★ 謝雄雄 謝晶 曾金祥* 張晨輝 李敏 梁健 朱繼孝 鐘國躍 羅光明 姚鵬程 桂雅琪（江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心 南昌 330004）

痛風(fēng)嚴(yán)重影響人們的身體健康，而高尿酸血癥是痛風(fēng)最重要的生化基礎(chǔ)?；邳S嘌呤氧化酶（XOD）抑制劑降低體內(nèi)尿酸濃度是痛風(fēng)治療的重要方法之一。臨床應(yīng)用的XOD 抑制劑如別嘌呤醇，奧西嘌呤和非布索坦（Febuxostat）等雖可降低體內(nèi)尿酸水平，但具有嚴(yán)重的毒副作用。因此，亟待開發(fā)新型XOD 抑制劑以開發(fā)安全有效的降尿酸新藥。

短管兔耳草又名紅林，為玄參科兔耳草屬植物L(fēng)agotisbrevitubaMaxim 的全草，是藏藥“洪連”的主要基原植物［1-3］。短管兔耳草具有多種藥理活性，是二十五味余甘子湯，智托潔白丸，二十味沉香丸等一百余個(gè)藏藥成方制劑的主要成分。雖然短管兔耳草在臨床上被廣泛使用，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚少。本課題組前期研究［4］表明，短管兔耳草具有很好的降尿酸效果，抑制XOD 活性是其重要的降尿酸途徑，且具有很高的安全性。這說明篩選短管兔耳草中XOD 抑制劑對于開發(fā)安全有效的降尿酸新藥具有重要意義。

當(dāng)前傳統(tǒng)藥用植物中的XOD 抑制劑多采用先提取得到提取物，進(jìn)行分離純化得到單體化合物，然后再運(yùn)用體外活性測試方法進(jìn)行篩選。這種方法往往周期長、盲性大，因此有必要開發(fā)新的策略快速篩選短管兔耳草中的XOD 抑制劑以促進(jìn)降尿酸新藥開發(fā)。血清藥理學(xué)認(rèn)為對血中移行成分進(jìn)行分析可快速發(fā)現(xiàn)藥用植物中的潛在的活性成分［5］，UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)因具有高靈敏度、高分辨率等優(yōu)勢已成為天然產(chǎn)物成分鑒定的有力工具［6］，分子對接技術(shù)可以模擬化合物與XOD 的作用方式，并通過結(jié)合能與打分函數(shù)評價(jià)化合物潛在的活性，已成為藥物篩選研究的重要方法［7-8］?；谶@三方面的優(yōu)越性，本研究采用UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)鑒定藏藥短管兔耳草血中移行成分，應(yīng)用分子對接技術(shù)評價(jià)血中移行成分潛在的XOD 抑制活性并進(jìn)行體外活性驗(yàn)證，以為后續(xù)基于短管兔耳草的降尿酸新藥開發(fā)奠定物質(zhì)與理論基礎(chǔ)，并為其它天然產(chǎn)物中XOD 抑制劑研究提供新策略。

1 材料

1.1 儀器 Triple-TOF?5600+高分辨質(zhì)譜儀（AB SCIEX 公司）；島津LC-30A-SPD-M20A 超高效液相色譜儀（SHIMADZU 公司）；YMC-Triart C18分析柱YMC 公司，100×2.1 mm I.D，1.9μm）；5 mL 固相萃取小柱（Sepax Technologies，Inc）；AL204 型電子分析天平（Mettler Toledo 上海有限公司）；Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)（Merck millipore 公司）；BUCHI 電動(dòng)旋蒸蒸發(fā)儀（BUCHI Labortechnik AG 公司）；AllegraTM64R 型高速離心機(jī)（Beckmancoulter公司）；DFY-400 型搖擺式中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（Theromo Fisher Scientitific Oy Ratastie2，F(xiàn)I-1620 Vabtaa，F(xiàn)inland）。

1.2 試劑和藥品 甲醇（天津恒星化學(xué)試劑制造有限公司），乙腈（色譜純，德國 Merck 公司）。短管兔耳草購于成都荷花池藥材市場，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國躍教授鑒定為短管兔耳草LagotisbrevitubaMaxim.的干燥全草。大車前苷（成都曼思特生物科技公司，純度≥98%，批號MUST-16041508）。黃嘌呤（批號：B16L83O5514）、木犀草素-3，7-O-葡萄糖醛酸苷（批號：P23S7F21843）、citric acid（批號：SM0425GA14）、loganic acid（批號：P01A9L67130）、Apocynin（批號：AJ0708FA14）、p-Coumaric acid（批號：Y16O8C45561）、壬二酸（批號：Y25J7C16724）、大車前苷（批號：W22A7M13372）均購于上海源葉生物科技有限公司。Chrysoeriol-7-O-glucuronide（實(shí)驗(yàn)室自制），黃嘌呤氧化酶（XOD）試劑盒（南京建成研究所，批號：20180318），別嘌呤醇（美國Sigma 公司，AP，081M1112V）PBS 緩沖液（北京Solarbio 公司，批號：20171008），其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 雄性大鼠4 只，體重180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，SPF 級，合格證號SCXK（湘）2013-0004，實(shí)驗(yàn)期間室溫（24±2）℃，相對濕度40 %～75 %，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（編號JZLLSC2017016）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 短管兔耳草總提取物溶液制備 短管兔耳草粉碎，過4 號篩。取10 g 粉末用100 mL 的65%乙醇溶液浸泡過夜，然后回流提取1 h。冷卻后過濾，殘?jiān)偌尤?00 mL 65%乙醇溶液重復(fù)提取一次。兩次所得濾液合并，減壓回收溶劑至無醇味。加水配置得生藥濃度為0.2 g/mL 短管兔耳草提取物溶液。

2.1.2 血清樣品的制備及代謝產(chǎn)物的收集 SD 大鼠隨機(jī)分為空白組與給藥組，每組2 只。給藥組給予短管兔耳草提取物，劑量為2 g/kg，每日2 次，給藥3天，末次灌胃前12 h 禁食不禁水。末次灌胃后，給藥組大鼠分別于0.5 h，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h 眼眶取血。空白組大鼠則給予生理鹽水，其余操作與給藥組相同。所得樣品在4 ℃以5000 r/min 離心10 min，取上清液為血清樣品，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 血清樣品處理 取血清0.5 mL，加入10 μL磷酸，渦旋30 s，然后用固相萃取柱進(jìn)一步處理。固相萃取柱預(yù)先依次以2 mL 甲醇、2 mL 水活化。上樣后先用1 mL 水淋洗，再以2 mL 甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，40 ℃下氮?dú)獯蹈桑?00 μL 甲醇復(fù)溶，在4 ℃條件下以13 000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)UPLC-Q-TOF/MS 分析，進(jìn)樣量為7 μL。

2.1.4 UPLC-Q-TOF/MS 方法 液相方法：梯度洗脫，流動(dòng)相A 為0.2%甲酸水溶液，B 為乙腈。梯度條件：0～5 min，7 %～19 % B；5～21 min，19 %～23 % B；21～24 min，23 %～52 % B；流速為0.4 mL/min，色譜柱溫為40 ℃。

質(zhì)譜方法：電噴霧離子化源（ESI），負(fù)離子模式，掃描范圍為 m/z 50～1200。霧化氣溫度550 ℃，氣簾氣30 psi，輔助氣50 psi。去簇電壓（DP）-100 eV，碰撞能量CE 為45 eV，CES 碰撞能量疊加為±10 eV。MS 一級預(yù)掃描和觸發(fā)的二級掃描離子累積時(shí)間分別為250 ms 和150 ms。

2.1.5 化合物的分子對接 采用ChemBioDraw ultra14.0 得出化合物的3D 結(jié)構(gòu)，并保存為PDB 格式文件。之后應(yīng)用分子對接軟件Autodock 對其加氫加電荷，并進(jìn)行柔性設(shè)置，最后以PDBQT 格式儲(chǔ)存。黃嘌呤氧化酶（XOD）晶體結(jié)構(gòu)從Protein data bank（RCSB PDB，https://www.rcsb.org）下載，使用編號為3ETR。使用Autodock 軟件去掉XOD結(jié)合的水分子和配體之后，進(jìn)行加氫加電荷，最后存貯為PDBQT 格式，運(yùn)用遺傳算法評價(jià)化合物與XOD 的結(jié)合能與打分。

2.1.6 體外黃嘌呤氧化酶XOD抑制率測定方法 參照文獻(xiàn)方法［9-10］驗(yàn)證成分活性，但方法稍有不同：40 μL 供試品溶液，加入黃嘌呤氧化酶XOD 溶液濃度80 μL，溫度20 ℃、孵育時(shí)間35 min，加入底物黃嘌呤溶液，40 ℃下繼續(xù)孵育15 min，測量在295 nm處OD 值，做為供試品組，每組樣品平行3 次。同時(shí)，以等體積pH=7.4 的PBS 溶液取代黃嘌呤氧化酶XOD 溶液測定的OD 值作為空白組，以等體積pH=7.4 的PBS 溶液取代供試品溶液測定的OD 值為正常組。供試品溶液、黃嘌呤氧化酶XOD 溶液、黃嘌呤溶液分別以適量的PBS 緩沖溶液（pH=7.4）配制成濃度500 μmol/L、20 U/L、125 μmol/L。按如下公式計(jì)算化合物對XOD 的抑制劑：

黃嘌呤氧化酶XOD 抑制率=1-（供試品組-空白組）/（正常組-空白組）

2.1.7 數(shù)據(jù)處理 采用AB Sciex 公司Peakview 1.6數(shù)據(jù)處理軟件對UPLC-Q-TOF-MS/MS 采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2.2 結(jié)果

2.2.1 成分鑒定結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn)0.5 h 為短管兔耳草提取物成分吸收高峰區(qū)，故采用灌胃后0.5 h 血清樣品鑒定血中移行成分，結(jié)果見圖1A、B。其中圖1A 為空白組采集的血清總離子流圖，圖1B 為0.5 h 時(shí)間段所采集的血清總離子流圖。結(jié)合圖1A、B，對比分析血中移行成分與藏藥短管兔耳草總提取物總離子流圖研究結(jié)果［11］及對照品總離子流圖碎片信息，一共發(fā)現(xiàn)14 個(gè)血中移行成分，通過文獻(xiàn)及對照品對照鑒定8 個(gè)，分別為Chrysoeriol-7-Oglucuronide、木犀草素-3，7-O-葡萄糖醛酸苷、citric acid、loganic acid、Apocynin、p-Coumaric acid、壬二酸、大車前苷；通過文獻(xiàn)推測3 個(gè)，分別為p-Coumaric acid-O-sulfate、3，4-dimethoxy-cinnamic acid、9，12，13-三羥基-10-十八碳烯酸，共鑒定出11 個(gè)，其中8 個(gè)為原形成分，3 個(gè)為代謝成分，其余3 個(gè)未能鑒定，結(jié)果見表1。僅選取其中具有代表性化合物的二級裂解路徑說明血中移行成分的鑒定過程。

表1 短管兔耳草血中移行成分分析結(jié)果

圖1 短管兔耳草血中移行成分總離子流圖。

化合物2C16H24O10母離子［M-H］-為 375.1314，分子量為376。二級碎片m/z213 表明分子碎裂脫去一分子吡喃葡萄糖形成環(huán)烯醚萜母核，之后該碎片離子繼續(xù)裂解，脫去一分子CO2，產(chǎn)生m/z169 的碎片離子。m/z 151 的碎片離子表示m/z213 的環(huán)烯醚萜母核繼續(xù)脫去一分子H2O。根據(jù)文獻(xiàn)［11，13］及對照品比對，推斷出化合物2 為loganic acid，其裂解過程見圖2。

圖2 loganic acid的二級質(zhì)譜圖

化合物9C27H26O18母離子［M-H］-為 637.0921，分子量為638。二級碎片離子m/z461 為化合物脫去了一分子葡萄糖醛酸，碎片離子m/z285 的豐度遠(yuǎn)大于m/z284，這表明該化合物可能含有木犀草素苷元［11，16］。根據(jù)peakview 匹配結(jié)果以及文獻(xiàn)［11，16］及對照品比對，確定化合物9 為木犀草素-3，7-O-葡萄糖醛酸苷，其裂解過程見圖3。

化合物7C9H8O3母離子為［M-H］-163.0402，分子量為164。該化合物裂解失去一分子CO2，生成m/z 119 的碎片離子。之后該碎片離子繼續(xù)失去2 個(gè)CH，產(chǎn)生m/z 93 的碎片離子。根據(jù)文獻(xiàn)［11.14］對照品比對，以及peakview 軟件給出數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)合推測化合物7 為p-Coumaric acid。

化合物12 C11H12O4，母離子［M-H］-為207.0661，分子量為208。該化合物失去CH3和CHO 碎片，產(chǎn)生m/z162 的碎片離子。之后該碎片離子繼續(xù)失去一分子CO2，產(chǎn)生m/z119的碎片離子，根據(jù)文獻(xiàn)［11，17］以及peakview 匹配結(jié)果，推測化合物12 為3，4-dimethoxy-cinnamicacid，其裂解方式見圖4。

圖3 木犀草素-3,7-O-葡萄糖醛酸苷的二級質(zhì)譜圖

圖4 3,4-dimethoxy-cinnamic acid的二級質(zhì)譜圖

2.2.2 血中移行成分與XOD 的分子對接研究 使用Autodock4.0 軟件模擬化合物與XOD 的結(jié)合方式，使用遺傳算法得出化合物與XOD 的結(jié)合能與結(jié)合打分，具體結(jié)果見表2。由結(jié)合能與打分結(jié)果可知，這些成分與XOD 的結(jié)合均為自發(fā)過程，說明這些化合物與XOD可以很好的進(jìn)行結(jié)合，具有潛在的XOD抑制活性。

2.2.3 體外黃嘌呤氧化酶XOD 抑制率測定結(jié)果 別嘌呤醇在該條件下對XOD 的抑制率分別為95.88%±8.21%，血中移行成分Chrysoeriol-7-Oglucuronide、木犀草素-3，7-O-葡萄糖醛酸苷、citric acid、loganic acid、Apocynin、p-Coumaric acid、壬二酸、大車前苷對XOD 的抑制率見表2。

表2 血中移形成分與XOD的分子對接

3 討論

藏藥短管兔耳草是最為重要的藏草藥之一，可通過抑制XOD 活性顯著降低高尿酸血癥小鼠體內(nèi)尿酸水平，其XOD 抑制劑成分具有很好的研究與開發(fā)前景［11］。傳統(tǒng)經(jīng)先提取再分離純化得到單體成分然后進(jìn)行活性篩選的方法具有研究周期過長盲目性過大的不足。對血中移行成分進(jìn)行研究可大大縮小天然產(chǎn)物中成分的研究范圍［19-21］，液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已成為分離鑒定各種化合物的重要手段［22，23］，分子對接技術(shù)已成為評價(jià)成分潛在活性與作用機(jī)制的重要方法與有力工具［8，11］。因此，將UPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)及分子對接聯(lián)用無疑為目標(biāo)成分的快速篩選提供了新的策略。

本實(shí)驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)14 個(gè)藏藥短管兔耳草血中移形成分。通過文獻(xiàn)及對照品比對，共鑒定出8 個(gè)原形血中移形成分，3 個(gè)代謝血中移行成分。這些成分有黃酮、酚酸及苯丙素類等多種化合物類型，說明藏藥短管兔耳草的化學(xué)成分不僅具有多樣性，同時(shí)也具有很好的吸收性能。這些特性可能是藏藥短管兔耳草能發(fā)揮獨(dú)特療效的重要原因之一。另外，由本實(shí)驗(yàn)對接結(jié)果可知，血中移行成分與XOD 的結(jié)合能均為負(fù)值且具有較高的分值，說明這些成分與XOD 的結(jié)合均為自發(fā)過程，且具有潛在的XOD抑制活性［24-27］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，許多黃酮、酚酸類及苯丙素化合物均具有XOD 抑制活性［22］。其中，黃酮類化合物Chrysoeriol-7-O-glucuronide 和木犀草素-3，7-O-葡萄糖醛酸苷等黃酮類化合物［23］，酚酸類化合物p-Coumaric acid［26］已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道為XOD 抑制劑，苯丙素類化合物大車前苷是降低高尿酸血癥的主要有效成分之一［27］。因此，這些結(jié)果充分說明分子對接評價(jià)方法與實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有很高的一致性，完全可用于篩選短管兔耳草血中移形成分中的XOD 抑制劑。此外，酚酸類化合物3，4-dimethoxy-cinnamic acid 分?jǐn)?shù)優(yōu)于其他化合物，說明其可能具有更好的XOD 抑制活性。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)酚酸類化合物甲酯化后的活性明顯優(yōu)于未酯化化合物［24］，故其脂溶性的增加可使3，4-dimethoxycinnamic acid 更容易與XOD 的疏水活性中心結(jié)合，從而表現(xiàn)出更好的酶抑制活性［25］。另外，本研究的體外活性測試結(jié)果與文獻(xiàn)基本一致，這進(jìn)一步驗(yàn)證了分子對接結(jié)果的可靠性。

應(yīng)該指出，UPLC-Q-TOF/MS 雖然具有強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)解析能力，但仍需要基于文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)或?qū)φ掌凡拍艽_證化合物的結(jié)構(gòu)。藏藥短管兔耳草本身研究基礎(chǔ)薄弱，且其成分復(fù)雜，這是本文未能對其血中移行成分全部鑒定的重要原因之一。另外，研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)化合物與XOD 的對接打分值的高低與化合物對XOD 抑制率的大小存在不一致性，說明分子對接的結(jié)果最終仍需要進(jìn)行活性驗(yàn)證。這說明后續(xù)工作需要加強(qiáng)藏藥短管兔耳草化學(xué)成分的系統(tǒng)研究，以為后續(xù)的成分鑒定、活性驗(yàn)證及新藥開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。但總體而言，將UPLC-QTOF/MS 與分子對接技術(shù)聯(lián)用可快速鑒定了藏藥短管兔耳草血中移行成分，評價(jià)移行成分潛在的XOD 抑制活性，為藏藥短管兔耳草的降尿酸藥用開發(fā)奠定一定的物質(zhì)與理論基礎(chǔ)。