王楠 劉明國 萬雙秀 李金芮 李翌 姜勛昊 姜莉莉*

（1，菏澤學(xué)院藥學(xué)院 274015；2，山東省鄆城誠信醫(yī)院 274700）

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) 是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)造血前體細(xì)胞的存活和分化[1,2]。GCSF可刺激特定骨髓前體細(xì)胞增殖、分化成粒細(xì)胞，刺激多能干細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的形成[3,4]。作為免疫刺激劑，GM-CSF 可直接作用于免疫細(xì)胞，具有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)效果[5,6]。GM-CSF 作為一種理想的免疫佐劑，能增強(qiáng)腫瘤疫苗的免疫效果。GM-CSF 對動物機(jī)體的抗感染免疫過程具有高效調(diào)節(jié)作用，能有效增強(qiáng)機(jī)體對疾病的免疫抵抗力，抑制腫瘤惡化、炎癥、自身免疫性疾病的作用。GM-CSF 還參與了卵泡發(fā)育和排卵等生理過程[7]，研究表明，GM-CSF 在PI3K/AKT通路中也發(fā)揮重要作用[8,9]。本研究克隆山羊GM-CSF 基因，并對其進(jìn)行序列和生物信息學(xué)分析預(yù)測，為進(jìn)一步研究GMCSF 的功能及抗病毒的分子機(jī)制提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RNAsimple 總RNA 提取試劑盒、FastKing cDNA 合成試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 聚合酶、D2000 DNA Marker、DNA回收試劑盒、DH5α 感受態(tài)、pGM-T 載體，T4 DNA 連接酶，均購自TIANGEN 公司；LB 培養(yǎng)基，購自Solarbio 公司；PCR儀、全自動數(shù)碼凝膠成像儀、臺式高速冷凍離心機(jī)。

1.2 引物設(shè)計

參考Genbank 中已發(fā)表的山羊CM-GSF 基因序列（登錄號：X_53561.1），設(shè)計GM-CSF 基因RT-PCR 擴(kuò)增引物F/R，F(xiàn)：5’-ATGTGGCTGCAGAACCTGCTTC-3’；R：5’-CACTTCTGGACTGGTTCCCAG-3’，引物由華大基因生物科技有限公司合成。

1.3 PCR 擴(kuò)增CM-GSF 基因

Trizol 法提取山羊脾臟組織RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以提取的cDNA 為模板，用引物F/R 擴(kuò)增CM-GSF 基因。PCR 反應(yīng)體系50μl:2×Taq PCR MasterMix 25μl，cDNA 模板1μl，上下游引物各2μl，ddH2O 20μl。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共3077 個循環(huán)；72℃延伸10min，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行序列測定。

1.4 CM-GSF 編碼氨基酸序列理化特性分析

使用在線工具ProtParam 分析CM-GSF 編碼氨基酸理化特性。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 GM-CSF 基因PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，如附圖所示，擴(kuò)增基因片段在500bp 左右，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 GM-CSF 基因核苷酸序列分析

用DNA Star 軟件分析印度黑羚GM-CSF 基因的核苷酸序列，結(jié)果表明，GM-CSF 基因的CDs 區(qū)全長435bp，其中胞嘧啶（C）在四種堿基中含量最高。A（23.3%）、C（31.1%）、G（24.2%）、T（21.4%），且（G+C）%為55.3%，高于（A+T）%，說明GM-CSF 編碼區(qū)的DNA 雙鏈較穩(wěn)定。

2.3 GM-CSF 基因編碼氨基酸序列理化特性分析

使用在線工具ProtParam 對GM-CSF 的編碼氨基酸序列分析，結(jié)果表明印度黑羚的GM-CSF 蛋白分子化學(xué)式為C727H1141N187O217S10，理論等電點(diǎn)為5.76。在編碼的144個氨基酸中含量最多氨基酸是Leu (L)，占比11.8%，含量最低的是Tyr（Y），占比1.4%。編碼蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為47.27，推測，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。在哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的半衰期為30h，脂肪系數(shù)為81.87，蛋白質(zhì)的疏水性預(yù)測為-0.160。

3 討論

GM-CSF 是一種具有種屬特異性且極具開發(fā)潛力的造血生長因子。近年來，因其對免疫系統(tǒng)具有多項調(diào)節(jié)功能，已被研發(fā)成為免疫佐劑或抗腫瘤治療藥廣泛在臨床實(shí)踐中應(yīng)用，多項臨床實(shí)踐反饋的結(jié)果也已證實(shí)其是一種低毒且高效的免疫佐劑，具有提高疫苗免疫原性的作用。因GM-CSF 可由多種免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、巨細(xì)胞、纖維細(xì)胞、T 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）分泌，故可通過誘導(dǎo)小細(xì)胞癌分化的途徑來抑制腫瘤的惡化，有效降低免疫激活因子和炎性細(xì)胞因子活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，故又被稱之為分化誘導(dǎo)器[10]。GM-CSF 基因也可通過刺激樹突狀細(xì)胞和B 細(xì)胞等來分泌細(xì)胞因子，并與所生成的細(xì)胞因子產(chǎn)生協(xié)同作用，以達(dá)到增強(qiáng)免疫效用的功能[11]。本研究成功擴(kuò)增山羊GM-CSF 基因，研究成果對深入研究山羊GM-CSF 基因及其功能具有重要意義，為高效、安全免疫佐劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。