向 俊 唐萬里 劉 慧 趙紅清

(湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410000)

磺胺類藥物是一種廣譜抗菌藥，性質(zhì)穩(wěn)定，臨床上主要用于預(yù)防和治療感染性疾病。在獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中，因其能夠有效治療和預(yù)防細菌性疾病及寄生蟲病而常作為飼料添加劑或動物疾病治療藥物進行使用[1]。由于磺胺類藥物的半衰期較長，通過任何途徑攝入的磺胺類藥物均會在人體中蓄積，引起過敏反應(yīng)或者使病原有機體產(chǎn)生抗藥性，甚至致癌[2-3]。因此，很多國家對磺胺類藥物的使用范圍及其在動物源性食品中的殘留限度進行了嚴格的規(guī)定。中國農(nóng)業(yè)部公告第235號[4]對磺胺類藥物在畜禽肉及其副產(chǎn)物中的殘留限量值進行了明確規(guī)定：畜禽肉中的磺胺類藥物限量值為100 μg/kg。隨著社會的發(fā)展和生活水平的提高，磺胺類藥物的不合理應(yīng)用導(dǎo)致其在動物性食品中殘留而引起的生態(tài)環(huán)境污染和對人體健康危害的問題備受關(guān)注。

用于磺胺類藥物殘留的分析方法主要有高效液相色譜法[5-6]、液—質(zhì)聯(lián)用法[7-8]、免疫測定法[9-10]等，其中液相技術(shù)分析方法因準確度高、分離度好等優(yōu)點而被廣泛研究，已從單一的液相色譜法、液—質(zhì)聯(lián)用法發(fā)展到液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法[11-14]，前處理方法也從簡單提取發(fā)展到微萃取、固相萃取、加速溶劑萃取等優(yōu)化方法[15-18]，目前，該類方法仍然存在檢測種類少、基質(zhì)干擾多、方法靈敏度不足等缺點。目前湖南地區(qū)對畜禽肉中磺胺類藥物殘留的檢測主要依據(jù)GB/T 21316—2007進行，由于該方法靈敏度較低，一直存在檢出率不高的問題。近些年針對湖南地區(qū)畜禽肉中磺胺類藥物檢測研究較少，相關(guān)文獻也未見報道。研究擬通過優(yōu)化固相萃取樣品前處理，采用液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用的檢測手段，對湖南各地區(qū)生產(chǎn)及銷售的300余批次的畜禽肉樣品中的磺胺類藥物殘留情況進行檢測分析，旨在為湖南地區(qū)畜禽肉中磺胺類藥物殘留監(jiān)管提供可靠依據(jù)，以及為解決磺胺類藥物殘留問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、甲氧芐啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉10種磺胺類標準品：純度≥99%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；

乙腈、正己烷：色譜純，上海安譜科學儀器有限公司；

正丙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

液相系統(tǒng)：SHIMADZU Nexera X2型，日本島津儀器有限公司；

質(zhì)譜系統(tǒng)：AB SCIEX QTRAP?4500型，美國AB儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別稱取上述標準品各10 mg 于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，配制成100 μg/mL的儲備液，于4 ℃冰箱保存。將標準儲備液用乙腈稀釋至所需的標準系列濃度，待用。

1.2.2 液相條件 色譜柱為Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，3 μm)；流動相：A為0.1%甲酸—5 mmol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇溶液；柱溫35 ℃；樣品溫度15 ℃；進樣量5 μL，洗脫梯度：0.0～2.0 min，5% B；2.0～4.0 min，5% B～15% B；4.0～5.0 min，15% B；5.0～8.0 min，15% B～40% B；8.0～10.0 min，40% B～95% B；10.0～16.0 min，95% B；16.0～16.5 min，95% B～5% B；16.5～20.0 min，5% B。

1.2.3 質(zhì)譜條件 系統(tǒng)：AB SCIEX QTRAP?4500；離子源：ESI+；采集方式：MRM；離子化電壓：5.5 kV；離子源溫度：450 ℃；噴霧氣275 800 Pa；輔助加熱氣275 800 Pa；氣簾氣172 375 Pa。

1.2.4 樣品處理 稱取樣品2 g置于玻璃研缽中，再稱取約6 g(精確至0.01 g)C18填料加至試樣上用玻璃杵輕輕研磨，使樣品和填料混合均勻，裝于50 mL具塞螺旋蓋聚四氟乙烯離心管中，加入25 mL乙腈—水(體積比100∶3)溶液，渦旋振蕩1 min，于家用微波爐中在光波模式下微波輻照30 s，3 000 r/min離心5 min，將乙腈層移入100 mL棕色分液漏斗中。離心后的沉淀再加入25 mL乙腈搖勻，微波輔助提取30 s，3 000 r/min離心5 min，合并乙腈提取液，待凈化。提取液中加入25 mL乙腈飽和正己烷溶液，振蕩5 min，將底層乙腈溶液移入150 mL棕色雞心瓶中，加入10 mL正丙醇，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45 ℃水浴中減壓蒸發(fā)至近干，氮氣流吹干。準確加入1 mL乙腈—水(體積比1∶1)溶液，超聲30 s溶解殘渣，將溶解液移入10 mL棕色離心管中，加入0.5 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋2 min，3 000 r/min離心5 min，棄去正己烷溶液，取底層乙腈—水溶液過0.22 μm微孔濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件 將磺胺分別配成100 μg/L的標準溶液，不經(jīng)色譜柱，直接質(zhì)譜進樣，根據(jù)磺胺類藥物分子的化學結(jié)構(gòu)特征，選用ESI+離子化模式，進行母離子掃描和子離子掃描，優(yōu)化二級碎片離子信息，獲得定性離子和定量離子最佳質(zhì)譜條件，具體見表1。

表1 10種磺胺類藥物質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 液相色譜條件優(yōu)化 前期預(yù)試驗比較了甲醇—水、甲醇—0.1%甲酸水、甲醇—0.1%甲酸，5 mmol/L乙酸銨水對各化合物的色譜峰及離子化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)中帶有氨基，呈弱堿性，在ESI+離子化模式下，各磺胺類化合物在中性或堿性流動相體系中的色譜峰形不理想，而在流動相中加入一定比例的甲酸能夠明顯提高離子化效率，且加入少量的乙酸銨更能兼顧不同極性磺胺類藥物的離子化效率。因此，選擇甲醇—0.1%甲酸，5 mmol/L乙酸銨水作為流動相，各磺胺類化合物峰形較好，響應(yīng)較高，各磺胺類標準溶液MRM色譜圖見圖1。

2.1.3 基質(zhì)效應(yīng) 按1.2.4方法處理空白禽肉，添加一定量混合標準溶液制成基質(zhì)加標溶液，與溶劑加標溶液進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10種藥物均存在不同程度的基質(zhì)抑制情況。因此，檢測過程中采用空白基質(zhì)進行標準曲線配制。

2.1.4 線性范圍及方法的檢出限 準確量取1.2.1項下磺胺類標準溶液適量，分別以空白禽肉(以雞肉為代表)基質(zhì)做溶劑，稀釋制備成濃度為10.0，20.0，50.0，100.0，200.0，500.0 ng/mL的系列標準溶液，按1.2色譜條件分析，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得各磺胺類藥物線性回歸方程，結(jié)果見表2，10種磺胺類藥物在2.0～500.0 ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以信噪比S/N=10確定10種磺胺類的定量限為50 μg/kg。

表2 10種磺胺類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量限

2.1.5 回收率及精密度 分別稱取空白雞肉5.0 g，添加3種不同濃度(20，100，200 μg/kg)的10種磺胺類藥物，每個濃度6份，按1.2.4方法進行前處理，計算各磺胺類藥物的回收率和精密度，結(jié)果見表3，雞肉樣品中10種磺胺類藥物在20，100，200 μg/kg加標水平下的回收率范圍分別為80.1%～90.0%，80.6%～91.1%和84.7%～96.4%，相對標準偏差(RSD)范圍分別為4.1%～8.8%，3.7%～9.2%和3.3%～8.8%，表明試驗方法回收率和精密度良好，可滿足試樣的分析要求。

表3 不同濃度磺胺類藥物在雞肉中的回收率及精密度

2.2 方法應(yīng)用

2.2.1 畜禽肉樣品中磺胺類藥物含量水平 采用試驗建立的分析方法對購自湖南省各個地區(qū)的共325批次畜禽肉樣品進行磺胺藥物殘留檢測，結(jié)果見表4。10種磺胺藥物中，甲氧芐啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑3種藥物有檢出，其中磺胺甲噁唑檢出2批次，檢出率為0.62%；磺胺間甲氧嘧啶檢出3批次，檢出率為0.92%；甲氧芐啶檢出16批次，檢出率高達4.92%。甲氧芐啶作為抗菌藥使用范圍非常廣，除單獨使用外，還常與磺胺類藥物聯(lián)用，不僅可增加抗菌力，還可使抗菌譜擴大[19]。其檢出率高主要是因生產(chǎn)者普遍使用該藥物且未規(guī)范用量導(dǎo)致。

表4 湖南地區(qū)畜禽肉樣品中10種磺胺類藥物含量?

2.2.2 湖南省不同地區(qū)畜禽肉樣品中磺胺類藥物含量水平對比 325批次樣品購自湖南省內(nèi)14個不同地區(qū)，其中長沙、益陽等7個地區(qū)的樣品檢出磺胺類藥物，將14個地區(qū)畜禽肉樣品檢出的磺胺含量取平均值進行比較，結(jié)果見圖2。14個地區(qū)中，長沙、益陽、湘潭、懷化、張家界、邵陽、婁底7個地區(qū)畜禽肉樣品中檢出磺胺類藥物，磺胺檢出平均值最低的為長沙市(66.2 μg/kg)，最高的為婁底市(101 μg/kg)，與國家食品安全監(jiān)督抽檢允許的磺胺類最大限量值(100 μg/kg)相比，邵陽、婁底地區(qū)的畜禽肉磺胺類藥物殘留風險性較高，可能與近年來邵陽、婁底地區(qū)出現(xiàn)禽流感等畜禽類疾病現(xiàn)象相對較多，生產(chǎn)者為防治畜禽類疾病而加強磺胺等藥物的使用有關(guān)。

圖2 湖南不同地區(qū)畜禽肉樣品中10種磺胺類藥物的含量

2.2.3 磺胺類藥物在畜禽肉樣品細類中差異情況 325批次畜禽肉樣品中有8批次烏雞肉、2批次土雞肉、1批次普通雞肉、3批次豬肉、2批次豬內(nèi)臟、2批次牛肉、3批次羊肉檢測出磺胺類藥物，總體檢出率達到5.92%，除鴨肉樣品外，其他類樣品均有檢出磺胺類藥物，詳細結(jié)果見表5。其中有11批次雞肉類產(chǎn)品檢出磺胺類藥物，占檢出總批次數(shù)(21批次)的52.4%，說明磺胺類藥物在雞肉樣品中殘留的風險性較大，特別是烏雞肉中磺胺類藥物檢出率達到了烏雞肉樣品總數(shù)的32.0%；與鴨、鵝等需要依靠水域活動生長的禽類飼養(yǎng)方式不同，養(yǎng)殖場大多將雞關(guān)在籠中飼養(yǎng)，狹小的生長環(huán)境、極高的個體密度、有限的通風條件，都使雞在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)疾病的概率性相對較高；烏雞由于其營養(yǎng)價值和藥用價值高，其飼養(yǎng)成本和售價都要高于普通雞種，養(yǎng)殖者為防治烏雞疾病，降低風險，對藥物的使用可能比一般雞種更頻繁[20]。檢出磺胺的8種畜禽肉樣品細類中，檢出磺胺種類數(shù)均為1種，說明湖南省內(nèi)單個畜禽肉細類的磺胺類藥物給藥可能比較單一。

表5 10種磺胺類藥物在湖南地區(qū)畜禽肉樣品細類中的檢出情況

3 結(jié)論

研究通過優(yōu)化前處理方法，實現(xiàn)了液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法快速測定湖南省內(nèi)畜禽肉中10種磺胺類藥物殘留。通過分析發(fā)現(xiàn)，湖南省畜禽肉中磺胺類藥物殘留的風險性依舊存在，尤其是甲氧芐啶在雞肉類樣品中殘留的風險性較高，不同區(qū)域、不同產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留的水平差異性較大。建議加強對市場上雞肉類樣品的抽查力度，在加強食品安全監(jiān)管的同時，也應(yīng)當加強對畜禽肉生產(chǎn)商的食品安全意識培訓和畜禽安全用藥培訓，使生產(chǎn)者能夠合理用藥、安全用藥，藥物研發(fā)環(huán)節(jié)也應(yīng)當注重于研發(fā)對人體危害性更小的畜禽疾病防治用藥。