秦 寧，劉宗文，張 艷，楊 瑜，劉耀河，侯 歌，宋 銳，袁金金

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射治療科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 鄭州 450001

食管癌是指原發(fā)于食管上皮的惡性腫瘤。據(jù)2018年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《世界癌癥報告》統(tǒng)計，全球食管癌新發(fā)病例數(shù)約為57.2萬，在36種癌癥中占3.2%，排第7位；死亡例數(shù)約50.8萬，在36種癌癥中占5.3%，排第6位[1]。在我國，食管癌也是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率分別占我國惡性腫瘤的第5位和第4位[2]。食管癌在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中具有發(fā)病率高，診斷率低，且預(yù)后不佳的特點。食管癌按組織學(xué)分類可分為鱗狀細(xì)胞癌(簡稱鱗癌)和腺癌，亞洲主要的組織學(xué)類型是食管鱗癌[3]，在我國，鱗癌的占比達(dá)90%。

近年研究[4-5]表明Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family member A，RhoA)是Ras超家族中的一種小G蛋白分子，具有GTP酶活性；RhoA對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。隨著對Rho家族研究的逐步深入，一種名為“依賴RhoA的侵襲媒介”(mediator of RhoA-dependent invasion，MRDI)的基因被發(fā)現(xiàn)，它具有促進(jìn)細(xì)胞侵襲和細(xì)胞運(yùn)動的特征，有代謝酶和細(xì)胞侵襲媒介兩種作用。有研究[6-7]顯示，MRDI與轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲性相關(guān)。本實驗采用免疫組化SP法檢測食管鱗癌組織及癌旁組織中MRDI蛋白的表達(dá)，探討MRDI蛋白的表達(dá)與食管癌患者臨床病理參數(shù)及術(shù)后生存的關(guān)系,以及下調(diào)MRDI蛋白表達(dá)后食管鱗癌細(xì)胞株侵襲能力的變化。

1 對象與方法

1.1研究對象鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2014年4月至2015年10月收治的45例食管鱗癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本(含癌和癌旁組織)，均經(jīng)病理確診。45例中男31例，女14例，年齡45～78歲；低分化15例，高中分化30例；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別有5、15、21、4例; 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。入組條件：術(shù)前均未接受過放、化療以及其他特殊治療。EC109和EC9706細(xì)胞由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科捐贈。

1.2免疫組化染色檢測MRDI蛋白的表達(dá)將收集到的食管鱗癌及癌旁組織病理切片經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清工作液封閉等步驟后，加MRDI抗體(Gebtex公司，按1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜，加入適量生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，經(jīng)DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明等步驟，中性樹脂封片進(jìn)行觀察。400倍顯微鏡下選取5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。用PBS代替一抗為陰性對照。細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)小的棕黃色顆粒為陽性。染色結(jié)果評分標(biāo)準(zhǔn)[8]：陽性細(xì)胞百分比<5%計0分，5%～計1分，26%～50%計2分，>50%計3分；陽性細(xì)胞染色淡黃色計1分，深黃色計2分，棕褐色計3分。兩項得分乘積>3分為高表達(dá)，≤3分為低表達(dá)。由病理科的兩名專業(yè)人員使用雙盲法閱片并評分。

1.3入組患者隨訪對45例食管鱗癌患者進(jìn)行隨訪(電話隨訪及查閱本院相關(guān)就診記錄)，了解患者確診食管癌后的治療、生存及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移情況，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。

1.4下調(diào)MRDI的表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響

1.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實驗前EC9706和EC109均轉(zhuǎn)染含綠色熒光蛋白的siFAM NCtrl，熒光顯微鏡下顯示兩種細(xì)胞株生長狀態(tài)良好，且轉(zhuǎn)染效率均在80%以上。將處于對數(shù)生長期的EC109和EC9706細(xì)胞按照3.5×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，分為5組：空白對照組、siNCtrl組(陰性對照組)、MRDI-siRNA#1組、MRDI-siRNA#2組、MRDI-siRNA#3組。待細(xì)胞生長到50%～60%融合時，用上述siRNA和銳博轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并用無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。

1.4.2 qRT-PCR法檢測細(xì)胞中MRDI mRNA的表達(dá) 取分組處理后且細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%的EC109和EC9706細(xì)胞，加入Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計及合成。50 μL PCR體系：1.5 μL cDNA，5 μL 10×PCR buffer，3 μL 20 mmol/L MgCl2，1 μL 10 mmol/L dNTPs，1 μmol/L的上下游引物 各1 μL，0.8 μL Taq酶，36.7 μL DEPC水。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，35～40個循環(huán)；58 ℃ 1 min。用2-ΔΔCt法計算MRDI mRNA的相對表達(dá)量。

表1 MRDI及β-actin引物

1.4.3 Western blot法檢測細(xì)胞中MRDI蛋白的表達(dá) 取分組處理后且細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%的EC109和EC9706細(xì)胞，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，在EP管中超聲裂解2 min，離心后采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液后煮沸備用。根據(jù)凝膠制備試劑盒說明書制備分離膠與濃縮膠，上樣后進(jìn)行電泳，恒壓80 V 120 min后轉(zhuǎn)至恒壓120 V，溴酚藍(lán)臨近膠底部停止電泳。后續(xù)經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、4 ℃一抗(MRDI按1∶1 000稀釋)孵育、二抗孵育，用ECL發(fā)光劑進(jìn)行顯影。用Image J軟件分析，以目的蛋白條帶和內(nèi)參β-tubulin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4.4 Transwell法檢測細(xì)胞的侵襲能力 取處于對數(shù)生長期的EC109和EC9706細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染siNCtrl和轉(zhuǎn)染效果最佳的MRDI-siRNA#2。用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，上室鋪膠后將細(xì)胞接種至上室中，在對應(yīng)的下室加上含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)過夜，用棉簽?zāi)ㄈド鲜抑形创┠さ募?xì)胞，甲醇固定，結(jié)晶紫染色之后，倒置顯微鏡(×400)下觀察并拍照。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。應(yīng)用配對χ2檢驗比較食管鱗癌及癌旁組織中MRDI蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用χ2檢驗或者校正χ2檢驗分析MRDI蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，生存曲線由Kaplan-Meier法繪制。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1食管鱗癌及癌旁組織中MRDI蛋白的表達(dá)情況與癌旁組織[33.3%(15/45)]相比，食管鱗癌組織中MRDI蛋白的高表達(dá)率[66.7%(30/45)]增加(P<0.05)，見表2，圖1A、1B。MRDI蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)，細(xì)胞核亦有少量表達(dá)(圖1B)；癌旁組織中MRDI蛋白主要定位于細(xì)胞核(圖1C)；部分癌旁組織中MRDI蛋白的分布具有積聚現(xiàn)象，主要富集于細(xì)胞質(zhì)膜的前緣(圖1D)。

表2 食管鱗癌及癌旁正常組織中MRDI蛋白的表達(dá) 例

A、C、D：癌旁組織；B：癌組織

2.2食管鱗癌組織中MRDI蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系MRDI蛋白在低分化、病理分期T3+T4期及脈管癌栓陽性的食管鱗癌患者中的表達(dá)升高(表3)。

表3 食管鱗癌組織中MRDI蛋白的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

續(xù)表3

2.3MRDI蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者術(shù)后生存的關(guān)系生存曲線(圖2)表明，與MRDI蛋白低表達(dá)者相比，MRDI蛋白高表達(dá)者預(yù)后差(χ2=5.058，P=0.025)。

圖2 MRDI蛋白表達(dá)與食管鱗癌患者術(shù)后生存的關(guān)系

2.4下調(diào)MRDI后EC9706和EC109細(xì)胞侵襲能力的變化qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，MRDI-siRNA#2轉(zhuǎn)染效果最佳(圖3、4)。與siNCtrl組相比，轉(zhuǎn)染MRDI-siRNA#2后，EC109及EC9706侵襲細(xì)胞數(shù)均減少(圖5)。

1～5：分別為空白對照組、siNCtrl組、MRDI-siRNA#1組、MRDI-siRNA#2組、MRDI-siRNA#3組

EC109：1～5分別為空白對照組、MRDI-siRNA#1組、MRDI-siRNA#2組、MRDI-siRNA#3組、siNCtrl組；EC9706：1～5分別為空白對照組、siNCtrl組、MRDI-siRNA#1組、MRDI-siRNA#2組、MRDI-siRNA#3組

A、B：轉(zhuǎn)染siNCtrl、MRDI-siRNA#2的EC109細(xì)胞；C、D：轉(zhuǎn)染siNCtrl、MRDI-siRNA#2的EC9706細(xì)胞

3 討論

Meta分析[9]顯示79 777名食管癌患者的3 a生存率為46.0%，不同分期、組織學(xué)類型和腫瘤部位的食管癌患者之間存在差異。食管鱗癌具有晚期診斷、死亡率高的特點，盡管過去幾十年在外科和非手術(shù)治療方面取得了進(jìn)展，但由于缺乏合適的早期診斷和有效治療的生物標(biāo)志物，食管鱗癌的預(yù)后仍然很差。

RhoA是哺乳動物Rho GTP酶典型成員之一，其在活性狀態(tài)與非活性狀態(tài)之間相互轉(zhuǎn)換，發(fā)揮一種類似“分子開關(guān)”的作用[10-11]。其活性形式與下游效應(yīng)蛋白相互反應(yīng)可激活細(xì)胞分裂、存活、遷移和黏附等多種生物進(jìn)程[12]，基于這種作用，RhoA的異?；罨?如過表達(dá)、異常突變)可激發(fā)腫瘤細(xì)胞無限增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移機(jī)能。而MRDI基因作為一個依賴RhoA的基因，具有代謝酶和細(xì)胞侵襲媒介的雙重作用。

本研究結(jié)果表明，MRDI在食管鱗癌組織中高表達(dá)，且在低分化、腫瘤浸潤程度深、脈管癌栓陽性的食管鱗癌患者中表達(dá)高；MRDI高表達(dá)者預(yù)后差。另外，免疫組化結(jié)果顯示，食管鱗癌癌旁組織中MRDI主要定位在胞核，少量位于胞質(zhì)，而在食管鱗癌組織中主要在胞質(zhì)，與Kabuyama等[13]在黑色素瘤中的研究結(jié)果一致。即在疾病晚期，MRDI蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)增加，胞核中表達(dá)減少；同時，作者還發(fā)現(xiàn)在部分癌旁組織中MRDI蛋白的分布具有積聚現(xiàn)象，主要富集于細(xì)胞質(zhì)膜的前緣，考慮可能是非癌組織向癌組織轉(zhuǎn)化的中間態(tài)，提示MRDI蛋白表達(dá)的變化較細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變早。因此MRDI基因可能作為一個癌前基因來預(yù)測食管鱗癌的轉(zhuǎn)移與進(jìn)展，且MRDI蛋白的膜定位提示其可能參與細(xì)胞運(yùn)動，對細(xì)胞侵襲、遷移有潛在的控制作用。作者利用siRNA下調(diào)食管癌EC9706和EC109細(xì)胞中MRDI的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的侵襲能力受抑，提示MRDI可能參與啟動細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，然而具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的實驗探究。

可以展望，MRDI作為一個新的基因靶點，可能為抗腫瘤新藥的研發(fā)和食管癌的治療提供新的思路。