吳子陽(yáng) 何 菲 李賀賀*,2 孫金沅,2 孫嘯濤,2 孫寶國(guó),2

(北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室1， 食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心2， 北京 100048)

1 引 言

白酒是中國(guó)特有的一種蒸餾酒，歷史悠久，在我國(guó)酒文化中占有重要地位[1]。青稞酒是生產(chǎn)于我國(guó)青海省的一種清香型白酒，因其獨(dú)特的地理環(huán)境、釀酒原料、大曲配料和生產(chǎn)工藝而形成了獨(dú)特的產(chǎn)品風(fēng)格[2]。

2016年，孫寶國(guó)等[3]首次提出健康白酒可通過(guò)“內(nèi)尋外加，自然強(qiáng)化”實(shí)現(xiàn)?！皟?nèi)尋”指的是通過(guò)現(xiàn)代分析手段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白酒中含有的健康因子。酚類活性化合物因其優(yōu)良的抗氧化性而被廣泛關(guān)注，對(duì)冠心病、糖尿病、高血脂、痛風(fēng)等都有一定的預(yù)防作用[4～9]。白酒的釀酒原料(大麥、小麥、麥麩、大米、玉米)中，阿魏酸的含量最豐富，其它有特征代表性的酚類活性化合物包括沒(méi)食子酸、對(duì)香豆酸、丁香酸、兒茶素等[10～15]，青稞酒是以青稞為釀酒主要原料，青稞中也含有包括阿魏酸在內(nèi)的大量酚類活性化合物[16]。

關(guān)于黃酒和葡萄酒中酚類活性化合物研究較多，主要集中在定性定量分析、地域性差異、不同發(fā)酵工藝對(duì)酒質(zhì)影響、生理功效、釀酒微生物等方面[17～21]。近年來(lái)，關(guān)于白酒中酚類活性化合物的研究較少，主要涉及功效綜述、定性與定量分析和生物活性分析[22]。白酒中酚類活性化合物屬痕量化合物，難以通過(guò)直接檢測(cè)的方法測(cè)得，因此，需采取適當(dāng)?shù)奶崛》蛛x方法。2016年，黃蘊(yùn)利等[23]指出白酒中含有少量?jī)翰璺印⒂鷦?chuàng)木酚、阿魏酸，并對(duì)其抗氧化、防癌、抗血小板聚集、鎮(zhèn)痛等一系列生理活性作用進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。王銀輝等[24]基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS(QQQ))建立了一種高效測(cè)定白酒中沒(méi)食子酸、阿魏酸、兒茶素、對(duì)香豆酸等7種微量有機(jī)酸的方法。樣品經(jīng)過(guò)氮吹復(fù)溶后，結(jié)合LC-MS直接分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求較高，直接氮吹無(wú)法排除干擾組分。2019年，王戎等[25]通過(guò)固相萃取(Solid phase extraction， SPE)結(jié)合LC-MS法測(cè)定了白酒中酚酸類化合物和酚酸酯類化合物，并未對(duì)前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化。

本研究建立了SPE結(jié)合高效液相色譜 (HPLC)簡(jiǎn)便高效分析白酒中上述5種谷物中有代表性的酚類活性化合物的方法。對(duì)目前研究較少且采用清蒸清燒四次清的工藝制備的青稞酒中酚類活性化合物進(jìn)行定性與定量分析，并與其它清香型白酒和不同香型白酒進(jìn)行對(duì)比。通過(guò)對(duì)白酒中5種酚類活性化合物的快速檢測(cè)和綜合分析，為白酒老熟和提升白酒中酚類活性化合物的含量提供理論基礎(chǔ)，并為實(shí)現(xiàn)“內(nèi)尋外加，自然強(qiáng)化”提升白酒中酚類活性化合物含量提供研究參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司); VISIPREP 24TMDL SPE裝置(美國(guó)Supelco公司); UV-2700 220V CH UV-VIS 紫外-可見(jiàn)光譜儀(Shimadzu 蘇州儀器有限責(zé)任公司); Waters Oasis HLB LP Extraction Cartridge SPE小柱、Waters Xselect HSST3色譜柱(美國(guó)Waters公司); Advanntage A10 Milli-Q超純水儀(德國(guó)Merk Millipore公司); RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); 0.22 μm針頭過(guò)濾器(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

阿魏酸、沒(méi)食子酸和(+)-兒茶素水合物(純度>99%，北京J&K公司); 對(duì)香豆酸、丁香酸(純度>99%，美國(guó)Admas公司); 甲醇、乙醇、乙腈和乙酸(色譜純，純度>99%，北京伊諾凱科技有限公司); HCl(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 實(shí)驗(yàn)用水為超純水， 由Milli-Q超純水儀制備。酒樣共46個(gè),分別為酒廠取得的不同貯酒容器、不同貯藏時(shí)間的青稞酒原酒(QKYJ(1)～(17)); 當(dāng)?shù)厣虉?chǎng)購(gòu)買的3個(gè)芝麻香型商品白酒(ZMX(1)～(3))、3個(gè)醬香型商品白酒(JX(1)～(3))、3個(gè)濃香型商品白酒(NX(1)～(3))、20個(gè)清香型商品白酒(QK(1)、QK(2)、QK(3)、FJ(1)、FJ(2)、FJ(3)、HX(1)、HX(2)、HX(3)、XHC(1)、XHC(2)、XHC(3)、SMC(1)、SMC(2)、NLS(1)、NLS(2)、NLS(3)、JJ(1)、JJ(2)、JJ(3))。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 高效液相色譜方法流動(dòng)相A為2%乙酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈; 梯度洗脫： 0～10.0 min，84% A; 10.0～18.0 min，84%～70% A; 18.0～19.0 min， 70%～84% A; 19.0～21.0 min，84% A。流速：1.0 mL/min; 柱溫：30℃; 檢測(cè)波長(zhǎng)：280和330 nm; 進(jìn)樣量為5 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)食子酸、(+)-兒茶素水合物、丁香酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸各100.0 mg，用色譜純甲醇分別溶解定容至10 mL，配制成10 g/L標(biāo)準(zhǔn)品母液，于-20℃保存，備用。

配制沒(méi)食子酸、(+)-兒茶素水合物和丁香酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度梯度為0.05、0.5、1.0、2.0、5.0和10 mg/L; 配制對(duì)香豆酸和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為0.05、0.2、0.5、2.0、4.0和20 mg/L。各梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液過(guò)0.22 μm針頭過(guò)濾器后，按2.2.1節(jié)的方法進(jìn)行HPLC測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2.2.3 樣品前處理先用超純水將酒樣酒精度調(diào)成10%(V/V)，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH=2。用6 mL甲醇和6 mL超純水活化SPE小柱后，將酒樣加入SPE小柱，緩慢旋轉(zhuǎn)SPE裝置真空閥，保持流速為1 mL/min。 待樣品完全上樣，取下SPE小柱。用6 mL超純水沖洗小柱，除去干擾物。用6 mL甲醇(pH=4)洗脫酚類活性化合物，收集洗脫液。在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入0.5 mL甲醇復(fù)溶。將樣品過(guò)0.22 μm濾器，進(jìn)行HPLC測(cè)定。

2.2.4 最大檢測(cè)波長(zhǎng)的確定用色譜純甲醇配制50 mg/L的5種酚類活性化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 將紫外-可見(jiàn)光譜儀用甲醇調(diào)零后，測(cè)定樣品最大吸收波長(zhǎng)。光譜掃描范圍為180～600 nm。

2.2.5 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化由于白酒中5種酚類活性化合物為痕量化合物，不同條件下易受儀器狀態(tài)等因素影響，導(dǎo)致變化趨勢(shì)不明顯。因此，配制5種酚類活性化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液于白酒樣品(以下稱為“模擬酒樣”)中，添加阿魏酸和對(duì)香豆酸的濃度為150 μg/L，沒(méi)食子酸和丁香酸的濃度為200 μg/L， (+)-兒茶素水合物濃度均為250 μg/L。對(duì)模擬酒樣pH值(1、2、3、4、5)、甲醇溶液pH值(2、3、4、5、6)及甲醇溶液用量(2、3、4、5、6和8 mL)進(jìn)行優(yōu)化。以上所有樣品均按2.2.3節(jié)的前處理步驟處理，平行3次實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 最大吸收波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)

沒(méi)食子酸、(+)-兒茶素水合物和丁香酸的最大吸收波長(zhǎng)均接近280 nm，對(duì)香豆酸和阿魏酸的最大吸收波長(zhǎng)均接近330 nm。因此，選擇在280 nm處檢測(cè)沒(méi)食子酸、(+)-兒茶素水合物和丁香酸，在330 nm處檢測(cè)對(duì)香豆酸和阿魏酸，如表1所示。

表1 5種酚類活性化合物最大吸收波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)

3.2 5種酚類活性化合物的定性分析

在280 nm處，5種酚類活性化合物均有響應(yīng)，而在330 nm處時(shí)，(+)-兒茶素水合物和丁香酸的響應(yīng)不佳。因此，選擇UV 280 nm以確定5種酚類活性化合物的保留時(shí)間，酒樣中5種酚類活性化合物的HPLC圖如圖1所示。5種酚類活性化合物的保留時(shí)間為：沒(méi)食子酸(3.57 min)、(+)-兒茶素水合物(5.42 min)、丁香酸(8.39 min)、對(duì)香豆酸(13.86 min)、阿魏酸(16.42 min)。在當(dāng)前洗脫條件和HPLC條件下，5種酚類活性化合物分離效果良好。

3.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

3.3.1 酒樣pH值的影響除(+)-兒茶素水合物外，其余4種酚類活性化合物均含有羧基，pH值對(duì)其影響較大。在甲醇洗脫液pH=4、洗脫液用量為6 mL時(shí)，選擇模擬酒樣pH分別為1、2、3、4和5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖2可知，(+)-兒茶素水合物的提取效率在酒樣pH值從1上升至4的過(guò)程中逐漸增大，在pH值上升至5時(shí)有一定程度的下降，但提取效率變化不大。其余4種酚類活性化合物在pH=2時(shí)，提取效率最大。綜合考慮，將酒樣調(diào)整為pH 2進(jìn)行提取效果較好。

圖1 白酒樣品中5酚類活性化合物HPLC圖Fig.1 High performance lipid chromatogram (HPLC) of 5 kinds of phenolic active compounds in baijiu samplesa, Gallic acid; b, (+)-Catechin hydrate; c, Syringic acid; d, p-Coumaric acid; e, Ferulic acid

圖2 白酒樣品pH值對(duì)酚類活性化合物提取效率的影響Fig.2 Effect of baijiu sample pH value on extraction efficiency of phenolic active compoundsa. Gallic acid; b. (+)-Catechin hydrate; c. Syringic acid; d. p-Coumaric acid; e. Ferulic acid

3.3.2 甲醇洗脫液pH值的影響pH值對(duì)酚類活性化合物結(jié)構(gòu)具有較大影響，且不同的pH值的洗脫溶液對(duì)酚類活性化合物的洗脫效率不同，因此洗脫液需選擇合適的pH值。在酒樣pH=2、洗脫溶液用量6 mL的情況下，選擇甲醇洗脫液的pH值分別為2、3、4、5和6進(jìn)行考察。由圖3A可知，在洗脫溶劑pH值由2上升至3時(shí)，勤5種酚類活性化合物的提取效率均得到提升; pH值進(jìn)一步增加至4時(shí)，(+)-兒茶素水合物和丁香酸的提取效率略有下降，其它3種酚類活性化合物的提取效率繼續(xù)提高，其中，沒(méi)食子酸和丁香酸的提取效率達(dá)到最大值。對(duì)香豆酸和阿魏酸在洗脫溶劑pH=5時(shí)提取效率最佳，但與pH=4時(shí)差距較小。沒(méi)食子酸在pH值從4上升至5時(shí)，提取效率驟降。選擇甲醇洗脫溶液的最佳pH=4。

3.3.3 甲醇洗脫液用量的影響選擇酒樣pH=2，甲醇洗脫溶液pH=4時(shí)，分別用2、3、4、5、6和8 mL甲醇溶液進(jìn)行洗脫。由圖3B可知，在洗脫溶劑為2 mL時(shí)，5種酚類活性化合物的提取效率很低，其中，(+)-兒茶素水合物未檢出。洗脫溶劑用量增加至6 mL時(shí)，5種酚類活性化合物的提取效率逐漸增加，在洗脫劑用量2～3 mL時(shí)，除(+)-兒茶素水合物外，其余4種酚類活性化合物的提取效率迅速上升。在洗脫劑用量由3 mL增加至4 mL時(shí)，丁香酸的提取效率降低，但含量變化不大。(+)-兒茶素水合物的提取效率在洗脫劑用量大于3 mL后迅速上升，用量為6 mL時(shí)達(dá)到最大值。在洗脫溶劑含量從6 mL增加至8 mL時(shí)，酚類活性化合物提取效率變化不大。因此，選擇洗脫溶劑最佳用量為6 mL。

圖3 洗脫溶劑pH值(A)和洗脫溶劑用量(B)對(duì)酚類活性化合物提取效率的影響Fig.3 Effect of elution solvent pH value (A) and elution solvent amount (B) on extraction efficiency of phenolic active compounds a. Gallic acid; b. (+)-Catechin hydrate; c. Syringic acid; d. p-Coumaric acid; e. Ferulic acid

3.4 方法的分析性能

5種酚類活性化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R2)在0.9945～0.9999之間，線性關(guān)系良好，檢出限為0.98～12.2 μg/L，定量限為3.3～40．1 μg/L，回收率為84.1%～100.7%。具體參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 5種酚類活性化合物線性范圍、檢出限、定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及回收率

3.5 在不同容器中種貯藏的17種青稞原酒中酚類活性化合物含量對(duì)比

由表3所示，17種青稞酒原酒中均含有對(duì)香豆酸和沒(méi)食子酸，含量分別為11.05～28.74 μg/L和2.68～5.80 μg/L。僅青稞原酒(7)中未檢測(cè)出丁香酸和阿魏酸，其余16種原酒中丁香酸和阿魏酸的含量分別為0.67～5.87 μg/L和0.79～2.74 μg/L。未檢出(+)-兒茶素水合物(0.58～5.54 μg/L)的樣品數(shù)量較多，為11種。5種酚類活性化合物在青稞酒原酒中平均含量順序?yàn)椋?對(duì)香豆酸(20.75 μg/L)>沒(méi)食子酸(4.19 μg/L)>丁香酸(1.71 μg/L)>阿魏酸(1.19 μg/L)>(+)-兒茶素水合物(1.10 μg/L)。17種青稞酒原酒中5種酚類活性化合物平均總量為30.93 μg/L。貯藏在新陶壇中的青稞酒原酒中的沒(méi)食子酸的平均含量(4.81 μg/L)高于不銹鋼大罐(3.72 μg/L)和老陶壇(3.22 μg/L)，且丁香酸(1.76 μg/L)平均含量最高； 貯藏在不銹鋼大罐中的青稞酒原酒中的(+)-兒茶素水合物(3.28 μg/L)和阿魏酸(1.45 μg/L)的平均含量最高； 貯藏在新陶壇中的青稞原酒未檢出(+)-兒茶素水合物； 貯藏在老陶壇中的青稞原酒中對(duì)香豆酸(27.06 μg/L)的平均含量最高。5種酚類活性化合物的平均總量排序?yàn)椋豪咸諌?32.88 μg/L)>不銹鋼大罐(31.80 μg/L)>新陶壇(23.84 μg/L)。

由于青稞酒貯酒容器不同， 5種酚類活性化合物的含量也有差異。選擇不同貯酒容器貯存的17種青稞酒，采用SPE-HPLC法對(duì)5種酚類活性化合物進(jìn)行測(cè)定，將酚類活性化合物的含量與樣品建立矩陣，采用Origin 9.0 軟件結(jié)合系統(tǒng)聚類法對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析。采用最遠(yuǎn)距離法，以歐式距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，獲取不同貯藏容器中5種酚類活性化合物的聚類譜系圖，聚類分析結(jié)果用樹(shù)狀圖(圖4)表示。由圖4可知，QKYJ(8)和QKYJ(9)、QKYJ(13)和QKYJ(14)及QKYJ(15)和QKYJ(16)在最小距離水平上形成3個(gè)聚類，表明QKYJ(8)和QKYJ(9)、QKYJ(13)和QKYJ(14)及QKYJ(15)和QKYJ(16)之間分別具有最大相似性。隨著歐氏距離的增大，其它樣品也隨之并入到不同的類別當(dāng)中。當(dāng)歐氏距離增至9.5時(shí)， 17個(gè)青稞原酒樣本可被劃分為4類，第一類包括樣本1、2、3、4、5、6，第二類包括樣本7、8、9，第三類包括樣本10、13、14、11和12，第四類包括樣本15、16和17。17個(gè)樣本匯總最大歐氏距離差值為8，隨著歐氏距離的繼續(xù)增大至12時(shí)，樣本7、8、9和10、13、14、11和12并為第二類，可將17種不同貯酒容器青稞酒進(jìn)行區(qū)分。由聚類分析的結(jié)果可知，貯酒容器不同導(dǎo)致青稞酒原酒中5種酚類活性化合物不同，可以為白酒老熟容器后續(xù)的研究提供依據(jù)。

圖4 17種青稞原酒最遠(yuǎn)距離樹(shù)狀圖Fig.4 Average connection tree diagram of 17 kinds of barley baijiu

3.6 20種不同清香型白酒中酚類活性化合物含量對(duì)比

通過(guò)分析表4中數(shù)據(jù)可知，7個(gè)品牌的20種清香型白酒中均含有沒(méi)食子酸、丁香酸和對(duì)香豆酸，含量分別為1.29～6.32 μg/L、0.48～57.01 μg/L和7.00～75.57 μg/L。 僅有XHC(2)中未檢測(cè)出阿魏酸，其余19種白酒中阿魏酸含量為0.90～9.89 μg/L。未檢出(+)-兒茶素水合物的樣品較多，為6種，其余14種清香型白酒中(+)-兒茶素水合物的含量為0.58～8.99 μg/L。5種酚類活性化合物在清香型白酒中平均含量大小為對(duì)香豆酸(31.49 μg/L)>丁香酸(11.28 μg/L)>沒(méi)食子酸(3.74 μg/L)>阿魏酸(3.02 μg/L)>(+)-兒茶素水合物(2.82 μg/L)。20種清香型白酒中5種酚類活性化合物平均總量為52.04 μg/L，QK(1)～QK(3)的5種酚類活性化合物的平均總量為64.94 μg/L，對(duì)比其它清香型白酒，青稞酒中5種酚類活性化合物的總含量高于除HX(1)和HX(2)外的清香型白酒。

表4 20種清香型白酒中5種酚類活性化合物含量

3.7 不同香型白酒中酚類活性化合物含量對(duì)比

分別選取清香型(以青稞酒為代表)、濃香型、醬香型和芝麻香型白酒各3個(gè)樣品進(jìn)行分析，由表5可知，在12個(gè)不同香型白酒中，5種酚類活性化合物中，對(duì)香豆酸的平均含量最高，阿魏酸的平均含量最低，除(+)-兒茶素水合物外，其余4種酚類活性化合物均在4種不同香型的商品白酒中檢出。5種酚類活性化合物的總量排序?yàn)椋横u香型(141.01 μg/L)>清香型(64.94 μg/L)>芝麻香型(36.99 μg/L)>濃香型(27.73 μg/L)。在圖5中，不同顏色代表不同含量， 從藍(lán)色、綠色、黃色至紅色代表酚類活性化合物的含量從低到高。從顏色變化趨勢(shì)可以直觀看出，醬香型白酒中的對(duì)香豆酸和(+)-兒茶素水合物含量高于其它香型白酒，清香型白酒中(+)-兒茶素水合物、丁香酸和對(duì)香豆酸的含量高于濃香型白酒和芝麻香型白酒，芝麻香型白酒中阿魏酸的含量較高。

表5 清香型、濃香型、醬香型和芝麻香型白酒中5種酚類活性化合物含量

圖5 4種不同香型商品白酒酚類活性化合物含量熱圖Fig.5 Heatmap of phenolic active compounds in 4 different types of commercial baijiu

4 結(jié) 論

建立了一種快速準(zhǔn)確測(cè)定白酒中5種酚類活性化合物的方法, 優(yōu)化了萃取條件。本方法的檢出限為0.98～12.2 μg/L，加標(biāo)回收率為84.1%～100.7%。不同貯酒容器青稞原酒中酚類活性化合物平均總量排序?yàn)椋豪咸諌?不銹鋼大罐>新陶壇。貯存在新陶壇中的青稞酒原酒中的沒(méi)食子酸和丁香酸含量較高，貯藏在不銹鋼大罐中的青稞酒原酒中的(+)-兒茶素水合物和阿魏酸含量較高。通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)，貯酒容器不同導(dǎo)致青稞酒原酒中5種酚類活性化合物不同，可以為白酒的老熟后續(xù)的研究提供理論依據(jù)。不同品牌的清香型白酒中酚類活性化合物含量不同, 青稞酒中酚類活性化合物的平均含量高于多數(shù)清香型白酒, 不同香型白酒中酚類活性化合物含量不同。4種香型白酒中5種酚類活性化合物的總量排序?yàn)椋横u香型>清香型>芝麻香型>濃香型, 其中，醬香型白酒中的對(duì)香豆酸和(+)-兒茶素水合物含量最高，芝麻香型白酒中阿魏酸的含量最高。