李想 于思琪 李彤

摘要：目的 ?探討組成型光形態(tài)發(fā)生因子9信號(hào)復(fù)合體亞基6（CSN6）對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞與SiHa細(xì)胞自噬能力的影響。方法 ?購置宮頸癌HeLa細(xì)胞與SiHa細(xì)胞，并測(cè)定腺病毒中GFP與mRFP表達(dá)水平，標(biāo)記、追蹤LC3，示蹤自噬流的水平;將購置的細(xì)胞放置在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照序列組、CSN6 siRNA組、空載體質(zhì)粒組與CSN6過表達(dá)組，各組細(xì)胞均進(jìn)行相應(yīng)的處理（連續(xù)完成24 h干預(yù)）;采用Western Blot法測(cè)定各組細(xì)胞中CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達(dá)水平，熒光顯微鏡下檢測(cè)兩種細(xì)胞中自噬體個(gè)數(shù)，采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)各組細(xì)胞干預(yù)后增殖抑制率。結(jié)果 ?siCSN6組不同宮頸癌細(xì)胞中自噬體個(gè)數(shù)高于siCtrl組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;siCSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達(dá)水平高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達(dá)水平低于siCtrl組、siCSN6組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;siCSN6組干預(yù)后2、6、12、24、48 h細(xì)胞增殖抑制率高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?轉(zhuǎn)染CSN6能提高宮頸細(xì)胞的自噬水平，而過表達(dá)CSN6則能抑制自噬活性，均會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖抑制率產(chǎn)生影響。

關(guān)鍵詞：組成型光形態(tài)發(fā)生因子9信號(hào)復(fù)合體亞基6;宮頸癌;自噬能力;增殖抑制率

中圖分類號(hào)：R737.33 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.17.021

文章編號(hào)：1006-1959（2020）17-0073-04

Abstract：Objective ?To investigate the effect of constitutive photomorphogenetic factor 9 signaling complex subunit 6 （CSN6） on the autophagy ability of cervical cancer HeLa cells and SiHa cells.Methods ?Purchasing cervical cancer HeLa cells and SiHa cells， and determining the expression levels of GFP and mRFP in adenovirus， labeling and tracking LC3， and tracing the level of autophagic flux; the purchased cells were placed in a 6-well plate for culture and randomly divided into control sequence group， CSN6 siRNA group， empty vector plasmid group and CSN6 overexpression group. Cells in each group were treated accordingly （continuously completed 24 h intervention）; Western Blot method was used to determine the CSN6， LC3 protein，the expression levels of Beclin1 and Atg5， the number of autophagosomes in the two types of cells were detected under a fluorescence microscope， and the proliferation inhibition rate of each group of cells after intervention was detected by the tetramethylazazole blue （MTT） method. Results ?The number of autophagosomes in different cervical cancer cells in the siCSN6 group was higher than that in the siCtrl group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression levels of CSN6， LC3 protein， Beclin1， Atg5 in the siCSN6 group were higher than those in the siCtrl group， siCSN6 group and CSN6 group，the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression levels of CSN6， LC3 protein， Beclin1， Atg5 in the CSN6 group were lower than those in the siCtrl and siCSN6 groups，the difference was statistically significant （P<0.05）;The cell proliferation inhibition rate in the siCSN6 group was higher than that in the siCtrl group， siCSN6 group and CSN6 group at 2， 6， 12， 24， and 48 h after intervention，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion ?Transfection of CSN6 could increase the autophagy level of cervical cells， while overexpression of CSN6 could inhibit the autophagy activity， both of which would affect the cell proliferation inhibition rate.

Key words：Constitutive photomorphogenetic factor 9 signaling complex subunit 6;Cervical cancer; Autophagy;Proliferation inhibition rate

宮頸癌（cervical cancer）是臨床上發(fā)生率較高的女性惡性腫瘤，好發(fā)于30～55歲人群中，常見病因包括[1]HPV感染、多性伴侶、多孕多產(chǎn)、單純皰疹病毒Ⅱ型感染等?；颊甙l(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，隨著病情的不斷發(fā)展，會(huì)出現(xiàn)陰道流血、排液等，影響患者健康、生活。自噬在細(xì)胞中較為常見，能通過自身的溶酶體等將受損的細(xì)胞器/大分子進(jìn)行溶解，以適應(yīng)惡劣的生存環(huán)境[2，3]。研究表明[4]，自噬在機(jī)體中多處于平衡狀態(tài)，當(dāng)自噬發(fā)生異常后則會(huì)誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床對(duì)于自噬研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中能發(fā)揮雙重作用[5，6]。組成型光形態(tài)發(fā)生因子9信號(hào)復(fù)合體亞基6（CSN6）屬于是CSN的關(guān)鍵亞基，且在多種惡性腫瘤中表達(dá)水平較高。同時(shí)，CSN能與E3泛素連接酶相互作用，從而完成腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡的調(diào)節(jié)，但是對(duì)于宮頸癌細(xì)胞自噬的影響研究較少[7，8]。因此，本研究以宮頸癌HeLa細(xì)胞與SiHa細(xì)胞為對(duì)象，探討CSN6對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞與SiHa細(xì)胞自噬能力的影響，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料來源 ?2018年8月～2019年6月購置宮頸癌HeLa細(xì)胞與SiHa細(xì)胞作為對(duì)象，所有細(xì)胞均源于中國上海中科院生物研究所。

1.2儀器與設(shè)備 ?本實(shí)驗(yàn)主要儀器及設(shè)備及廠家情況見表1。

1.3方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)、復(fù)蘇及處理 ?將購置的宮頸癌HeLa細(xì)胞與SiHa細(xì)胞從液氮中取出，37 ℃恒溫水浴鍋中手動(dòng)搖晃（加快細(xì)胞溶解），待2/3體積的凍存液溶解;超凈工作臺(tái)上打開封口膜，放入完全培養(yǎng)液10 ml的離心管中，5 min離心，速度1000 rpm;去除上清，采用DMEM完全培養(yǎng)液5 ml完成細(xì)胞沉淀重懸，利用適當(dāng)力度吹打細(xì)胞，混合后將其放置在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。標(biāo)記相應(yīng)細(xì)胞的類型、處理時(shí)間后，經(jīng)酒精消毒后放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)（5%CO2、溫度37 ℃）。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、是否獲得良好貼壁，當(dāng)培養(yǎng)液變黃后完成細(xì)胞首次全量換液（換液前采用PBS緩沖液完成3次清洗），加入濃度為10.0%的PBS新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合瓶底80.0%以上后完成細(xì)胞傳代培養(yǎng)。取傳代后的細(xì)胞，離心完畢后去除上清，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，調(diào)整細(xì)胞密度，備用[9，10]。

1.3.2自噬雙標(biāo)腺病毒示蹤自噬流 ?采用單體紅色熒光蛋白耦合到綠色熒光蛋白-LC3（mRFP-GFP-L3）串聯(lián)熒光蛋白腺病毒中表達(dá)的GFP與mRFP，并標(biāo)記、追蹤LC3，示蹤自噬流的水平。CFP減弱能指示溶酶體與自噬小體融合形成自噬溶酶體，在顯微鏡下對(duì)于細(xì)胞中存在黃色斑點(diǎn)即為自噬體。采用自噬雙標(biāo)腺病毒完成HeLa細(xì)胞與SiHa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染（每2 h換液1次），連續(xù)進(jìn)行24 h干預(yù)，熒光顯微鏡下每孔取視野5個(gè)，觀察mRFP-GFP-LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)量[11]。

1.3.3細(xì)胞分組與處理 ?取上述處理后的宮頸癌HeLa細(xì)胞與SiHa細(xì)胞，將其放置在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照序列組（siCtrl組）、CSN6 siRNA組（siCSN6組）、空載體質(zhì)粒組（Vector組）與CSN6過表達(dá)組（CSN6組），各組細(xì)胞均進(jìn)行相應(yīng)的處理（連續(xù)完成24 h干預(yù)）。采用slLent-Fect轉(zhuǎn)染試劑向siCtrl組完成陰性對(duì)照序列助燃，siCSN6組轉(zhuǎn)染CSN6 siRNA，各組細(xì)胞均連續(xù)完成24h干預(yù)。同時(shí)，采用Roche轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染Vector組細(xì)胞[pcDNA3.1（+）-空載體質(zhì)粒];采用pcDNA3.1（+）-CSN6過表達(dá)，轉(zhuǎn)染CSN6組細(xì)胞，各組細(xì)胞均連續(xù)完成24 h干預(yù)，熒光顯微鏡下檢測(cè)不同細(xì)胞中自噬體個(gè)數(shù)。

1.3.4自噬相關(guān)基因蛋白水平 ?取各組干預(yù)后的細(xì)胞，加入蛋白裂解液200 μl，30 min裂解，溫度4 ℃，10 min離心，速度為12000 rpm，離心半徑為5.5 cm，上述操作完畢后將獲得的上清移到高壓消毒的EP管中。根據(jù)相關(guān)說明采用Western Blot法測(cè)定各組細(xì)胞中CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達(dá)水平。請(qǐng)各組樣品40 μg完成SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜到聚篇二氟乙烯（PVDF）膜，并利用濃度為5%胎牛血清白蛋白（BSA）完成1 h封閉。同時(shí)，根據(jù)蛋白分子量完成條帶切割，分別加入CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5蛋白一抗，常溫下完成2h孵育，經(jīng)洗膜、顯色、顯影等操作后拍照[12]。

1.3.5細(xì)胞增殖抑制率 ?采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)各組細(xì)胞干預(yù)后增殖抑制率，取四組處理后的細(xì)胞，根據(jù)5×103個(gè)接種在96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的、新鮮配置的ASP培養(yǎng)基200 μl（濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L），各組均連續(xù)完成48 h培養(yǎng)，設(shè)置陰性對(duì)照組（加入等體積不含有ASP的培養(yǎng)基）。向每孔中加入MMT液20 μl，濃度為5 mg/ml，連續(xù)完成4 h孵育，去除上層清液，向每孔中加入DMSO液150 μl，搖床上連續(xù)完成10 min干預(yù)。在酶標(biāo)儀492 nm下完成吸光度值A(chǔ)值測(cè)定，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖率（%）[抑制率=1-A測(cè)定細(xì)胞/A陰性對(duì)照組]×100.00%[13]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ?采用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，行？字2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，行t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同細(xì)胞中自噬體個(gè)數(shù)比較 ?熒光顯微鏡下完成宮頸癌HeLa細(xì)胞與SiHa細(xì)胞中mRFP-GFP-LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)量，siCSN6組不同宮頸癌細(xì)胞中自噬體個(gè)數(shù)高于siCtrl組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2四組自噬相關(guān)基因蛋白水平比較 ?siCSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達(dá)水平高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達(dá)水平低于siCtrl組、siCSN6組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.3四組細(xì)胞增殖抑制率比較 ?siCtrl組、siCSN6組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;siCSN6組干預(yù)后2、6、12、24及48 h細(xì)胞增殖抑制率高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CSN6組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率高于siCtrl組、siCSN6組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

3討論

宮頸癌是女性發(fā)病率較高的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，由于患者發(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，導(dǎo)致遠(yuǎn)期預(yù)后較差。因此，積極研發(fā)宮頸癌新的治療方法、策略成為研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞自噬是真核生物中進(jìn)化保守的、對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)周圍較為重要的過程，該過程中損壞的蛋白或細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，能進(jìn)入溶酶體、液泡中進(jìn)行降解并循環(huán)使用。臨床研究表明：細(xì)胞自噬過程是細(xì)胞成分分解、回收利用的重要基礎(chǔ)，多用于營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下培養(yǎng)的細(xì)胞、植物的免疫反應(yīng)、葉片衰老等。細(xì)胞自噬屬于較為重要的生物學(xué)現(xiàn)象，能直接參與生物的發(fā)育、生長(zhǎng)等過程，當(dāng)細(xì)胞自噬異常時(shí)則會(huì)出現(xiàn)癌細(xì)胞。本研究中，siCSN6組不同宮頸癌細(xì)胞中自噬體個(gè)數(shù)高于siCtrl組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明CSN轉(zhuǎn)染能改變細(xì)胞自噬體的數(shù)量，可能直接參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。CSN6屬于是CSN的關(guān)鍵亞基，在諸多惡性腫瘤中表達(dá)，與致癌活性相關(guān)，且臨床對(duì)于CSN6的研究更多的集中在調(diào)節(jié)E3泛素連接酶介導(dǎo)的癌癥相關(guān)蛋白泛素化水平，從而能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的周期、增殖、轉(zhuǎn)移與凋亡，但是臨床對(duì)于腫瘤細(xì)胞自噬的機(jī)制尚未腸闡明。

CSN最初發(fā)現(xiàn)于南芥中光依賴性生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)錄的阻遏物，屬于是一種泛素-蛋白酶體調(diào)節(jié)劑。臨床研究表明：CSN主要由9個(gè)不同的亞基組成，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的活性有關(guān)。多種腫瘤抑制因子、致癌因子均受到CSN的影響，并且CSN6亦可與E3泛素連接酶相互作用、結(jié)合，能同屆機(jī)體泛素化水平，從而在腫瘤周期的調(diào)節(jié)、腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用。本研究中，Western Blot法測(cè)定結(jié)果表明：siCSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達(dá)水平高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組（P<0.05）;CSN6組CSN6、LC3蛋白、Beclin1、Atg5表達(dá)水平低于siCtrl組、siCSN6組（P<0.05），說明CSN6在宮頸癌細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。既往研究表明：CSN6能提高SCF泛素連接酶的生物活性，能降解哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）活性，從而能調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬作用。CSN6已經(jīng)證實(shí)在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，與致癌活性有關(guān)，能與E3泛素連接酶及相關(guān)的靶蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)其泛素化水平。CSN6能增強(qiáng)SCF泛素連接酶的亞基Fbxw7的自我泛素化與降解。而Fbxw7能靶向降解哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），是調(diào)控自噬起始的關(guān)鍵復(fù)合物。國外學(xué)者研究表明：宮頸癌細(xì)胞中自噬活性水平降低與疾病的發(fā)生有關(guān)，有效的提高腫瘤細(xì)胞自噬活性，能為宮頸癌治療提供新的思路與方法。本研究中，siCSN6組干預(yù)后2、6、12、24及48 h細(xì)胞增殖抑制率高于siCtrl組、siCSN6組及CSN6組（P<0.05），說明CSN6能提高宮頸癌細(xì)胞的姿勢(shì)能力，提高細(xì)胞的增殖抑制率，有望成為宮頸癌新的治療靶點(diǎn)。

總之，轉(zhuǎn)染CSN6能提高宮頸細(xì)胞的自噬水平，過表達(dá)CSN6能抑制自噬活性，均會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖抑制率產(chǎn)生影響，能為宮頸癌治療提供新思路。

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收稿日期：2020-07-08;修回日期：2020-07-23

編輯/成森