陳燕虹，方章福，蔡海榮，莊杰欽，趙子聰，郭永寧，金子淋，張浩波，趙 帥，陳伯鈞

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510006)

隨著工業(yè)革命、城鎮(zhèn)化進(jìn)程加速和汽車(chē)交通工具的普行，空氣污染越來(lái)越嚴(yán)重。近年來(lái)，空氣污染對(duì)人體健康的影響越來(lái)越受到關(guān)注，研究表明，接觸細(xì)顆粒物空氣污染(空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 m，PM2.5)會(huì)增加冠心病等心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。內(nèi)皮損傷是冠心病等動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)和病理基礎(chǔ)。有研究表明，內(nèi)皮損傷在一定程度上和PM2.5暴露相關(guān)[1]。但是目前關(guān)于空氣污染誘發(fā)血管內(nèi)皮功能損傷的模型較少。因此，本試驗(yàn)通過(guò)觀察機(jī)車(chē)尾氣制造空氣污染對(duì)大鼠血脂、內(nèi)皮功能、內(nèi)皮舒張功能和主動(dòng)脈病理變化，探討機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮損傷模型建立的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠，20只，6～7周齡，體重160～180 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002]，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)[許可證號(hào)：SYXK(粵)2015-0104]。大鼠一氧化氮(Nitric oxide，NO)試劑盒，購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司(批號(hào)：SNM195-YQW)；內(nèi)皮素(Endothelin-1,ET-1)試劑盒，購(gòu)自南京金益柏生物科技有限公司(批號(hào)：JEB-13905);氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL) ELISA試劑盒，購(gòu)自北京綠源伯德生物科技有限公司(批號(hào)：DG20862D)。全自動(dòng)生化分析儀，購(gòu)自日本東芝公司；YKY-800顯微鏡，購(gòu)自上海永科光學(xué)儀器有限公司；TD5B離心機(jī)，購(gòu)自江蘇省鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RM6240B型多道生理生物信號(hào)采集器、JZJ01型張力換能器，購(gòu)自四川成都儀器廠。

1.2 動(dòng)物分組和模型建立 20只大鼠給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組各10只，每只分籠喂養(yǎng)。對(duì)照組大鼠置于普通的SPF級(jí)動(dòng)物房，呼吸新鮮空氣。模型組大鼠置于機(jī)車(chē)尾氣暴露房，關(guān)閉暴露房，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，擰動(dòng)摩托車(chē)引擎5 min，關(guān)閉開(kāi)關(guān)，暴露6 h后搬出動(dòng)物，置于普通SPF級(jí)動(dòng)物房。暴露期間，摩托車(chē)尾氣的濃度為1 mg/m3,每周5 d，連續(xù)干預(yù)8周。造模期間所有大鼠均自由飲水和進(jìn)食。

1.3 血脂及NO、ET-1水平測(cè)定 造模8周后，大鼠禁食不禁飲12 h，腹腔麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血10 mL，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。全自?dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯 (Triglyceride cholesterol,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平。硝酸還原酶法檢測(cè)NO水平。放免法檢測(cè)ET-1水平。ELISA法檢測(cè)ox-LDL水平。具體方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 組織H.E.染色病理學(xué)觀察 開(kāi)胸取主動(dòng)脈約2 cm，4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)自來(lái)水沖洗，酒精行梯度脫水，用石蠟包埋,制成4 μm切片，用二甲苯脫蠟，再進(jìn)行H.E.染色。染色后用光鏡定位于血管內(nèi)膜觀察。

1.5 主動(dòng)脈內(nèi)皮功能測(cè)定 取一部分胸主動(dòng)脈置于Krebs-Henseleit液中，剪成3 mm的血管環(huán)，連接多道生理生物信號(hào)采集器及張力換能器后，調(diào)整靜息張力2 g，再給予KCl預(yù)刺激2次，再給予去甲腎上腺素預(yù)收縮血管，穩(wěn)定后給予濃度梯度的乙酰膽堿(Acetylcholine，Ach)(內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張反應(yīng))和硝普鈉(Sodium nitroprusside，SNP)(內(nèi)皮非依賴(lài)性血管舒張反應(yīng))誘導(dǎo)血管舒張反應(yīng)，同步記錄血管張力的變化。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血脂水平的比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL、ox-LDL明顯升高(P<0.05)，而HDL明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血脂水平的比較Table 1 Comparison of blood lipid levels in each group of rats

2.2 各組大鼠NO、ET-1的比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清NO明顯降低(P<0.05)，ET-1明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠由Ach介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張程度明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠NO、ET-1的比較Table 2 Comparison of NO and ET-1 levels in each group of rats

2.4 各組大鼠血管內(nèi)皮非依賴(lài)性血管舒張功能比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠由SNP介導(dǎo)的內(nèi)皮非依賴(lài)性舒張程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.5 各組大鼠胸主動(dòng)脈病理變化 對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈可見(jiàn)血管內(nèi)膜無(wú)增厚，內(nèi)皮細(xì)胞排列較整齊，大小較一致(中插彩版圖1A)；模型組大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)膜增厚，突向管腔，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)較多嗜中性粒細(xì)胞(中插彩版圖1B)。

表3 各組大鼠血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能比較Table 3 Comparison of the vascular endothelial-dependent diastolic function in each group of rats

表4 各組大鼠血管內(nèi)皮非依賴(lài)性舒張功能比較Table 4 Comparison of the vascular endothelium-independent diastolic function in each group of rats

3 討論

隨著社會(huì)的進(jìn)步和生活方式的改變，動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)病率越來(lái)越高，并且呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。Zhao X等[2]研究發(fā)現(xiàn)，空氣污染同樣與心血管疾病密切相關(guān)，是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的重要致病因素。血管內(nèi)皮功能損傷是冠心病等動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮不僅是血液和血管之間的重要屏障,而且是代謝內(nèi)分泌器官,可以釋放多種血管活性物質(zhì),包括NO、ET-1等,在調(diào)節(jié)血管張力等方面有重要作用[3-5]。內(nèi)皮損傷指是指NO和ET-1失衡引起的內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能受損[6-7]。NO可通過(guò)激活鈣-鈉離子通道活性、抑制血管平滑肌細(xì)胞增生和遷移、抑制內(nèi)皮素等縮血管物質(zhì)分泌、抑制粘附因子的表達(dá)及血小板的凝聚等途徑預(yù)防血栓形成。ET是目前已知的最強(qiáng)的收縮血管因子，在人VEC主要分布的是ET-1，有強(qiáng)大的縮血管作用[8-9]。因此NO分泌減少或活性降低或ET-1增加均可提示血管內(nèi)皮損傷。

血管內(nèi)皮損傷與脂質(zhì)密切相關(guān)，血液中增加的LDL可損傷血管內(nèi)膜，使內(nèi)皮細(xì)胞特性發(fā)生改變，使單核細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的粘附力增加，增加其粘附在內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量，通過(guò)趨化在內(nèi)皮細(xì)胞間遷移，進(jìn)入內(nèi)膜后單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過(guò)清道夫受體吞噬大量脂質(zhì)，主要為內(nèi)皮下大量沉積的ox-LDL。ox-LDL可以通過(guò)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體,上調(diào)相關(guān)基因及蛋白表達(dá),抑制NO和促進(jìn)ET-1的生成,誘導(dǎo)血管舒縮功能障礙,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子和細(xì)胞因子的生成來(lái)?yè)p傷內(nèi)皮功能。ox-LDL還對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有毒性作用，巨噬細(xì)胞在內(nèi)膜下的積聚導(dǎo)致內(nèi)膜進(jìn)一步改變[10-11]。而乙酰膽堿引起的血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張主要由一氧化氮，前列環(huán)素和內(nèi)皮來(lái)源的超極化因子調(diào)節(jié)，其中NO是最主要的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張因子之一。

長(zhǎng)期暴露于PM2.5環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)展。近年來(lái)有研究結(jié)果顯示，PM2.5可能引起心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[12-13]。Naghavi M等[14-15]證實(shí)，PM2.5可以通過(guò)內(nèi)皮功能受損等途徑影響血管的彈性和管徑的變化。趙金鐲等[16]觀察大氣PM2.5對(duì)大鼠心血管系統(tǒng)的急性作用,結(jié)果顯示,心電圖缺血改變,心臟自主節(jié)律功能降低,血壓和心肌酶學(xué)升高,且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。因此，PM2.5可能通過(guò)內(nèi)皮損傷進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。但是目前關(guān)于空氣污染致內(nèi)皮損傷的模型尚不成熟。本試驗(yàn)通過(guò)機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣誘導(dǎo)空氣污染大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠TC、TG、LDL、ox-LDL、ET-1明顯升高，而NO、對(duì)Ach內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能和HDL含量降低，胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂。提示機(jī)車(chē)尾氣可引起內(nèi)皮功能障礙，誘導(dǎo)大鼠內(nèi)皮損傷模型。