鄧祖麗穎，劉雨豐，馬寧寧，陳 陸

(1.鄭州幼兒師范高等?？茖W校，河南 鄭州450000；2.河南農(nóng)業(yè)大學，河南 鄭州450000)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的病原。PCV2主要侵害2～8周齡斷奶仔豬，死亡率高達50%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。PCV2主要經(jīng)口腔、呼吸道等黏膜侵入機體并侵害免疫系統(tǒng)，能直接或間接導致免疫抑制[1-2]。因此，PCV2疫苗設計應側重于誘導機體產(chǎn)生有效的黏膜免疫[3]。圓環(huán)病毒增殖能力較低，常規(guī)滅活疫苗抗原含量不足，免疫反應緩慢而微弱，且易在動物體內(nèi)引起過敏反應，且無法有效誘導病原體特異性黏膜免疫應答[4-5]。CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞及細胞因子水平的變化趨勢可以間接反映感染豬的免疫能力，尤其以IFN-γ參與的Th1型細胞免疫在抗病毒免疫防御中最為重要。腺病毒載體攜帶抗原種類多，抗原遞呈能力強，且產(chǎn)生的免疫力持久、安全性高，適合作為病毒疫苗載體[6]。

Cap蛋白是PCV2的主要免疫原蛋白，含有主要保護性抗原表位,是制備PCV2疫苗的理想靶抗原。目前，各國學者已研究出有效的疫苗，如重組亞單位疫苗、滅活疫苗和DNA疫苗等[7-9]，但許多研究成果仍處于實驗室研究階段。新型基因工程疫苗的價格普遍較高，且其基因改造是否會帶來潛在危害還不清楚[10]。因此，研制高效廉價的新型疫苗尤為重要[11-12]，是增強免疫效果和降低經(jīng)濟損失的關鍵。研究表明，表達PCV2 Cap蛋白的重組腺病毒可誘導動物機體產(chǎn)生特異性抗體[13-16]。鑒于此，在前期構建PCV2 Cap蛋白主要抗原表位重組復制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)的基礎上，將其經(jīng)滴鼻、口服和肌內(nèi)3種免疫途徑免疫小鼠，評價其所誘導的全身性和局部黏膜免疫應答效果，旨在為研發(fā)PCV2新型黏膜免疫疫苗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

PCV2 Cap蛋白主要表位重組復制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)和原核表達的PCV2 Cap蛋白由河南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)傳染病實驗室構建、表達和保存；腺病毒載體(wild-rAd)由南京農(nóng)業(yè)大學姜平教授惠贈；PCV2 YY株由河南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)傳染病實驗室分離、保存；DNA提取試劑盒、SYBR Premix ExTaq酶等均購自TaKaRa公司；FITC-CD3、PE-CD4和PerCP-CD8a單克隆抗體等均購自Biolegend公司；HRP標記兔抗小鼠IgG購自博奧森公司；HRP標記羊抗小鼠IgA購自Bethyl公司；商品化細胞因子ELISA試劑盒購自CST公司。

供試Balb/c小鼠由河南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)傳染病實驗室飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)GenBank公布的PCV2Cap基因序列(登錄號：KU960941.1)，應用Primer Premier 5.0軟件設計實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR ,qPCR)引物。上、下游引物序列分別為5′-TATCAATCTAACCACAGTC-3′和5′-ATGGCGGGAGGAGTAGTT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴增目的基因長276 bp。

1.2.2 免疫和攻毒試驗 將80只6～8周齡的雌性Balb/c小鼠隨機分成4組，每組20只。rAd/Cap/518通過滴鼻(rAd/Cap/518 i.n)、肌內(nèi)注射(rAd/Cap/518 i.m)和口服免疫(rAd/Cap/518 oral)，每只小鼠10lgTCID50，設空腺病毒(wild-rAd)滴鼻免疫(wild-rAd i.n)為對照。首免后14 d以相同劑量和方法加強免疫。加強免疫后14 d，每組取5只小鼠滴鼻攻毒3×105TCID50PCV2 YY株。

1.2.3 間接ELISA檢測抗PCV2特異性IgG和 IgA抗體 采集首免后14、21、28、35、42 d小鼠血清樣品及首免后14、21、28、35 d唾液、肺部灌洗液、腸道灌洗液。用間接ELISA分別檢測PCV2特異性IgG和IgA抗體水平[17]。

1.2.4 T細胞亞群分析及細胞因子檢測 分離首免后14、21、28 d小鼠脾臟淋巴細胞，用含10%犢牛血清的RPMI 1640稀釋至1×107個/mL，加入96孔細胞培養(yǎng)板，100 μL/孔。每孔加入PCV2 Cap蛋白1 μg，5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細胞，PBS液洗2次，分別加入FITC-CD3、PE-CD4和PerCP-CD8a單克隆抗體，避光孵育30 min。洗細胞2次后,用FACS Calibur流式細胞儀分析CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞及CD3+CD8+T細胞亞群百分比。商品化細胞因子ELISA試劑盒檢測IFN-γ、IL-4的分泌水平[18]。

1.2.5 qPCR檢測病毒載量 PCV2 YY株攻毒后14 d，收集小鼠淋巴結、脾臟和肺組織。使用DNA提取試劑盒提取核酸，通過qPCR法檢測PCV2病毒載量[19]。qPCR擴增體系(20 μL)：上、下游引物各0.8 μL，SYBR Premix ExTaq10 μL，樣品DNA模板500 ng，ddH2O補足至20 μL。qPCR擴增條件：94 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GraphPad Prism對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，結果以數(shù)值平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 免疫小鼠血清IgG和唾液、肺部及腸道灌洗液IgA抗體

為檢測全身體液免疫應答，采用間接ELISA方法測定免疫小鼠后14～42 d抗PCV2特異性IgG和 IgA抗體水平(圖1)。免疫后21～42 d，rAd/Cap/518經(jīng)肌內(nèi)注射小鼠誘導產(chǎn)生的血清IgG抗體水平顯著高于wild-rAd對照組及滴鼻和口服免疫組(圖1A)。rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻免疫后21～28 d以及經(jīng)口服免疫后35～42 d小鼠唾液誘導產(chǎn)生的特異性IgA抗體水平均顯著高于對照組(圖1B)。免疫后21～35 d，rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻免疫誘導肺部灌洗液中產(chǎn)生的特異性IgA抗體水平顯著高于對照組(圖1C)。免疫后21～35 d，rAd/Cap/518經(jīng)口服途徑免疫后誘導腸腔灌洗液中產(chǎn)生的特異性IgA抗體水平顯著高于對照組(圖1D)。

A:rAd/Cap/518經(jīng)不同途徑免疫小鼠血清中PCV2特異性IgG抗體動態(tài)變化；B—D:分別為rAd/Cap/518經(jīng)不同途徑免疫小鼠唾液、肺部灌洗液和腸道灌洗液中特異性IgA抗體動態(tài)變化。不同字母表示同一時間不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 免疫小鼠脾臟T淋巴細胞亞群分析

由表1可知，在14、21、28 d，rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻、肌內(nèi)和口服3種途徑免疫誘導產(chǎn)生的CD3+T細胞百分率為46.60%～55.65%，顯著高于對照組(P<0.05)。在21、28 d，rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻免疫誘導產(chǎn)生的 CD3+CD4+T細胞百分率為34.43%～37.29%；在14、21、28 d，rAd/Cap/518經(jīng)肌內(nèi)和口服途徑誘導產(chǎn)生的CD3+CD4+T細胞百分率為36.35%～41.58%，均顯著高于對照組。在14、21、28 d，rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻途徑誘導的CD3+CD8+T細胞百分率為12.39%～18.32%；在28 d，rAd/Cap/518經(jīng)口服免疫誘導的CD3+CD8+T細胞百分率為16.29%，均顯著高于對照組。

表1 rAd/Cap/518經(jīng)不同途徑免疫小鼠脾臟淋巴細胞中T細胞亞群變化

2.3 免疫小鼠脾臟淋巴和腸系膜淋巴結細胞因子檢測

從圖2可以看出，與對照組相比，滴鼻免疫組小鼠脾臟淋巴和腸系膜淋巴結細胞中IFN-γ分泌量顯著升高，分別達到299.5 pg/mL和635.5 pg/mL。各組均未檢測到IL-4。

圖2 不同途徑免疫rAd/Cap/518小鼠脾臟和腸系膜淋巴細胞因子的分泌表達

2.4 qPCR檢測免疫小鼠淋巴結、脾臟和肺組織PCV2病毒載量

從圖3可以看出，與對照組相比，經(jīng)滴鼻、口服和肌內(nèi)3種途徑免疫rAd/Cap/518后，小鼠臟器組織中PCV2病毒載量顯著降低。

圖3 小鼠臟器組織中PCV2 病毒載量

3 結論與討論

PCV2通過黏膜侵入機體，是引起PMWS的主要病原，各國學者均致力于研究有效的疫苗來防控PMWS。本研究將rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻、口服和肌內(nèi)3種免疫途徑免疫小鼠，評價其所誘導的全身性和局部黏膜免疫應答效果。結果顯示，rAd/Cap/518經(jīng)不同途徑免疫小鼠均可不同程度誘導血清PCV2特異性IgG抗體的產(chǎn)生，這與WANG等[15]的報道結果一致。黏膜疫苗能在黏膜部位有效誘導機體產(chǎn)生特異性IgA抗體[20]。rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻和口服免疫誘導產(chǎn)生較高水平的PCV2特異性IgA抗體，這與前人研究結果一致[21-22]。rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻和口服途徑免疫能在唾液、肺部和腸道灌洗液中產(chǎn)生較高水平IgA抗體，肌內(nèi)途徑免疫后期腸道灌洗液中檢出微弱的IgA抗體，與CRAIG等[23]的研究結果一致。本研究結果表明，腺病毒載體疫苗經(jīng)黏膜途徑免疫后可誘導局部黏膜部位產(chǎn)生IgA抗體以及血清IgG抗體。

細胞免疫應答在控制免疫缺陷性疾病中起重要作用[24]。本研究結果顯示，與對照組相比，rAd/Cap/518誘導小鼠脾臟CD3+T細胞含量顯著增加，肌內(nèi)和口服途徑免疫組CD3+CD4+T細胞顯著增加，滴鼻免疫組CD3+CD8+T細胞顯著增加?？梢?，rAd/Cap/518可以誘導細胞免疫反應，且滴鼻免疫可能會起到更好的免疫保護作用。通過檢測細胞因子分泌水平進一步研究rAd/Cap/518所誘導的細胞免疫反應類型，結果顯示，滴鼻免疫組檢測到高水平的IFN-γ，但各組均未檢出IL-4。表明誘導的細胞免疫反應以Th1型為主。攻毒后體內(nèi)病毒載量檢測結果顯示，rAd/Cap/518經(jīng)3種途徑免疫組病毒載量均顯著降低，表明rAd/Cap/518免疫后能有效阻止病毒感染。

綜上，本研究將rAd/Cap/518經(jīng)口服、滴鼻和肌內(nèi)3種途徑免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)經(jīng)滴鼻和口服途徑免疫能誘導全身性和局部黏膜免疫應答，并且能顯著清除PCV2感染，因此其具有很大應用前景。雖然小鼠可作為PCV2感染研究的理想動物模型[25]，但rAd/Cap/518在豬體內(nèi)的應用效果還有待進一步研究。