郭 聰 朱中杰 沈建雄 張宗昌 張建兵 趙德明 趙紅衛(wèi)*

1(浙江工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院， 杭州 310014) 2(中國科學(xué)院上海高等研究院張江實(shí)驗(yàn)室，上海 201210) 3(中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所，上海201800)

1 引 言

太赫茲時(shí)域光譜(THz-TDS)是基于飛秒激光技術(shù)發(fā)展起來的一種新型光譜技術(shù)，其信噪比高，可有效探測分子低頻振動、分子間弱相互作用以及晶格振動等[11～13]。太赫茲波能量低，不會對生物分子造成電離損傷，被廣泛應(yīng)用于生物分子如核酸和蛋白質(zhì)等的結(jié)構(gòu)分析以及分子相互識別的研究[14～16]。Nibali等[17]利用分子動力學(xué)模擬酪氨酸磷酸酶PDZ結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)過程和酶與RAGEF2短肽形成復(fù)合物前后的太赫茲光譜，結(jié)果表明，配體的親和力和結(jié)合模式能調(diào)節(jié)PDZ結(jié)構(gòu)域的變化，使蛋白質(zhì)功能改變，并引起不同的太赫茲共振響應(yīng)。蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能與其構(gòu)象的多樣性和復(fù)雜性有關(guān)，而蛋白質(zhì)中肽鏈以及氨基酸單元通過非共價(jià)鍵影響蛋白質(zhì)的構(gòu)型構(gòu)象，因此多肽構(gòu)型構(gòu)象的研究至關(guān)重要。Yamamoto等[18]采用光電導(dǎo)THz-TDS研究GSSG，結(jié)果表明，GSSG對太赫茲波呈無特征吸收。Rutz[19]和Wang[20]等利用光電導(dǎo)天線THz-TDS對GSH進(jìn)行測量，分別獲得了室溫下0.12～2.0 THz和0.3～2.4 THz波段的吸收光譜，并利用單分子模擬對光譜進(jìn)行分析。由于該理論模擬方法未考慮分子間的相互作用，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)光譜與理論光譜的吸收峰位移不完全吻合。GSH和GSSG的寬頻太赫茲光譜有助于加深了解分子的振動性質(zhì)以及具有生物學(xué)活性的分子構(gòu)型構(gòu)象變化特點(diǎn)。本研究采用空氣等離子體寬頻THz-TDS系統(tǒng)對GSH和GSSG進(jìn)行探測，在室溫條件下獲得0.5～12.0 THz波段的光譜信號。利用密度泛函漸論(DFT)對GSH在太赫茲波段吸收光譜進(jìn)行理論計(jì)算和振動模式分析，深入了解氫鍵對GSH分子的構(gòu)型構(gòu)象和排列方式的影響機(jī)制。GSH有多種晶型結(jié)構(gòu)[21～24]，考慮到不同晶型結(jié)構(gòu)對太赫茲響應(yīng)的差異，本研究采用粉末X射線衍射(PXRD)對樣品晶型進(jìn)行測量表征。

圖1 (A)還原型和(B)氧化型谷胱甘肽的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of (A) reduced glutathione (GSH) and (B) oxidized glutathione (GSSG)

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

基于空氣等離子體的TA-800寬頻太赫茲光譜儀(Terahertz Photonics公司)，用于探測樣品0.5～12.0 THz范圍內(nèi)的太赫茲吸收光譜。采用摻鈦藍(lán)寶石激光放大系統(tǒng)(美國 Spectra-Physics公司， Spitfire Ace)作為光源，入射激光的中心波長為800 nm，脈沖寬度小于35 fs，重復(fù)頻率為1 kHz，用于激發(fā)太赫茲的泵浦脈沖能量約為0.9 mJ，檢測的脈沖能量約為80 μJ，偏置相電壓為1.5 kV。利用基于光電導(dǎo)開關(guān)8-F共焦THz-TDS系統(tǒng)(自建)測量樣品0.2～2.8 THz范圍的太赫茲吸收光譜，采用摻鈦藍(lán)寶石激光系統(tǒng)(美國 Spectra-Physics公司, Mai Tai)作為光源，入射激光的中心波長為800 nm。兩套TDS系統(tǒng)的信噪比均大于1000∶1。采用X射線多晶衍射儀(德國 Bruker公司)探測樣品在10°～90°范圍內(nèi)的PXRD衍射圖。

GSSG和GSH(純度98%，百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司); 襯底材料為環(huán)烯烴共聚物(COC，上海原子核研究加工廠)，粒徑小于100 μm，此襯底材料在13 THz以下的吸收對樣品測量的影響可以忽略[25]。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 THz-TDS測量樣品制備 襯底與被測樣品以合適比例在研缽中充分混合均勻后，用壓片機(jī)在2 MPa的壓力下將粉末壓成直徑13 mm、厚度0.7 mm的樣片。

太赫茲光譜的探測 飛秒光被分束片分為兩束，光束經(jīng)透鏡和BBO倍頻晶體作用產(chǎn)生二次諧波脈沖后與基頻光束在空氣中聚焦，聚焦區(qū)的空氣產(chǎn)生等離子體進(jìn)而輻射出寬帶太赫茲激光脈沖[26]。太赫茲激光脈沖經(jīng)分束鏡分為泵浦光和探測光。兩束光在樣品中共線聚焦，產(chǎn)生新的二次諧波脈沖。用光電倍增管(PMT)探測經(jīng)400 nm帶通濾波器篩選出帶有樣品信號的二次諧波脈沖。太赫茲場振幅與該諧波光束能量的平方根成正比，因此，可以將PMT測得信號進(jìn)行處理以獲得太赫茲信號[27]。探測光焦點(diǎn)處的電極引入外部偏置電壓，用于相干檢測。

2.2.2 PXRD實(shí)驗(yàn)PXRD實(shí)驗(yàn)采用X射線源為銅靶，工作電壓為40 kV，工作電流為40 mA，掃描速度0.2°/s，掃描范圍為10°～90°(2θ)。

2.3 參數(shù)計(jì)算

太赫茲時(shí)域光譜采集的信號是包含樣品相位和幅值信息在內(nèi)的單位脈沖的時(shí)域信號。該信號經(jīng)過傅立葉變換可以獲得樣品的折射率、介電常數(shù)和吸收系數(shù)。實(shí)驗(yàn)測得以空氣為參考背景的信號Pref(ω)和樣品信號Psan(ω)。兩個(gè)信號通過快速傅立葉變換，時(shí)域信號轉(zhuǎn)換成為對應(yīng)的頻域信號，具體變換公式如下：

(1)

其中，TLinear(ω)為透過率(%)，Psan(ω)為樣品的電場能量光譜，Pref(ω)為樣品背景的能量光譜：

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

其中，α(ω)是吸收系數(shù)(cm-1)，k(ω)為消光系數(shù)，ω為角頻率(rad/s);c為光速(m/s)。

3 量子化學(xué)計(jì)算

考慮到本研究是在室溫下探測GSH的太赫茲吸收光譜，且利用PXRD測量所獲的GSH衍射譜與文獻(xiàn)中295 K溫度[24]下測量結(jié)果一致，因此選用295 K溫度下的晶胞參數(shù)(斜方晶系，空間群P212121，a=5.6216(4)，b=8.7855(6)，c=28.0552(18)?)為理論計(jì)算初始值，進(jìn)行分子的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和太赫茲光譜計(jì)算及振動分析。本研究采用Materials Studio中以密度泛函理論(DFT)為基礎(chǔ)的CASTEP模塊進(jìn)行量子化學(xué)計(jì)算，平面波截止能量為600 eV。選擇廣義梯度近似的Perdew-Burke-Ernzerhof(GGA-PBE)作為電子與電子交互和相關(guān)效應(yīng)的計(jì)算，并采用Grimme下用色散修正項(xiàng)校正PBE泛函的PBE-D2方法[28]; 利用4×2×1 Monkhorst-Pack K點(diǎn)網(wǎng)格進(jìn)行幾何優(yōu)化和太赫茲理論光譜計(jì)算。

圖2 利用空氣等離子體寬頻太赫茲系統(tǒng)獲得的0.5～12.0 THz 范圍內(nèi)GSH和GSSG太赫茲吸收光譜，插圖為利用光電導(dǎo)開關(guān)8-F共焦太赫茲系統(tǒng)(系統(tǒng)Ⅱ)獲得的0.2～2.8 THz 范圍內(nèi)GSH和GSSG太赫茲吸收光譜(圖中陰影部分僅供參考)Fig.2 Terahertz absorption spectra of GSH and GSSG in the range of 0.5-12.0 THz obtained by the broadband air plasma terahertz system.Spectra in inset are obtained by the photoconductive switch 8-F confocal terahertz system (The shaded parts in the graph Ⅱ are only for reference)

4 結(jié)果與討論

4.1 GSH和GSSG寬頻太赫茲吸收光譜

圖3 GSH和GSSG的PXRD衍射圖Fig.3 Powder X-ray diffraction (PXRD) patterns of GSH and GSSG

圖2為GSH和GSSG在0.5～12.0 THz波段的吸收光譜。GSH在1.52、2.51、3.71、4.38、5.02、5.96、6.67、7.10、8.23、9.03、10.11和10.71 THz處有特征吸收峰(紅線)，其中5.96和10.71 THz處吸收峰的吸收強(qiáng)度較大，且峰形尖銳。而GSSG呈現(xiàn)的則是一條單調(diào)上升的吸收曲線(藍(lán)線)，沒有明顯的特征吸收峰。由于0.5～1.4 THz波段的信息受儀器檢測限影響，利用在低頻太赫茲區(qū)域有較高分辨率的光電導(dǎo)開關(guān)太赫茲系統(tǒng)探測0.2～2.8 THz范圍內(nèi)GSH和GSSG的太赫茲吸收光譜(圖2插圖)。測量結(jié)果表明，0.2～2.8 THz波段GSH的太赫茲吸收峰與文獻(xiàn)[19,20]報(bào)道結(jié)果吻合，而GSSG依然對太赫茲波呈現(xiàn)無特征吸收。在之前晶體和非晶體系的太赫茲光譜研究中也觀察到類似現(xiàn)象。Walther等[29]利用THz-TDS檢測晶體和非晶葡萄糖的太赫茲吸收光譜，結(jié)果表明，由于晶體中糖分子的非共價(jià)鍵與太赫茲波產(chǎn)生協(xié)同共振響應(yīng)，導(dǎo)致晶體糖在太赫茲波段有明顯的特征吸收峰，而非晶糖在太赫茲波段呈無特征吸收曲線。太赫茲吸收光譜還與氫鍵的作用特點(diǎn)密切相關(guān)，生物分子的特定晶型通常是分子在氫鍵的定向作用下有序堆疊而成[30,31]。當(dāng)太赫茲光與分子晶體作用時(shí)，特定波段太赫茲的能量與晶格和氫鍵振動能量匹配，分子產(chǎn)生共振響應(yīng)，進(jìn)而呈現(xiàn)特征吸收峰。非晶物質(zhì)內(nèi)，分子通常不能按照一定規(guī)律有序排列，且存在氫鍵取向隨機(jī)的現(xiàn)象，容易導(dǎo)致非晶物質(zhì)對太赫茲波呈現(xiàn)單調(diào)遞增的無特征吸收[32]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證不同樣品存在形式對太赫茲響應(yīng)的影響，采用PXRD衍射對GSH和GSSG進(jìn)行了表征。圖3為GSH和GSSG的PXRD衍射圖，其中GSH有一系列較強(qiáng)的尖銳衍射峰，說明樣品具有晶型結(jié)構(gòu); 而GSSG在所測范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)衍射峰，說明GSSG沒有特定的晶型結(jié)構(gòu)，是無定形態(tài)。GSH和GSSG的PXRD檢測結(jié)果與太赫茲檢測結(jié)果一致，說明太赫茲光譜對物質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)有敏感響應(yīng)[33]。

圖4 GSH的實(shí)驗(yàn)和理論計(jì)算的太赫茲光譜Fig.4 Experimental and calculated Terahertz spectra of GSH

4.2 GSH太赫茲光譜理論分析

量子化學(xué)理論計(jì)算是解析實(shí)驗(yàn)獲得的太赫茲光譜的一種有效方法[37,38]?？紤]到GSH的晶體結(jié)構(gòu)具有溫度敏感性[24]，本研究采用295 K溫度下的GSH初始晶胞參數(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和振動分析。圖4為理論計(jì)算獲得的GSH太赫茲光譜(藍(lán)色虛線)，并將其與實(shí)驗(yàn)獲得的光譜(紅色實(shí)線)比對分析。 理論計(jì)算獲得的太赫茲光譜中吸收峰的數(shù)量比實(shí)驗(yàn)光譜中的多，特別是在低頻區(qū)域較明顯，這一現(xiàn)象與低頻區(qū)域復(fù)雜的集體振動、分子間和分子內(nèi)振動耦合以及實(shí)驗(yàn)測量儀器的檢測靈敏度和分辨率等因素有關(guān)[39,40]。同時(shí)，與理論計(jì)算得到的光譜相比，實(shí)驗(yàn)光譜中的吸收峰有一定偏移，低頻區(qū)的偏移量較小而高頻區(qū)吸收峰的偏移量較大。由于實(shí)驗(yàn)中的測量樣品是未經(jīng)進(jìn)一步純化的粉晶，會對吸收峰位移產(chǎn)生一定影響[41]。此外，理論計(jì)算的溫度是 0 K， 而實(shí)驗(yàn)測量的環(huán)境溫度為295 K，此溫度差異引起的晶格膨脹在一定程度上使得吸收峰發(fā)生偏移[42]。同時(shí)，儀器測量的環(huán)境因素如溫度和濕度等也會對吸收峰產(chǎn)生一定影響。

圖5 GSH的原子序號和氫鍵示意圖#表示與圖中GSH分子相鄰的分子序號Fig.5 Atomic number and hydrogen bonds of GSH# shows the sequence number of molecule adjacent to GSH molecule

圖6 GSH在2.33、4.00、7.79和10.85 THz處的振動模式Fig.6 Calculated vibrational modes of GSH at 2.33, 4.00, 7.79 and 10.85 THz

表1 GSH的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算光譜比較以及吸收峰的振動模式

5 結(jié) 論