楊小蓉，王 楠，王天愷，王增福，李曉冉，潘 文，孟凡磊，馬 良

(1.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 豐臺(tái) 100070；2. 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學(xué)藥品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100095；3. 北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)研究中心，北京 海淀 100095；4. 乾元浩生物股份有限公司，北京 豐臺(tái) 100070)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)是無(wú)囊膜的雙鏈DNA病毒，直徑70～90 nm，核衣殼呈 20 面對(duì)稱結(jié)構(gòu)。禽腺病毒分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個(gè)群，是家禽和野禽常見(jiàn)的傳染病病原之一[1-2]。其中，Ⅰ群病毒自然宿主和實(shí)驗(yàn)宿主廣泛，不僅感染雞，也在火雞、鴨、鵝、鴿、鴕鳥(niǎo)等野生禽類中分離到該病毒，引起多種家禽或野禽的臨床和病理癥候群[1-3]。

FAdV外殼由240個(gè)六鄰體(Hexon)、12個(gè)五鄰體(Penton base)和纖維蛋白部分構(gòu)成。Hexon蛋白是病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由Hexon基因編碼，大小為120 kDa，含有型、群和亞群的特異性抗原決定簇，能引發(fā)很強(qiáng)的中和反應(yīng)[4]。目前已知FAdVⅠ群分為A、B、C、D、E 五個(gè)種，根據(jù)血清交叉中和反應(yīng)又分為12 個(gè)血清型；A種包括血清1型，B種包括血清5型，C種包括血清4型和血清10型，D種包括血清2、3、9型和11型，E種包括血清6、7、8a 和 8b型[5]。各血清型 FAdV 均可感染雞，引起不同程度的肝炎癥狀；感染FAdV相關(guān)的疾病主要有雞包涵體肝炎、肌胃糜爛及心包積水綜合征等[5-6]。雞包涵體肝炎主要發(fā)生于3～5周齡雞，以肝臟壞死和肝炎為主要特征，死亡率10%左右。肌胃糜爛以 FAdV 血清1型的雞胚致死孤兒病毒為主要病原，以肌胃糜爛為主要特征，我國(guó)尚未有報(bào)道。心包積水綜合征主要由血清型4型FAdV感染引起，剖檢以心包積液或心包內(nèi)膠胨狀物為特征，伴肝臟壞死，病雞表現(xiàn)為突然發(fā)病迅速死亡，死亡率達(dá)30%～90%。

2019年從32個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)采集發(fā)病雞只(肉雞、蛋雞)組織共計(jì)88份，通過(guò)SPF雞胚傳代增殖，經(jīng)PCR鑒定，其中12個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)共計(jì)24份為禽腺病毒陽(yáng)性，場(chǎng)發(fā)病率為37.5%(12/32)，病料陽(yáng)性率為27.27% (24/88)，共分離到11株FAdV 毒株，并在線NCBI Blast進(jìn)行了Hexon基因比對(duì)分析，分別為9株 FAdV C-4、1株FAdV D-3和1株FAdV E-8b。本試驗(yàn)選擇對(duì)11株FAdV 毒株進(jìn)行基因變異分析，以期為相關(guān)研究及后續(xù)產(chǎn)品的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2019年以來(lái)自廣西、江蘇、上海、云南、河北等地發(fā)病養(yǎng)雞場(chǎng)采集的病料。

1.2 試劑材料 病毒RNA/DNA提取試劑盒、高保真DNA聚合酶等試劑，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 病毒DNA的提取及Hexon基因PCR擴(kuò)增測(cè)序 采用病毒RNA/DNA kit試劑盒進(jìn)行病毒核酸的提取純化，按照病毒RNA/DNA kit試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。根據(jù)GenBank發(fā)表的FAdV序列設(shè)計(jì)了FAdVHexon基因擴(kuò)增引物。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，上下游引物各1 μL，DNA 2 μL，高保真Taq酶 1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。用1%瓊脂凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行觀察，然后對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行回收，送至北京鉑尚公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 序列拼接與分析 應(yīng)用DNASTAR、ClustalX、GeneDoc等生物學(xué)軟件進(jìn)行FAdV基因的拼接，與GenBank收錄的國(guó)內(nèi)外參考毒株進(jìn)行比對(duì)與分析。用于本試驗(yàn)分析的毒株見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)中所用的FAdV參考毒株及來(lái)源Table 1 Origin of FAdV isolates used in this test

2 結(jié)果

2.1 FAdVHexon基因核苷酸序列及其推導(dǎo)編碼的氨基酸序列同源性分析 通過(guò)應(yīng)用軟件分析發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)獲得的11個(gè)FAdVHexon高變區(qū)基因序列相互之間核苷酸相似性為66.1%～100.0%，其推導(dǎo)的氨基酸相似性為56.5%～100.0%，見(jiàn)表2。其中，GX-1907021、GX-1908029、GX-1909030、SH-1906011、YN-1901034、YN-1906014、YN-1907020、YN-1909031和YN-1909033共9株序列基因長(zhǎng)度均為738 nt，編碼246個(gè)氨基酸；GX-1901001毒株序列基因長(zhǎng)度均為750 nt，編碼250個(gè)氨基酸；HB-1911039毒株序列基因長(zhǎng)度均為756 nt，編碼252個(gè)氨基酸。

表2 FAdV Hexon基因核苷酸及推導(dǎo)編碼的氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外參考毒株同源性比較Table 2 Comparison of nucleotide sequences and deduced amino acid homology of Hexon gene of FAdV with reference strains

2.2 依據(jù)FAdVHexon基因推導(dǎo)編碼的氨基酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹(shù) 利用MegAlign 軟件對(duì)所獲得的11個(gè)FAdVHexon基因和國(guó)內(nèi)外具有代表性的13個(gè)毒株序列進(jìn)行多序列比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖1)。

圖1 依據(jù)Hexon基因高變區(qū)推導(dǎo)的氨基酸繪制進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on deduced amino acid sequence of the Hexon genes

與國(guó)內(nèi)外參考毒株相比，本試驗(yàn)擴(kuò)增得到的11個(gè)高變區(qū)基因序列屬于C群、D群和E群。從進(jìn)化樹(shù)圖譜中顯示，GX-1909030、GX-1908029、GX-1907021、SH-1906011、YN-1901034、YN-1906014、YN-1907020、YN-1909033和YN-1909031同屬于以Fowl adenovirus C為代表的C群；GX-1901001屬于以Fowl adenovirus D為代表的D群；HB-1911039屬于以FAdV-HNQX-101017-B為代表的E群。本試驗(yàn)獲得的11株腺病毒Hexon基因存在不同程度的變異或缺失。

9株腺病毒的Hexon基因高變區(qū)與C群代表株SDJN0105親緣性更近，其核苷酸序列和推導(dǎo)編碼的氨基酸與SDJN0105相似性分別為99.9%～100.0%和99.6%～100.0%；1株腺病毒的Hexon基因高變區(qū)與D群代表株Fowl adenovirus D親緣性更近，其核苷酸序列和推導(dǎo)編碼的氨基酸與Fowl adenovirus D相似性分別為94.7%和92.8%；1株腺病毒的Hexon基因高變區(qū)與E群代表株FAdV-HNQX-101017-B親緣性更近，其核苷酸序列和推導(dǎo)編碼的氨基酸與FAdV-HNQX-101017-B相似性為99.1%和99.2%。

2.3Hexon基因核苷酸序列及其推導(dǎo)編碼的氨基酸序列的變異分析 本試驗(yàn)得到的GX-1909030、GX-1908029、GX-1907021、SH-1906011、YN-1901034、YN-1906014、YN-1907020、YN-1909033和YN-1909031共9株腺病毒的Hexon基因高變區(qū)與親緣性更近的C群代表毒株SDJN0105進(jìn)行序列比對(duì)，GX-1909030株核苷酸序列在629位堿基存在A→C突變，其推導(dǎo)編碼的氨基酸序列在210位氨基酸存在Y→S突變。

GX-1901001株與親緣性更近的D群代表毒株Fowl adenovirus D進(jìn)行序列比對(duì)，存在堿基的點(diǎn)突變(見(jiàn)圖2)，其中在230～232位存在3個(gè)堿基(AGT)的缺失；GX-1901001株推導(dǎo)編碼的氨基酸序列氨基酸缺失和突變(見(jiàn)表3)；HB-1911039株與親緣性更近的E群代表毒株FAdV-HNQX-101017-B進(jìn)行序列比對(duì)，存在堿基的點(diǎn)突變(見(jiàn)表4)，其推導(dǎo)編碼的氨基酸序列在123位和127位分別存在A→G和V→M突變。

圖2 GX-1901001株FAdV Hexon基因高變區(qū)與D群代表株比對(duì)分析Fig.2 Alignment of nucleotide sequences of Hexon gene region of FAdV GX-1901001 with Fowl adenovirus D·：保守的堿基;-：缺失的氨基酸·：Conserved amino acid;-：Deleted amino acid

表3 GX-1901001株Hexon基因推導(dǎo)編碼的氨基酸的變異Table 3 Amino acid variation of Hexon gene of FAdV of GX-1901001

表4 HB-1911039株Hexon基因核苷酸序列的變異Table 4 Nucleotide sequences variation of Hexon gene of FAdV of HB-1911039

3 討論

Hexon蛋白是FAdV的主要免疫保護(hù)性蛋白，含主要的特異性抗原決定簇和被中和抗體識(shí)別的表位，能誘導(dǎo)特異性的抗體產(chǎn)生，是FAdV分型的重要依據(jù)。

基于Hexon基因高變區(qū)核苷酸序列分析，2019年國(guó)內(nèi)發(fā)生的FAdV可分為C-4、D-3和E-8b共3個(gè)型。其中，C-4型GX-1909030株與C群代表毒株SDJN0105進(jìn)行序列比對(duì)，核苷酸序列在629位堿基存在A→C突變，其推導(dǎo)編碼的氨基酸序列在210位氨基酸存在Y→S突變。D-3型GX-1901001株與D群代表毒株Fowl adenovirus D進(jìn)行序列比對(duì)，分別有39個(gè)核苷酸存在點(diǎn)突變，而230～232位存在3個(gè)堿基(AGT)的缺失；其推導(dǎo)編碼的氨基酸序列有18個(gè)位點(diǎn)存在氨基酸突變，而在77位存在氨基酸(E)缺失。E-8b型HB-1911039株與E群代表毒株FAdV-HNQX-101017-B進(jìn)行序列比對(duì)，在30、66、168、368、379、444、546位堿基分別存在C→T、C→G、A→C、C→G、G→A、C→G、A→C點(diǎn)突變，其推導(dǎo)編碼的氨基酸序列在123位和127位分別存在A→G和V→M氨基酸突變。目前，關(guān)于 FAdV-3型禽腺病毒的相關(guān)試驗(yàn)相對(duì)較少，該病毒的致病特性、適應(yīng)性、所引起的臨床癥狀等報(bào)道較少；而在本試驗(yàn)采集的雞場(chǎng)發(fā)病情況顯示，該毒株致病性較強(qiáng)，引起雞群死亡率顯著增加，剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟發(fā)黑壞死；說(shuō)明FAdV-3型GX-1901001株變異和缺失可能是導(dǎo)致其致病性升高的原因[6-7]。

本試驗(yàn)獲得的11株腺病毒Hexon基因存在不同程度的變異或缺失，在進(jìn)化樹(shù)中已形成多個(gè)小分支。由此說(shuō)明目前國(guó)內(nèi)養(yǎng)雞場(chǎng)發(fā)生的FAdV在流行過(guò)程中變異較大，可能影響現(xiàn)有疫苗保護(hù)效力[8]。

因此，監(jiān)測(cè)和分析我國(guó)FAdV的Hexon基因變異情況，為FAdV變異演化提供了有價(jià)值的基因信息數(shù)據(jù)，對(duì)于疫苗開(kāi)發(fā)及制定防控策略均有重要指導(dǎo)意義。