欒生超,王建新
(陜西省榆林市林業(yè)工作站, 陜西 榆林, 719000)
紅樹莓(RubusidaeusL.)是一種薔薇科懸鉤子屬的漿果,果實多汁可口,營養(yǎng)豐富,富含多酚、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)、水楊酸和樹莓酮等多種生物活性成分[1-3],具有良好的藥食同源性。樹莓也是一種很好的多糖來源[4],有些品種多糖含量甚至高達(dá)12%[5]。目前,國內(nèi)對于紅樹莓多糖的研究報道較少。
乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、緩解過敏和降低膽固醇等作用[6-9],能夠降低腸道中引發(fā)致癌的相關(guān)酶(如葡萄糖醛酸酶、硝基還原酶)活性[10]。雙歧桿菌作為維持人體腸道菌群平衡的有益菌[11],一直廣泛應(yīng)用于飲料、乳制品等食品加工中[12]。研究表明,黑加侖果汁中的多糖可以抑制腸道沙門氏菌生長并促進(jìn)乳桿菌增殖[13];低叢藍(lán)莓果實中的多糖能夠促進(jìn)鼠李糖乳桿菌的腸道定植[14];枸杞多糖能促進(jìn)乳酸菌增殖[15]。然而,有關(guān)紅樹莓多糖與乳酸菌生長關(guān)系的研究報道較少。
我國野生樹莓資源豐富,樹莓產(chǎn)量逐年提高[16],開發(fā)高值化加工方式有助于推進(jìn)樹莓種植業(yè)的發(fā)展。本研究以粗多糖得率為指標(biāo),通過單因素與響應(yīng)面正文試驗,探究樹莓提取物的適宜制備參數(shù);將樹莓提取物加入MRS培養(yǎng)基,探討樹莓多糖與乳酸菌生長的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,對乳酸菌制備發(fā)酵樹莓飲料的理化與感官特性進(jìn)行評估,旨在為樹莓果實的進(jìn)一步利用提供依據(jù)。
供試菌株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)121、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM,上海杜邦公司;長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)1.218 6,北京林業(yè)大學(xué)生物學(xué)院林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室。首先,取1.0 g冷凍干燥菌粉到1.0 mL無菌蒸餾水中溶解,按照10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將乳桿菌和雙歧桿菌分別接種于 MRS液體培養(yǎng)基和BBL液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h,傳代2次恢復(fù)菌株活力。
紅樹莓果實品種為海爾特茲(Heritage),由陜西省榆林市林業(yè)工作站提供。
無水乙醇、苯酚,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;濃H2SO4、石油醚,北京化工廠。以上試劑均為分析純。乙腈(色譜純),賽默飛世爾科技(中國)有限公司。
LC-20AT高效液相色譜儀,日本島津公司;FD-1冷凍干燥機(jī),北京德天佑科技發(fā)展有限公司;QsonicaQ700智能型超聲波破碎儀,奧然科技有限公司;GL-20G-II高速冷凍離心機(jī),武漢華科達(dá)實驗設(shè)備有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵,上海振捷實驗設(shè)備有限公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。
果實多糖含量采用高效液相色譜法測定。參照GB 5009.8—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》第一法,選用氨基色譜柱(250 mm×4.6 mm);流動相:V(乙腈)∶V(水)=70∶30;流速:1.0 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;示差折光檢測器溫度:40 ℃;蒸發(fā)光散射檢測器溫度:80~90 ℃;氮氣壓力:508 kPa。
果實中蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定。稱取4.0 g樹莓果漿于消化管中,再加0.4 g CuSO4、0.6 g K2SO4及20.0 mL濃H2SO4于消化爐中消化。消化爐溫度達(dá)到420 ℃后,持續(xù)消化1 h,再取出冷卻,加入50.0 mL蒸餾水于自動凱氏定氮儀上測定。
果實中脂肪的測定采用索氏抽提法。稱量3.0 g樹莓果漿,100 ℃烘箱中烘干后取出研細(xì),全部移入濾紙筒內(nèi)。將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內(nèi),連接已經(jīng)干燥至恒定質(zhì)量的接收瓶,使用石油醚不斷回流抽提8 h。提取結(jié)束后取下接收瓶,待接收瓶內(nèi)溶劑剩余2.0 mL時在水浴上蒸干,再于100 ℃干燥1 h,冷卻后稱量。重復(fù)以上操作直至2次稱量差≤2 mg。
其余營養(yǎng)元素的具體測定方法見表2。
樹莓提取物制備工藝流程:
樹莓果漿 →水浴浸提 →果渣超聲 → 合并抽濾 →濾液濃縮 → 醇沉→ 離心(收集沉淀)→ 冷凍干燥 → 收集
樹莓提取物收集后,測定其多糖含量。準(zhǔn)確稱取0.1 g樹莓提取物溶解于適量蒸餾水中,吸取0.1 mL提取物溶液,分別加入1.9 mL蒸餾水,空白對照為2.0 mL蒸餾水,之后加入1.0 mL 60 g/L苯酚溶液,搖勻后迅速加5.0 mL濃H2SO4于試管中,搖勻后置于沸水浴中加熱15 min,迅速冷卻至室溫,測定OD490 nm,按公式(1)計算糖含量:
(1)
式中:ρ,溶液質(zhì)量濃度,mg/mL;D,稀釋倍數(shù);V,提取液體積,mL;m,樣品干質(zhì)量,g。
1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
準(zhǔn)確稱取烘干至恒定質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25.0 mg,用蒸餾水定容至250 mL容量瓶中,即得到0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于試管中,加蒸餾水至2.0 mL,空白對照加2.0 mL蒸餾水,再各加入1.0 mL 60 g/L的苯酚溶液,搖勻后再迅速加入5.0 mL濃H2SO4,搖勻后沸水浴中加熱15 min,迅速冷卻至室溫,測定OD490 nm,以葡萄糖質(zhì)量濃度為x,吸光值為y,得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=13.25x-0.006 7,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7。
1.4.2 料液比選擇
準(zhǔn)確稱取樹莓果漿每份50 g,按照料液比1∶2、1∶3、1∶4和1∶5(g∶mL)分別加入蒸餾水,在300 W、40 kHz超聲水浴處理40 min,取出后8 000 r/min離心10 min,冷卻至室溫取出上清液,將沉淀置于超聲波破碎儀中破碎15 min(工作5 s,間隔5 s),之后與上清液合并抽濾,將濾液在60 ℃、40 r/min下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮濾液后,按照濾液體積保證乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%,在4 ℃下醇沉24 h,然后8 000 r/min離心10 min收集沉淀物,冷凍干燥即得到樹莓提取物。
1.4.3 提取時間選擇
準(zhǔn)確稱取樹莓果漿每份50 g,按照料液比1∶3(g∶mL)分別加入蒸餾水,在300 W、40 kHz超聲水浴中分別處理30、40、50和60 min,后續(xù)步驟與1.4.2方法一致。
1.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇
準(zhǔn)確稱取樹莓果漿每份50 g,按照料液比1∶3(g∶mL)分別加入蒸餾水,在300 W、40 kHz超聲水浴中處理40 min,醇沉前步驟與1.4.2方法一致,之后按照濾液體積保證乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、75%、85%和95%,在4 ℃下醇沉24 h,8 000 r/min離心10 min收集沉淀物,冷凍干燥即得到樹莓提取物。
1.4.5 響應(yīng)面分析
以料液比A、超聲時間B和乙醇體積分?jǐn)?shù)C為自變量,粗多糖提取率Y為因變量,設(shè)計響應(yīng)面實驗,因素水平設(shè)置如表1所示。
表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels for optimizing extraction of raspberry polysaccharide via response surface analysis
配制MRS培養(yǎng)基和BBL培養(yǎng)基[17],同時按照每升MRS液體培養(yǎng)基中20 g葡萄糖+5 g樹莓提取物、15 g葡萄糖+5 g樹莓提取物的比例分別配制樹莓改良MRS液體培養(yǎng)基,按照每升BBL液體培養(yǎng)基中20 g葡萄糖+5 g樹莓提取物的比例配制樹莓改良BBL液體培養(yǎng)基。其中樹莓提取物溶液使用0.22 μm針頭式過濾器過濾以達(dá)到除菌目的。其余組分則使用高壓滅菌鍋在121 ℃滅菌20 min。接著在無菌環(huán)境中混合并使用滅菌的NaOH溶液(1 mol/L)調(diào)節(jié)改良培養(yǎng)基pH至6.5。
將活化好的植物乳桿菌121、嗜酸乳桿菌NCFM和長雙歧桿菌1.2186分別按照5%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入MRS培養(yǎng)基、BBL培養(yǎng)基及對應(yīng)的改良培養(yǎng)基中,在37 ℃培養(yǎng)12 h,其中BBL培養(yǎng)基與BBL改良培養(yǎng)基置于無氧環(huán)境中培養(yǎng),然后進(jìn)行平板計數(shù)[18]。
取樹莓鮮果分為等質(zhì)量的2份,將其中一份樹莓鮮果打漿,依次用普通濾紙、0.80、0.45和0.22 μm超濾膜減壓真空抽濾,過濾出澄清果汁。然后將另一份樹莓鮮果提取物與已過濾除菌的樹莓果汁混合。將混合后的果汁攪拌均勻,分為等體積的2組,一組按照108CFU/100 mL的接種量接入長雙歧桿菌1.2186,置于37 ℃靜置發(fā)酵12 h,接著轉(zhuǎn)入4 ℃貯藏 24 h。另一組果汁則一直貯藏于4 ℃。
依據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]測定2組樹莓果汁中的總酸、揮發(fā)性酸和pH等指標(biāo),依據(jù)GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》[20]測定2組樹莓果汁中的總黃酮。花色苷含量的測定則采用吸光光度法測定矢車菊-3-葡萄糖苷(樹莓中的主要花色苷)的濃度,分別在pH值為1.0和4.5的條件下,測定OD510 nm計算獲得花色苷含量[21]。單寧和總酚的測定方法分別參考陳國剛等[22]和郎惠云等[23]的方法。
取2組果汁各2.0 mL,加入2.0 mL 0.1 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy1,DPPH)無水乙醇溶液,搖勻,靜置20 min。以無水乙醇作為空白,測定OD517 nm值記為A樣品;將樣品果汁稀釋,按照相同方法測得吸光度得A對照;將2.0 mL的DPPH溶液與無水乙醇混合,靜置20 min后按照相同方法測得吸光度得A空白[24-25]。再按公式(2)計算出DPPH自由基清除率:
(2)
用0.45 μm的針頭式過濾器過濾樣品果汁,用分光光度計測定OD450 nm、OD520 nm、OD570 nm和OD630 nm,根據(jù)公式計算出三色值X、Y、Z,從而得出CIE1976Lab參數(shù)L*、a*、b*[26]。
將接種長雙歧桿菌1.2186的樹莓果汁與未接種的樹莓果汁隨機(jī)編碼,放在通風(fēng)良好、無任何氣味的房間內(nèi),選擇20名受過感官評價訓(xùn)練的人員,從外觀(包括顏色熟悉度、顏色深淺和澄清度)、香氣(包括香氣熟悉度、香氣強(qiáng)度和香氣濃郁度)、口感(包括口感熟悉度、甜度、酸度、苦度、澀度和余味強(qiáng)度)方面進(jìn)行感官評價。感官評價打分均以7分為標(biāo)準(zhǔn),并統(tǒng)計分析20位評價人員的打分結(jié)果。
本研究中所有試驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用Origin 2018軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,響應(yīng)面設(shè)計采用 Design Expert 11.0軟件完成。實驗數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
海爾特茲樹莓中的營養(yǎng)成分構(gòu)成如表2所示。結(jié)果表明,海爾特茲樹莓鮮果中Ca、Fe、K和P等微量元素含量明顯較其他品種高[27]。樹莓鮮果中主要的單糖組分為果糖及葡萄糖,而粗多糖在沒有優(yōu)化提取工藝時得率僅為0.21%,與延?,摰萚27]的研究有較大差異。因此,后續(xù)實驗對樹莓粗多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。綜合對比樹莓鮮果的營養(yǎng)構(gòu)成與MRS培養(yǎng)基[18],可知樹莓鮮果中有充足的碳源,微量元素與維生素可以供微生物利用,但是蛋白質(zhì)比較匱乏。此外,樹莓鮮果中總酸(以檸檬酸計)含量為(1.557±0.002) g/100 g,酸度較高,因此,若使用樹莓提取物培養(yǎng)乳酸菌時需要調(diào)節(jié)pH。
2.2.1 單因素試驗分析
圖1-a、圖1-b、圖1-c分別是按照不同料液比、體積分?jǐn)?shù)和超聲時間制備樹莓提取物后,提取物中粗多糖得率的變化。
表2 樹莓鮮果營養(yǎng)成分表Table 2 Raspberry nutrition facts
由圖1可知,當(dāng)提取的料液比為1∶3(g∶mL)時,粗多糖得率達(dá)到最大值2.794%。當(dāng)超聲時間達(dá)到50 min時,粗多糖得率達(dá)到最大值2.859%;在醇沉過程中,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時,粗多糖得率最大,為3.611%。
a-料液比;b-乙醇體積分?jǐn)?shù);c-超聲時間圖1 提取因素對粗多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction factors on extraction rate of crude polysacoharide
2.2.2 響應(yīng)面設(shè)計分析
響應(yīng)面模型F值為25.24,置信區(qū)間達(dá)99.8%,且P<0.01,說明該模型具有顯著性[28],且失擬項P<0.01,失擬項顯著,模型構(gòu)建成功。利用 Design Expert 11 軟件進(jìn)行多元擬合,獲得提取工藝對料液比(A)、超聲時間(B)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)的二次多項回歸模型方程為:Y=3.38+0.145 9A+0.267 6B+0.341C+0.089AB+0.055 3AC+0.116 2BC-0.561 6A2+0.037 9B2-0.109 3C2。圖2為響應(yīng)曲面圖,結(jié)合方差分析結(jié)果可知,3個因素對樹莓粗多糖提取率的影響程度由大到小依次是乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、料液比。由圖2可知,在料液比約為1∶3(g∶mL)時,樹莓粗多糖得率最高,樹莓粗多糖得率隨超聲水浴時間變長而升高,隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而升高。樹莓提取物制備的理論最佳工藝為料液比1∶3.191(g∶mL)、超聲時間53.85 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)85.64%,最優(yōu)工藝條件下樹莓粗多糖的得率理論值為3.66%。在此條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗,樹莓粗多糖的得率為3.88%,與理論值接近,表明響應(yīng)曲面優(yōu)化的工藝條件可行。
a-A,B互相影響; b-B,C 互相影響;c-A,C 互相影響圖2 提取因素對粗多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots of the effect of extraction factors on extraction rate of crude polysaccharide
由圖3可知,對于植物乳桿菌121和嗜酸乳桿菌NCFM,改良樹莓MRS培養(yǎng)基對于菌株的增殖作用并不明顯,甚至加入樹莓提取物之后,菌株生長反而受到了抑制。但是對于長雙歧桿菌1.218 6,添加5 g樹莓提取物的BBL改良培養(yǎng)基活菌數(shù)高于普通BBL培養(yǎng)基,說明樹莓提取物對于長雙歧桿菌1.218 6生長有較好的促進(jìn)作用。
圖3 各培養(yǎng)基乳酸菌生長情況Fig.3 Growth of lactic acid bacteria in different media
表3對比了接種長雙歧桿菌1.2186樹莓果汁與未接種樹莓果汁之間的理化指標(biāo)。未接種樹莓果汁中揮發(fā)酸高達(dá)1.349 g/L,而接種菌的樹莓果汁揮發(fā)酸含量更高,達(dá)2.280 g/L,但是其pH之間差異不顯著。接種菌的樹莓果汁的花色苷、單寧和黃酮等活性物質(zhì)含量更高,同時也有著更高的DPPH自由基清除率,達(dá)94.20%。一般來說,乳酸菌的抗氧化機(jī)制主要包括自身產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)[如谷胱甘肽(glutathione,GSH)、葉酸],參與調(diào)節(jié)抗氧化信號通路從而下調(diào)活性氧自由基的產(chǎn)生[29]。此外,已有研究表明,植物中的黃酮(如荷葉黃酮)可以提高2種益生菌的胞內(nèi)SOD和GSH酶活力,對保加利亞乳桿菌的抗氧化能力有明顯協(xié)同增效作用[30],這可能是加入長雙歧桿菌的樹莓果汁表現(xiàn)出更強(qiáng)DPPH自由基清除能力的原因。CIELab值分析表明,L*、a*、b*和Cab飽和度值均存在顯著性差異,Hab色調(diào)角不存在顯著性差異,并且接種長雙歧桿菌1.2186的樹莓果汁飽和度較高、明亮度高,而未接種菌株的樹莓果汁偏紅色色調(diào)的趨勢更加明顯。顯然,2種果汁在上述指標(biāo)上存在顯著差異。
表3 兩種樹莓果汁的理化指標(biāo)Table 3 Physical and chemical indexes of two kinds of raspberry juice
進(jìn)一步對2種樹莓果汁進(jìn)行感官評價,由外觀、香氣評價雷達(dá)圖(圖4)可知,2種果汁的顏色評分均較高,果汁的顏色偏淺;在香氣濃郁度方面,整體打分較低,說明香氣較淡。整體來看,結(jié)合顯著性差異分析,2種果汁在香氣上無顯著性差異,但在外感描述上,顏色熟悉度、顏色深淺和澄清度3方面均存在顯著性差異。
圖4 外觀、香氣評價雷達(dá)圖Fig.4 Radar map about appearance and aroma evaluation of raspberry juice
由口感評價數(shù)據(jù)分析結(jié)果(圖5)可知,在甜度、酸度、澀度和余味強(qiáng)度這4項評價指標(biāo)上,2種果汁無顯著性差異,而在口感熟悉度、苦度這2個評價指標(biāo)上,兩者存在顯著性差異。接種長雙歧桿菌1.2186的果汁口感熟悉度較差,苦度相對較低。因此,在果汁開發(fā)過程中應(yīng)該注意調(diào)節(jié)苦度。
圖5 口感評價雷達(dá)圖Fig.5 Radar map about taste evaluation of raspberry juice
(1)本研究以海爾特茲品種的紅樹莓為原料,確定其粗多糖提取工藝為料液比1∶3.191(g∶mL)、超聲時間53.85 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)85.64%,粗多糖得率為3.88%;體外培養(yǎng)乳酸菌實驗證實樹莓提取物可以被一些乳酸菌利用,如長雙歧桿菌1.218 6,這可能是由于樹莓多糖可用于補(bǔ)充碳源支持、促進(jìn)乳酸菌生長。
(2)本研究制備的樹莓提取物對長雙歧桿菌1.218 6生長有較明顯的促進(jìn)作用,采用長雙歧桿菌發(fā)酵的含有樹莓提取物的果汁,與對照相比,其DPPH自由基清除率高、抗氧化能力強(qiáng)、果汁飽和度、明亮度好,發(fā)酵樹莓果汁的理化及感官特性均有改善。
(3)近年來,我國樹莓種植規(guī)模逐年擴(kuò)大,樹莓鮮果存在易損傷和腐壞問題,大部分果實只能以凍果原料銷售,附加值低,本文開發(fā)的樹莓與乳酸菌復(fù)配產(chǎn)品工藝,為樹莓產(chǎn)品進(jìn)一步利用提供了一種新思路。