呂蕊花,林 樅,白崇旭,方亞妮,馮 昭,史琳娜,呂瑞華,張喜榮

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

獼猴桃(Actinidiachinensis)為呼吸躍變型的多汁漿果，產(chǎn)后極易腐爛變軟，為提高獼猴桃經(jīng)濟(jì)價值，延長銷售時間，其保鮮冷藏技術(shù)一直被廣泛關(guān)注。陜西省周至縣享有“中國獼猴桃之鄉(xiāng)”的美名，全縣獼猴桃種植面積達(dá)2.77萬hm2，年貯藏能力可達(dá)30萬t?，F(xiàn)普遍使用的冷藏庫消毒技術(shù)多為在獼猴桃入庫之前，用高錳酸鉀和甲醛配比液對冷藏庫空間進(jìn)行全面熏蒸，這種背景下獼猴桃果實采摘預(yù)冷后直接進(jìn)入冷藏庫，不作任何消毒處理，在貯藏過程中極易發(fā)生霉?fàn)€。2002年，該縣貯藏獼猴桃腐爛率在30%～40%，甚至高達(dá)60%，最低也在10%左右，且不同品種的霉?fàn)€率不盡相同。

在獼猴桃典型病害研究方面，引起獼猴桃褐斑病、軟腐病、類似象皮病和果腐病的病原菌已被鑒定，分別為鏈格孢菌(Alternariaalternate)[1]、葡萄球座菌(Botryosphaeriadothidea)[2]、柔膜菌目真菌(Cadophoramelinii)[3]和擬莖點霉(Phomopsissp.)[4]。在獼猴桃采摘后病害鑒定方面，丁愛冬等[5]發(fā)現(xiàn)貯藏19周的獼猴桃腐爛率高達(dá)50%，從中分離得到7種病原菌，其中,灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、青霉屬(Penicilliumsp.)和擬莖點霉(Phomopsissp.)3種病原菌為優(yōu)勢菌。除此之外，葡萄球座菌(Botryosphaeriadothidea)、擬隱殼孢屬(Cryptosporiopsissp.)、間座殼屬(Diaporthespp.)、念珠菌(Cylindrocarponcf.candidum)和多變莖點菌(Phomaexigua)5種真菌均被證實可以侵染獼猴桃，且極易從獼猴桃受損部位侵入[6]。在獼猴桃病害防治方面，王小潔等[2]從海沃德軟腐病病果中分離出了10種致病菌，經(jīng)鑒定均為葡萄球座菌，藥劑篩選試驗結(jié)果表明，多菌靈對病原菌菌絲生長的抑制效果最好，抑制率高達(dá)91.97%。由此可見，引起獼猴桃貯藏期病害的病原菌種類繁多，但使用農(nóng)藥對真菌菌絲或孢子進(jìn)行防控僅限于研究層面，不能在生產(chǎn)上進(jìn)行有效應(yīng)用。因此，進(jìn)一步明確病原菌種類，并探究中藥對獼猴桃貯藏期病原菌的防治效果是當(dāng)下降低獼猴桃貯藏過程中霉變率的有效途徑。鑒于此，以陜西省周至縣貯藏量較大、收益較高的獼猴桃品種為研究對象，研究在獼猴桃貯藏過程中引起果實霉?fàn)€的幾種常見病原菌，并選取常用抗菌中藥，通過菌絲生長抑制方法，分別對分離到的病原菌進(jìn)行抑制效果測定，以期為獼猴桃貯藏、保鮮提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

供試病樣及菌種：貯藏期病果于2018年11月—2019年1月從陜西省周至縣獼猴桃冷藏庫中獲得，為貯藏1～4個月的成熟果實。病果具有該地區(qū)獼猴桃貯藏期間常見的發(fā)病癥狀，病果品種為該地區(qū)經(jīng)濟(jì)價值較高的品種：海沃德、徐香、華優(yōu)。病原菌致病性測定所用上述品種健康獼猴桃亦由此地購得。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potota dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉12 g、蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖(Potota dextrose, PD)液體培養(yǎng)基：不添加瓊脂粉的PDA培養(yǎng)基。

試劑及儀器：真菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索來寶科技有限公司；PCR擴(kuò)增、檢測及產(chǎn)物克隆所用試劑盒均購自TAKARA公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA公司；瓊脂糖、核酸Marker、預(yù)染EB均購自上海生物工程有限公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；雙壓電泳儀和電泳槽購自北京君意公司。

中藥材：選取的10種抗真菌常用單味藥[7]的顆粒劑,均購于陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，生產(chǎn)廠家為四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。10種單味藥均為濃縮顆粒劑，其1 g濃縮顆粒劑對應(yīng)的原藥材質(zhì)量分別為大黃7 g、茵陳11 g、蛇床子21 g、薄荷11 g、苦楝皮12 g、鹽小茴香21 g、連翹11 g、板藍(lán)根11 g、馬齒莧11 g、土茯苓11 g。

1.2 病原菌的分離與純化

組織分離法[8]：切取病、健交界處的組織4～5 mm，用75%乙醇清洗1 min，再用無菌水沖洗3～4次，置于無菌濾紙上，用刀片從中間切開，切面貼向PDA平板進(jìn)行培養(yǎng)。對于肉眼可見的霉菌菌絲，在超凈工作臺上直接用接種環(huán)挑取接種于PDA培養(yǎng)基上，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后挑取邊緣菌絲再次分離，直至分離到單菌落。

將純化的病原菌用打孔器打成直徑為1 cm的圓餅，菌絲面朝上接種于PDA平板上，20 ℃培養(yǎng)，觀察、記錄菌絲生長情況，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)及孢子產(chǎn)生情況。

1.3 病原菌的致病性測定

待接種健康獼猴桃果實消毒處理方式：用75%的乙醇噴灑獼猴桃果實表面，置于超凈工作臺中完全吹干。采用穿刺法接種：用無菌的牙簽穿刺果皮，用1 cm的打孔器在培養(yǎng)5 d的PDA平板菌落邊緣打孔，將菌絲面朝向果皮接種健康的獼猴桃。分離到的每種病原菌均接種3個待測獼猴桃品種，每個品種重復(fù)3次，每個品種每次接種5個果實。接種后置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。待果實發(fā)病后，根據(jù)柯赫法則，再次從人工接種致發(fā)病的獼猴桃果實上分離病原菌進(jìn)行培養(yǎng)，并與接種前所用病原菌進(jìn)行對比。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

病原菌形態(tài)學(xué)鑒定：將分離得到的致病菌株接種到PDA平板上，20 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d，觀察記錄菌落生長情況，并在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲及產(chǎn)孢情況。

病原菌分子生物學(xué)鑒定：根據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離病原菌基因組DNA，并以此為模板，應(yīng)用ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化后，送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司進(jìn)行測序。所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，下載不同地域來源的同源性較高的序列，用MEGA 4.0軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，分析其親緣關(guān)系。

1.5 常用抗真菌中藥室內(nèi)抑菌效果測定

采用含藥平板進(jìn)行篩選，將10種抗真菌常用中藥顆粒劑根據(jù)質(zhì)量及濃縮倍數(shù)，加去離子水溶解，配成質(zhì)量濃度為2.5 g/mL的溶液。將配好的顆粒劑溶液及PDA培養(yǎng)基分別滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至50～60 ℃時，分別用移液槍吸取不同體積的顆粒劑溶液加入到PDA培養(yǎng)基中，最終配制成含不同單味中藥質(zhì)量濃度為0.3 g/mL PDA培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基完全冷卻，用直徑為1 cm的打孔器在菌落邊緣打取大小相同的菌絲塊，接種于含不同單味中藥的培養(yǎng)基上，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個中藥重復(fù)3 次，每次3個平板，以加入無菌水的PDA培養(yǎng)基作為對照(CK)。每隔24 h觀察記錄1次，采用十字交叉法測量菌落生長直徑，計算各單味中藥的抑制率。菌絲生長抑制率=(對照菌落生長直徑-含中藥培養(yǎng)基菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，應(yīng)用Student-Newman-Keuls多重比較法進(jìn)行顯著性差異檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

經(jīng)柯赫法則驗證，從3個品種的獼猴桃病果中共分離得到5種菌株，依次編號為QD1、QD4、QD5、QD7和QD10，形態(tài)學(xué)鑒定初步將其歸為以下4個屬：QD1為根毛霉屬[Mucor(Rhizomucor)]、QD4和QD7為鏈格孢屬(Alternaria)、QD5為葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)、QD10為間座殼屬(Diaporthe)。

2.1.1 根毛霉屬 根毛霉屬(QD1)病原菌剛接種到PDA培養(yǎng)基上生長時，菌絲白色。20 ℃ 培養(yǎng)7 d后，菌絲上面長出大量小孢子。之后菌絲顏色逐漸加深為乳黃色，孢子卵圓形，大小為(1.7～2.3)μm×(2.5～2.9)μm。該病原菌極易侵染華優(yōu)獼猴桃，接種10 d肉眼可見明顯的發(fā)病癥狀：獼猴桃接種的地方有少量菌絲，從果皮上看無異常，但被侵染的獼猴桃果實部位表面變軟。揭開果皮后，可見果實呈黃色腐爛狀，果蒂也變黃并腐爛(圖1)。

圖1 根毛霉屬(QD1)的形態(tài)特征及侵染獼猴桃的發(fā)病癥狀

2.1.2 鏈格孢屬 鏈格孢屬(QD4)在PDA培養(yǎng)基上為青灰色，菌絲為有隔菌絲，菌絲在生長過程中不產(chǎn)生孢子。發(fā)病的獼猴桃表面明顯有灰白色菌絲，肉眼可見有黏性液體滲出果皮，果實有乙醇味，發(fā)病部位果肉內(nèi)部結(jié)成一塊，明顯呈黃色(圖2)。

圖2 鏈格孢屬(QD4)的形態(tài)特征及侵染獼猴桃的發(fā)病癥狀

同樣為鏈格孢屬的QD7真菌在PDA培養(yǎng)基上生長菌絲為深灰色，20 ℃條件下生長7 d長滿9 cm的平板。菌絲有隔，20 ℃生長5 d后菌絲上產(chǎn)生大量孢子。孢子呈梨形，大小為(2.3～3.6)μm×(4.7.5～8.9)μm。被侵染的獼猴桃表面有大量黑色菌絲，果肉內(nèi)部變黃，腐爛變質(zhì)(圖3)。

圖3 鏈格孢屬(QD7)的形態(tài)特征及侵染獼猴桃的發(fā)病癥狀

2.1.3 葡萄座腔菌屬 葡萄座腔菌屬(QD5)病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長1～5 d的菌絲為白色，從第5天開始，菌絲顏色逐漸加深，最終顯示為灰綠色。顯微鏡觀察，菌絲形態(tài)呈碎片狀，不產(chǎn)生孢子。病原菌侵染獼猴桃的癥狀表現(xiàn)為被侵染處皺縮凹陷，果肉腐爛發(fā)黃(圖4)。

圖4 葡萄座腔菌屬(QD5)的形態(tài)特征及侵染獼猴桃的發(fā)病癥狀

2.1.4 間座殼屬 間座殼屬(QD10)病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長較緩慢，20 ℃條件下培養(yǎng)15～18 d長滿整個平板。菌絲白色，緊貼培養(yǎng)基生長，不易與培養(yǎng)基分離，在培養(yǎng)基上呈同心圓分布。顯微鏡下菌絲較短小，不產(chǎn)生孢子。被病原菌侵染的獼猴桃表面無異樣，但受感染部位明顯變軟，果肉發(fā)黃變質(zhì)(圖5)。

圖5 間座殼屬(QD10)的形態(tài)特征及侵染獼猴桃的發(fā)病癥狀

2.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

以鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹見圖6。結(jié)合該5株病原菌形態(tài)學(xué)特征，將QD1病原菌鑒定為多變根毛霉菌[Mucorirregularis(Rhizomucorvariabilis)]，QD4病原菌鑒定為黑斑病菌(Alternariabrassicae)，QD5病原菌鑒定為葡萄球座菌(Botryosphaeriadothidea)，QD7病原菌鑒定為鏈格孢菌(Alternariaalternate)，QD10病原菌鑒定為間座殼菌(Diaportheeres)。

圖6 基于ITS序列采用鄰近法構(gòu)建菌株QD1、QD4、QD5、QD7、QD10系統(tǒng)發(fā)生樹

2.3 常用抗真菌中藥室內(nèi)抑菌效果

通過含中藥的培養(yǎng)基培養(yǎng)不同菌株，5～10 d測得的抑菌效果(表1)顯示，0.3 g/mL培養(yǎng)基的蛇床子、苦楝皮和連翹對幾種獼猴桃病原菌的抑菌效果較好，這3種中藥對QD7和QD10病原菌菌絲生長的抑制率均在90%及以上。除此之外，對QD1、QD4和QD5病原菌菌絲生長的抑制率也均在70%以上。相反地，總體來說茵陳、板藍(lán)根、薄荷和土茯苓對這5種病原菌菌絲生長速率抑菌效果較差。

表1 不同中藥對獼猴桃貯藏期常見病原菌菌絲的抑制率

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)階段，從獼猴桃病果中分離出來的病原菌均為真菌性病害且種類繁多，段愛莉等[9]從貯藏期霉?fàn)€獼猴桃華優(yōu)、海沃德和秦美果實中分離出的主要病原菌為青霉屬(Penicilliumsp.)，占總菌株的63.3%。本研究并未分離出青霉屬真菌，這可能與貯藏進(jìn)冷藏庫時獼猴桃表面所攜帶的病原菌相關(guān)。與本研究分離出的QD10病原菌發(fā)病癥狀相同，Phomopsisactinidiae(Henn.)引起獼猴桃采后腐爛[10]。病斑大多最初發(fā)生在成熟果實莖端，從莖端逐漸擴(kuò)散，發(fā)病部位開始變得柔軟，剝?nèi)ケ砥ず?，發(fā)病組織顏色比周圍健康組織更淺，呈淡綠色[10]。病原菌從果蒂端侵入而引起獼猴桃果實發(fā)病的原因，有可能與獼猴桃果樹里面的內(nèi)生菌有關(guān)。因此，在獼猴桃的栽培種植中，提高果樹的抗病能力，是延長果實貯藏期的根本。

在病原菌的分離過程中發(fā)現(xiàn)，不同獼猴桃品種感染不同病原菌的發(fā)病率也有差別，總體來說，海沃德品種獼猴桃抗病原菌侵染的能力最強(qiáng)。徐香品種獼猴桃更容易被多變根毛霉菌[Mucorirregularis(Rhizomucorvariabilis)]和葡萄球座菌(Botryosphaeriadothidea)侵染，海沃德品種更易被鏈格孢菌(Alternariaalternata)侵染，華優(yōu)品種則更容易被黑斑病菌(Alternariabrassicae)和間座殼菌(Diaportheeres)侵染，這可能與不同獼猴桃品種的含糖量有關(guān)。趙金梅等[1]從中華獼猴桃褐斑病發(fā)病果實中分離出鏈格孢菌，并發(fā)現(xiàn)海沃德比華優(yōu)獼猴桃更易感病，這與本研究的結(jié)果剛好相反，這可能與獼猴桃栽培方式、采摘時間、貯藏條件有關(guān)系。YOUNG等[11]從采摘后的獼猴桃果腐病果中，也分離到了Botryosphaeria和Diaporthe，這與本研究分離到的QD5和QD10病原菌相同。

在獼猴桃采摘后病原菌防控方面的研究表明，獼猴桃經(jīng)0.08 mol/L氯化鈣[12]、500 GY電子束輻射[13]、5%的抗壞血酸[14]處理、肉桂酸精油熏蒸[15]、80%的富氫水[16]或香芹、茴香油體外處理[17]均可降低其貯藏期霉變率。另外，50%多菌靈可濕性粉劑1 000倍液對葡萄球座菌菌絲生長的抑制效果最好，抑制率高達(dá)91.97%[2]，但這些方法僅限于研究層面，現(xiàn)階段還沒有具體應(yīng)用。程小梅等[18]采用川穹等對貯藏期的獼猴桃進(jìn)行病原菌防治，抑制率高達(dá)92.76%，但其僅針對青霉菌1種菌株作了相關(guān)研究。本研究從10種常見抗菌中藥中篩選出了在獼猴桃貯藏過程中對常見病原菌防控效果較好的3種藥劑(蛇床子、苦楝皮和連翹)，這3種單味中藥對大部分病原菌菌絲生長的抑制率可達(dá)70%以上。因此，采用中藥防治獼猴桃貯藏過程中的病原菌，不僅符合現(xiàn)階段人們對于高品質(zhì)、無公害農(nóng)產(chǎn)品的倡導(dǎo)和追求，且抑制效果較好，更易被果農(nóng)接受，也更容易在獼猴桃的貯藏、保鮮中得到實際應(yīng)用。后期將對篩選出的上述3種中藥進(jìn)行有效配伍，結(jié)合中藥對獼猴桃果實細(xì)胞壁的軟化作用，研究其抑制獼猴桃貯藏中常見病原菌的最佳配伍，以期對獼猴桃貯藏過程常見真菌進(jìn)行切實有效的防控。