥寶庫中的珍貴藥物。目前，東南沿海、長江中下游等地區(qū)是我國最主要的靈芝種植區(qū)。我國現(xiàn)存最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載：“靈芝可明目，補(bǔ)肝氣，安精魂，堅(jiān)筋骨”[1]。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，靈芝具有多種藥理活性，具有提高免疫力、保護(hù)放化療損傷、抗腫瘤等多種功能[2]。靈芝作為藥物已被《中華人民共和國藥典》收錄，臨床上主要用于治療腫瘤、慢性支氣管炎、冠心病、神經(jīng)衰弱、高血脂和高血壓等疾病[3]。靈芝也屬于國家批準(zhǔn)的新資源食品，可以藥食兩用。目前靈芝可作為藥品和保健品研發(fā)應(yīng)用中的主要藥用部位為其子實(shí)體[4]。但野生采摘或人工栽培子實(shí)體易受自然條件限制，生產(chǎn)效率低，產(chǎn)品質(zhì)量波動大，其生產(chǎn)規(guī)模和科技含量也遠(yuǎn)未達(dá)到市場需求，因此對于靈芝產(chǎn)品的研究和開發(fā)仍有待于進(jìn)一步深化[1]。近年來，采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)獲得靈芝有效成分的研究取得了顯著進(jìn)展[5]，可實(shí)現(xiàn)其規(guī)?；慨a(chǎn)，是解決上述問題的重要替代路徑[6]。

靈芝主要活性成分包括靈芝多糖、三萜和靈芝酸等[7]。靈芝提取物是指以赤芝(GanodermalucidumLeyss.ex Fr.)或紫芝(GanodermasinenseZhao,Xu et Zhang)子實(shí)體為原料，經(jīng)提取分離制成的水提物，由于其富含靈芝的主要活性成分，在藥品、保健品、化妝品行業(yè)中應(yīng)用廣泛[8]。目前發(fā)現(xiàn)靈芝子實(shí)體與其菌絲體的營養(yǎng)成分十分相似，對人體同樣有功效作用[9]。但對于靈芝菌絲體的研究還較少，有待進(jìn)一步探索。本文中，筆者主要對靈芝發(fā)酵菌絲提取物(Ganodermalingzhimycelium extract,GLME)中的主要化學(xué)成分以及其急性毒性進(jìn)行分析，以期為靈芝資源的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

靈芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體及菌粉制備：按文獻(xiàn)[10]方法制備川芝4號液態(tài)菌絲體。并將制備好的菌絲體經(jīng)60 ℃干燥，破碎，過150 μm篩制備成川芝4號菌粉。

GLME制備：取制備好的川芝4號菌粉500 g，加入5倍的純化水，(82±2)℃提取3 h，提取液冷卻至約40 ℃，8 000 r/min離心3 min。將過濾的濾渣繼續(xù)加入5倍純化水，于(82±2)℃提取3 h，將提取液冷卻至約40 ℃，6 000 r/min離心5 min。將兩次浸提的濾液減壓濃縮(溫度為60 ℃，真空度為0.09 MPa)至濾液體積0.2倍，緩慢加入5倍體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，靜置過夜，將沉淀物烘干即得GLME。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

昆明小鼠40只(雌雄各半)。其中雄性小鼠體質(zhì)量為28.5～33.8 g，雌性小鼠體質(zhì)量為23.3～27.8 g。實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)過程中以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.1.3 儀器及試劑

使用儀器及試劑參照文獻(xiàn)[11]。

1.2 方法

1.2.1 一般性成分分析

按國家標(biāo)準(zhǔn)對GLME的灰分[12]、水分[13]、總蛋白[14]、粗脂肪[15]和粗纖維[16]進(jìn)行分析。

1.2.2 礦質(zhì)元素分析

按國家標(biāo)準(zhǔn)[17]對GLME中的礦質(zhì)元素進(jìn)行分析。

1.2.3 脂肪酸組成分析

按國家標(biāo)準(zhǔn)[18]采用氣相色譜法對GLME中的脂肪酸進(jìn)行分析。

1.2.4 氨基酸組成分析

取4 g GLME按文獻(xiàn)[11]方法對樣品進(jìn)行前處理，隨后采用高效液相色譜法(HPLC)對其中的游離氨基酸進(jìn)行分析。按國家標(biāo)準(zhǔn)[19]對GLME中的水解氨基酸進(jìn)行測定分析。

1.2.5 核苷類物質(zhì)分析

取3 g GLME樣品按文獻(xiàn)[11]方法處理并采用HPLC進(jìn)行分析。

1.2.6 粗多糖分子量分布及單糖組成分析

取2.5 g GLME樣品按文獻(xiàn)[11]方法制備粗多糖和游離單糖，并分別采用HPLC和紅外光譜法(IR)進(jìn)行分析。

1.2.7 急性毒性分析

GLME溶液配制：以0.5%的羧甲基纖維素鈉為溶劑，分別配制5、50、200、500 mg/mL的GLME溶液(渾濁液)。實(shí)驗(yàn)組別設(shè)置：40只實(shí)驗(yàn)小鼠，雌雄各半，各隨機(jī)分為4個(gè)劑量組(50、500、2 000、5 000 mg/kg)和1個(gè)溶劑對照組(每組8只，即n=8)，雌雄共8組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，解剖前12 h做禁食處理。并按文獻(xiàn)[11]方法開展急性毒性實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行樣品處理及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 一般性成分結(jié)果

GLME中粗脂肪、粗纖維、灰分、水分和總蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(10.88±0.86)%、(6.72±0.12)%、(12.87±0.84)%、(5.26±0.06)%和(14.35±0.74)%。

2.2 礦質(zhì)元素

GLME中含有多種人體必需的微量元素(圖1)，如Mn、Mg、Fe、Ca、K等，它們對細(xì)胞生長和機(jī)體的正常生長發(fā)育等起著重要作用[20]。其中K的含量較高，有利于維持機(jī)體的酸堿平衡，預(yù)防高血壓。人體內(nèi)Zn/Cu的質(zhì)量比過高時(shí)會增加血液中膽固醇的含量，GLME中Zn/Cu比為1.26，明顯低于植物性食物中所含的相應(yīng)比值11.4。另外，樣品中的鉛、砷、鎘等有毒元素的含量較低，符合國家保健(功能)食品通用標(biāo)準(zhǔn)(GB16740—1997)[21]。

Ti、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Cd、Sn、Ba、Pb含量單位為mg/g，Mg*、Al*、K*、Ca*、Fe*含量單位為mg/kg

2.3 脂肪酸組成

脂肪酸組成分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，GLME中不飽和脂肪酸占(76.37±0.76)%，其中亞油酸(22.97±0.21)%和油酸(51.31±0.50)%含量較高。飽和脂肪酸中棕櫚酸的含量最高(14.68±1.36)%。此外必需脂肪酸占(24.04±0.23)%。目前研究認(rèn)為飽和脂肪酸食用過多易引起心血管疾病，本研究發(fā)現(xiàn)GLME超過10%的脂肪酸即主要脂肪酸為棕櫚酸(C16：0)、油酸(C18：1)及亞油酸(C18：2)，不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值大于3.2，表明GLME富含不飽和脂肪酸，具有調(diào)節(jié)血脂代謝、預(yù)防動脈硬化、抗血栓及抗癌等作用[22]。

*代表不飽和脂肪酸；#代表必需脂肪酸

2.4 氨基酸組成

在GLME中檢測出的17種氨基酸中有7種屬于必需氨基酸，結(jié)果見圖3。其中水解氨基酸中亮氨酸含量最多(0.48±0.00)%，游離氨基酸中，必需氨基酸的含量基本一致。此外，水解氨基酸和游離氨基酸中必需氨基酸占總氨基酸的百分比分別為31.97%，28.00%。

*代表必需氨基酸

2.5 核苷類物質(zhì)

核苷是核酸的主要組分，具有顯著的生理功能，如5-氟尿嘧啶脫氧核苷能抗腫瘤等。圖4為靈芝發(fā)酵菌絲提取物中的核苷類物質(zhì)。由圖4可知，在GLME中檢測到了胞苷(0.71±0.07)×10-2mg/g、鳥苷(0.25±0.02)×10-2mg/g、腺苷(1.55±0.28)×10-2mg/g、尿苷(6.77±0.84)×10-2mg/g和尿嘧啶(0.34±0.03)×10-2mg/g。

圖4 GLME核苷類物質(zhì)HPLC結(jié)果

2.6 多糖

靈芝多糖被公認(rèn)為靈芝中的主要活性成分之一，主要以雜多糖形式存在。據(jù)文獻(xiàn)[23]報(bào)道，靈芝多糖多由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、L-巖藻糖等組成，具有抗氧化的作用[1]，還能提高機(jī)體抗腫瘤免疫功能[24]。經(jīng)檢測，GLME的粗多糖含量為5.74%(峰值分子量Mp為15 486，重均分子量Mw為41 559，數(shù)均分子量Mn為4 163)，高效液相色譜分析結(jié)果見圖5。將GLME的粗多糖在波數(shù)4 000～400 cm-1內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，如圖6顯示，分別在854 cm-1和890 cm-1處出現(xiàn)α-糖苷鍵和β-糖苷鍵的特征吸收峰，與文獻(xiàn)[25-26]的結(jié)果相似，表明GLME的粗多糖含有α和β兩種糖苷鍵。。此外，GLME粗多糖的主要單糖組分為甘露糖(0.33%)、葡萄糖(74.65%)和半乳糖(14.77%)。從含量上看，葡萄糖含量最高，在所有單糖組成比例達(dá)到80%以上，與之前文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致。半乳糖含量較多的多糖可以顯著增加免疫活性，故半乳糖是靈芝多糖的重要指標(biāo)成分。

圖5 GLME粗多糖HPLC結(jié)果

圖6 GLME粗多糖IR結(jié)果

2.7 急性毒性

灌胃一次GLME(50、500、2 000和5 000 mg/kg)后，小鼠在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)無死亡率，其體質(zhì)量(圖7)、器官質(zhì)量(表1)、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖8)。由此可知，該GLME在小鼠體內(nèi)無明顯急性毒性。

圖7 GLME一次灌胃給藥后14 d內(nèi)小鼠體質(zhì)量的連續(xù)變化

表1 GLME一次灌胃給藥14 d后小鼠的體質(zhì)量及器官質(zhì)量變化(mean±SD)

圖8 GLME一次灌胃給藥14 d后對小鼠ALT、AST的影響

3 結(jié)論

為進(jìn)一步開發(fā)GLME，評估其使用安全性，為功能性食品開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，筆者進(jìn)行了為期14 d的小鼠經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)，從表觀實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)小鼠的飲水、飲食、體質(zhì)量與正常組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，未出現(xiàn)明顯的中毒反應(yīng)和死亡現(xiàn)象；從解剖結(jié)果來看，未觀察到臟器組織出現(xiàn)明顯的異常變化。此外，不同劑量下小鼠血清AST和ALT的活性與對照組也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此GLME對受試個(gè)體沒有明顯急性毒性。綜上所述，GLME可作為一種優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)品或藥品在食品、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)。