尹術(shù)華,吳文英,宋也好,李 露,付王威,李文娟

(南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330047)

白扁豆(DolichoslablabL)又稱藊豆、白藊豆和南扁豆,是一種豆科類植物,原產(chǎn)于印度、印度尼西亞等地,在漢、晉時期引入我國[1]。白扁豆具有較高的營養(yǎng)價值、味甘性溫、對食欲低下、胸悶胃虛、醉酒嘔吐等癥狀均具有良好的防治效果,在抗菌、抗腫瘤、抗氧化等方面均有重要的生理作用[2-3]。近年來,從白扁豆成熟種子中獲得一種活性組分——白扁豆多糖,前期研究發(fā)現(xiàn)該多糖可通過上調(diào)bcl-2穩(wěn)定線粒體膜通透性,保護神經(jīng)細(xì)胞,減少細(xì)胞凋亡,抑制腦的缺氧性損傷[4-6]。史娟[7]采用超聲波輔助提取方法對白扁豆多糖的提取條件進行優(yōu)化并研究其特性。徐敏[8]以白扁豆多糖為研究對象,通過響應(yīng)面法研究最佳提取條件。這些研究大多集中于對白扁豆粗多糖的提取優(yōu)化,而對其化學(xué)成分分析、單糖組成及微觀形貌特征等的研究卻未見報道。

最近,非淀粉多糖在食品及生命科學(xué)領(lǐng)域被廣泛關(guān)注[9]。非淀粉多糖是豆類的主要成分,傳統(tǒng)觀點認(rèn)為其是影響豆制品營養(yǎng)有效利用的重要因素[10]。然而近幾年,科學(xué)研究已證實,非淀粉多糖具有免疫調(diào)控、穩(wěn)定血糖、調(diào)節(jié)血脂等活性功能及其在腸道中的益生元作用,是目前研究的熱點[11]。白扁豆富含淀粉,但目前有關(guān)白扁豆非淀粉多糖(Non-starch Polysaccharide fromDolichoslablabL,NS-DLP)研究較少,尤其是對其理化性質(zhì)的研究鮮有報道。因此本研究應(yīng)用傳統(tǒng)的熱水浸提法提取白扁豆中水溶性多糖,采用酶解法結(jié)合Sevage法除去白扁豆水提物中的蛋白質(zhì)和淀粉后,獲得NS-DLP,并進一步開展該多糖的分子量、單糖組成、紅外光譜分析、抗氧化活性以及抑菌性能的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白扁豆 安徽濟順中藥飲片有限公司(食品級);L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖、半乳糖醛酸、維生素C、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、D-木糖、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 優(yōu)級純,純度99.9%,美國Sigma公司;牛血清蛋白BSA 美國Amersco公司;咔唑、耐高溫α淀粉酶(30萬U)、碘化鉀 上海阿拉丁生化試劑公司;考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Fluka公司;木瓜蛋白酶(10萬U) 北京索萊寶科技有限公司;糖化酶(5萬U) 上海源葉生物科技有限公司。

Dionex ICS5000型離子色譜儀 美國Dionex公司;UPLC-1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀、-80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo公司;TU1900紫外分光光度計 北京普析通用儀器責(zé)任有限公司;多功能酶標(biāo)儀 美國BIORAD公司;Buchi R20-SE0旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司;循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 NS-DLP提取工藝流程 白扁豆粉末→95%乙醇浸泡過夜→干燥并稱重→熱水浸提4 h過濾(提兩次)→酶解→離心,濃縮→碘-碘化鉀試劑驗證淀粉→80%乙醇醇沉過夜→離心復(fù)溶→Sevage脫蛋白(重復(fù)四次)→除去有機試劑→透析→冷凍干燥→NS-DLP

1.2.2 NS-DLP提取關(guān)鍵步驟 以白扁豆為原料提取NS-DLP,把白扁豆粉碎成粉末狀,95%乙醇浸泡過夜以脫色和除去部分醇溶性雜質(zhì),然后放置托盤于水浴鍋上揮干乙醇稱重備用。將稱好的白扁豆粉末中加入水(按1∶10的比例),在90 ℃水浴中攪拌提取4 h,200目篩子過濾,保存濾液,取濾渣再提取一次,合并兩次濾液。在濾液中加入3%耐高溫淀粉酶,在90 ℃酶解30 min;然后加入3%木瓜蛋白酶,在65 ℃酶解30 min,再加入3%糖化酶,在65 ℃酶解30 min;最后100 ℃立即滅酶10 min。離心除去殘渣,用碘-碘化鉀試劑驗證淀粉已經(jīng)完全除去,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液,用80%乙醇醇沉過夜,然后離心,收集沉淀;離心所得沉淀復(fù)溶Sevage法脫蛋白四次,旋蒸除去有機試劑,分別采用流動水、蒸餾水、超純水透析3 d,最后凍干得白扁豆非淀粉多糖(NS-DLP)。

1.2.3 NS-DLP理化性質(zhì)分析

1.2.3.1 NS-DLP得率計算 稱取m g白扁豆粉末,按照1.2.2所述工藝流程提取多糖,凍干后稱得多糖質(zhì)量為n g,則NS-DLP的得率(%)=(n/m)×100

1.2.3.2 化學(xué)成分分析 分別應(yīng)用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍(lán)法和硫酸-咔唑法測得NS-DLP中的中性糖、蛋白質(zhì)及糖醛酸的含量[12-13]。

1.2.3.3 HPGPC法測定NS-DLP相對分子量 將NS-DLP用0.02% NaN3配成1 mg/mL溶液,過0.22水系濾膜,采用HPGPC法測定NS-DLP的相對分子量。選擇 UltrahydrogelTM Linear Column色譜柱,流動相:0.02% NaN3。檢測器檢測溫度和柱溫均設(shè)置為35 ℃。流速為0.6 mL/min,進樣量為20 μL。各葡聚糖(Dextran)標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成1 mg/mL的溶液;按上述色譜條件分析,每個樣品平行進樣3次。以保留時間為橫坐標(biāo),分子量的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖。通過已知標(biāo)準(zhǔn)分子量的標(biāo)準(zhǔn)品,計算待測樣品的分子量。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為lgMw=-0.6136x+13.436(R2=0.9894)。

1.2.3.4 NS-DLP單糖組成分析 參照文獻[14]采用硫酸水解并結(jié)合高效陰離子交換色譜串聯(lián)脈沖安培檢測器(HPAEC-PAD)分析NS-DLP的單糖組成情況。稱取多糖樣品5 mg于具塞試管中,冰浴下加入12 mol/L的硫酸0.5 mL,室溫下攪拌30 min,然后加水將硫酸稀釋至2 mol/L,轉(zhuǎn)移至100 ℃油浴中水解2 h。水解完全后,取出,迅速用冷水冷卻,將水解液稀釋50～100倍,過0.22 μm微孔濾頭,進樣。所有實驗平行三次。

色譜條件:采用CarboPac PA20分析柱((3 mm×150 mm Dionex,CA))和CarboPac PA20保護柱(3 mm×30 mm Dionex,CA)串聯(lián)使用。流動相A為250 mmol/L NaOH溶液,B為超純水,C為1 mol/L NaOAc溶液,梯度洗脫,流速為0.5 mL/min。柱溫為30 ℃,系統(tǒng)溫度25 ℃;檢測方式為脈沖安培檢測,工作電極金電極,參比池為鈀/氫((Pd/H)參比電極,進樣量10 μL,采用Dionex,Chromeleon 6.80軟件采集數(shù)據(jù)。單糖標(biāo)品(巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)配成不同濃度的混標(biāo),采用相同的色譜條件進行分析,用于判斷樣品中單糖和糖醛酸的種類和含量。

1.2.4 紅外光譜掃描 取干燥的NS-DLP樣品適量與適量KBr混合,光照下研磨使二者混合均勻并制成片狀,在4000～400 cm-1條件下用紅外光譜儀進行掃描[15]。

1.2.5 NS-DLP的電鏡掃描測試 采用離子濺射鍍膜法制備NS-DLP多糖樣品,在10 kV加速電壓下進行掃描分析并采集不同倍速下的照片,觀察多糖表面的形態(tài)[16]。

1.2.6 NS-DLP抗氧化實驗

1.2.6.1 NS-DLP對DPPH自由基的清除能力 參考文獻[17-18]稍做改動,配制濃度為6.4、3.2、1.6、0.8、0.4 mg/mL的NS-DLP溶液。以抗壞血酸(5.6、2.8、1.4、0.7、0.35 mg/mL)為對照。取2 mL濃度為0.04 mg/mL的DPPH溶液加入10 mL的EP管中,然后加入2 mL樣品溶液,充分混勻,在室溫下靜置30 min后移取300 μL至96孔板,在517 nm下測定吸光度值。

實驗分為樣品組、對照組、空白組。樣品組:取2 mL DPPH溶液,加入1 mL NS-DLP/VC及1 mL乙醇加入10 mL EP管中,充分混勻,在室溫下避光靜置30 min后移取300 μL至96孔板,在517 nm下測定吸光度值A(chǔ)2。對照組:取2 mL乙醇,加入1 mL NS-DLP/VC待測液及1 mL乙醇加入具塞試管中,充分混勻,在室溫下避光靜置30 min后移取300 μL至96孔板,在517 nm下測定吸光度值A(chǔ)1;空白組:測定2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度A0,根據(jù)下列公式計算DPPH自由基清除率。

I(%)=[1-(A2-A1)/A0]×100

式中:I表示清除率;A2為2 mL DPPH溶液+1 mL NS-DLP/VC+1 mL乙醇的吸光度值;A1為2 mL乙醇+1 mL NS-DLP/VC+1 mL乙醇的吸光度值;A0為2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇的吸光度值。

1.2.6.2 NS-DLP對OH自由基的清除能力測定 參考文獻[19-20],制備NS-DLP溶液:6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/mL,以抗壞血酸(5.6、2.8、1.4、0.7、0.35、0.175 mg/mL)為對照。步驟:精確吸取6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水楊酸溶液1 mL、待測液(NS-DLP/VC)1 mL,置于10 mL的EP管中,搖勻;混勻后加入1 mmol/L H2O2溶液1 mL,置于37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)60 min后,移取300 μL至96孔板,在波長510 nm處測定吸光度,根據(jù)下列公式計算NS-DLP的羥基自由基清除率:

I(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1:待測樣品的吸光度;A2:用水代替H2O2的待測樣品的自身吸光度值;A0:為不加待測樣品空白對照的吸光度值。

1.2.7 NS-DLP的抑菌實驗

1.2.7.1 供試菌的活化及菌懸液的制備 采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬丁培養(yǎng)基[21]分別研究NS-DLP對細(xì)菌:大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、志賀氏菌(Shigella)和李斯特菌Listeria)及霉菌:青霉(Penicillium)的影響[22]?；罨鲜黾?xì)菌和霉菌:供試菌置于斜面培養(yǎng)基,細(xì)菌37 ℃活化24 h,霉菌28 ℃下活化48 h。精挑菌苔于無菌水中,采用比濁法制備成108cfu/mL的菌懸液。

1.2.7.2 NS-DLP對供試菌的最小抑菌濃度(MIC)的測定 配制80 mg/mL的白扁豆多糖溶液,用兩倍法稀釋多糖液濃度,形成40、20、10、5 mg/mL 5個濃度梯度。采用濾紙片法,即用100 μL各供試菌懸液涂布于平板培養(yǎng)基,取浸泡于多糖溶液2 h的直徑6 mm滅菌濾紙片置放于平板上,每平板放3片,細(xì)菌平板置37 ℃培養(yǎng)24 h,霉菌置28 ℃培養(yǎng)48 h,觀察NS-DLP的抑菌情況,檢測該多糖對供試菌的最小抑菌濃度(MIC)[23-24]。以無菌水和苯甲酸鈉作為對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗中的數(shù)據(jù)分析應(yīng)用軟件為OriginPro 8,SPSS Statistics V17.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 NS-DLP基本化學(xué)成分分析

經(jīng)脫蛋白和酶解之后冷凍干燥的NS-DLP為米白色易溶于水的蓬松粉末。本實驗制得的白扁豆非淀粉多糖得率為0.9%,其多糖得率相對于其他豆類多糖的得率較低。如張旭娜[25]提取的鷹嘴豆多糖得率1.36%,曹楠楠等[26]提取的苦豆子多糖得率8.51%。而本文NS-DLP得率低,部分原因與脫蛋白過程和酶解損耗有關(guān)。經(jīng)測定可知NS-DLP中的中性糖含量較高,達(dá)63.77%±0.01%,糖醛酸含量為16.86%±0.02%,則NS-DLP中總糖含量為80.63%,同時含有少量的蛋白質(zhì)(4.65%±0.01%)。

2.2 NS-DLP相對分子量結(jié)果分析

NS-DLP相對分子量測定結(jié)果如圖1所示,由圖1可以看出，在13～20 min內(nèi),該多糖出現(xiàn)了兩個峰,其中主要組分出峰時間是13.66 min,第二個組分的出峰時間是14.805 min。用不同分子量的一系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進樣后得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為lgMw=-0.6136x+13.436(R2=0.9894),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算出NS-DLP第一個組分的分子量為2.3×105Da,第二個組分的分子量為2.2×104Da。

圖1 NS-DLP的高效液相圖譜

2.3 NS-DLP單糖組成結(jié)果

NS-DLP進行單糖組成分析,由圖2結(jié)果顯示,NS-DLP單糖組成由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖組成,質(zhì)量百分含量分別為:23.23%、6.2%、5.09%、2.76%、2.4%、0.48%,其中葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸為主要單糖,且葡萄糖含量最高,這表明NS-DLP的主要組成為葡聚糖,可為后續(xù)對其結(jié)構(gòu)解析提供一定的參考價值。

圖2 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)和NS-DLP的單糖組成色譜圖

2.4 NS-DLP紅外圖譜分析

NS-DLP的紅外光譜分析如圖3顯示,NS-DLP的紅外譜圖在3400～3500 cm-1有明顯寬峰,這是由羥基O-H的伸縮振動產(chǎn)生的,而2933 cm-1處的峰為C-H鍵的伸縮振動形成的;NS-DLP在1400～1200 cm-1的特征峰是C-H的變角振動引起的,這些特征峰表明NS-DLP歸屬于多糖[27]。1240 cm-1處的吸收峰是由羧基中O-H的變角振動產(chǎn)生的,顯示NS-DLP中含有糖醛酸。同時,NS-DLP在1649 cm-1處的峰是由N-H的變角振動和C=O的非對稱伸縮振動引起的,推斷樣品有少量的結(jié)合蛋白。此外,在950～1200 cm-1處的峰是吡喃環(huán)特征吸收峰,且在671 cm-1處發(fā)現(xiàn)有一個吸收峰,表明NS-DLP有β-糖苷鍵。

圖3 NS-DLP的紅外圖譜

2.5 NS-DLP的電鏡掃描結(jié)果

本實驗采用SEM表征NS-DLP的表觀形貌。如圖4所示,NS-DLP在不同倍數(shù)下,其表面微觀形態(tài)呈現(xiàn)出明顯的片狀。放大100倍的結(jié)構(gòu)如圖4a所示,NS-DLP呈不規(guī)則的幾何外形,表現(xiàn)為片狀,碎屑狀分布。從進一步放大1000倍的圖4b中可以看出NS-DLP表面凸凹不平,帶有孔洞的褶皺結(jié)構(gòu),且4b圖中還可看到NS-DLP片狀結(jié)構(gòu)上有一些規(guī)則紋理,結(jié)合參考文獻[28]推斷NS-DLP在聚集時具有一定的方向性。

圖4 NS-DLP掃描電鏡圖片

2.6 NS-DLP抗氧化活性分析

2.6.1 NS-DLP對DPPH自由基清除能力 NS-DLP對自由基的清除能力用清除率表示,清除率越高則NS-DLP對自由基的清除能力越好。NS-DLP和陽性對照VC對DPPH自由基的清除能力如圖5A所示。NS-DLP處于低濃度0.4 mg/mL時，其抗氧化能力很弱,對DPPH自由基的清除率只有5.26%±1.74%;當(dāng)NS-DLP組濃度由0.4 mg/mL增加到6.4 mg/mL時,NS-DLP對DPPH自由基的清除效率為21.20%±1.33%。低濃度時NS-DLP對DPPH自由基的清除能力明顯弱于VC,隨著NS-DLP濃度增加,其清除率有一定增加的趨勢,但是增加水平有限,這說明NS-DLP對DPPH自由基的清除能力較弱。

2.6.2 NS-DLP對OH自由基的清除能力 生物體受到理化因子的損傷,會在機體內(nèi)產(chǎn)生多種自由基,如OH自由基,它能和體內(nèi)大分子發(fā)生反應(yīng)從而造成過氧化損傷。OH自由基產(chǎn)生過程為:Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-,研究表明在反應(yīng)中加入水楊酸可清除OH自由基,反應(yīng)生成物在510 nm處有強吸收峰,因此可以通過吸收峰值判定抗氧化劑清除OH自由基的能力。NS-DLP對OH自由基的清除率如圖5B所示,NS-DLP處于低濃度0.2 mg/mL時，其抗氧化能力很弱,對OH自由基的清除率只有4.55%±1.79%;當(dāng)NS-DLP濃度由0.2 mg/mL增加到6.4 mg/mL時,NS-DLP對OH自由基的清除率為44.43%±2.41%。低濃度時NS-DLP對OH自由基的清除能力明顯弱于VC,隨著NS-DLP濃度增加,其清除率明顯增加,這說明NS-DLP具有較好的清除OH自由基的能力。NS-DLP對自由基的清除效率與濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,這些數(shù)據(jù)顯示NS-DLP對OH自由基具有一定的清除能力,對比2.6.1可以看出NS-DLP對OH自由基的清除率比對DPPH自由基的清除率高,這可為白扁豆以后的產(chǎn)品開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

2.7 NS-DLP抑菌試驗結(jié)果

2.7.1 NS-DLP對供試菌最小抑菌濃度(MIC)的測定 NS-DLP對細(xì)菌的MIC見表1所示,NS-DLP對志賀氏菌和枯草芽孢桿菌的MIC為20 mg/mL,NS-DLP對大腸桿菌的MIC為40 mg/mL,而對于李斯特菌表現(xiàn)出的MIC則較低,只有10 mg/mL,此外,不同濃度下的NS-DLP對青霉都未有出現(xiàn)抑菌效果,這說明NS-DLP對細(xì)菌有抑制作用,對霉菌沒有抑制作用。

2.7.2 NS-DLP對細(xì)菌的抑菌效果分析 通過觀察抑菌圈的存在與否及其直徑大小判定NS-DLP的抑菌作用,NS-DLP對細(xì)菌的抑菌作用見表2。從表2中可以得出，NS-DLP對4種細(xì)菌的抑菌作用不同,NS-DLP在李斯特菌中體現(xiàn)出最明顯的抑菌圈,抑菌圈直徑達(dá)到11.23 mm,在大腸桿菌中次之,抑菌圈直徑為10.23 mm,NS-DLP對枯草芽孢桿菌和志賀氏菌的抑制作用較差,這四種細(xì)菌的抑菌效果都隨著NS-DLP濃度的升高而增強,即NS-DLP濃度與抑菌效果呈正相關(guān)。同時,陽性對照組苯甲酸鈉測定顯示其對李斯特菌的抑制效果最好,抑菌圈直徑達(dá)到34.35 mm,對枯草芽孢桿菌的抑制效果次之,抑菌圈直徑為24.35 m。這些結(jié)果顯示多糖對細(xì)菌的抑制效果相較于苯甲酸鈉較弱。

表2 40 mg/mL NS-DLP溶液對細(xì)菌的抑菌直徑(mm)

3 結(jié)論

本研究以白扁豆為原料,通過熱水浸提,并應(yīng)用酶解法結(jié)合Sevage脫蛋白,得到非淀粉多糖NS-DLP,進一步對其理化性質(zhì)、抗氧化性及抑菌性能進行研究。實驗結(jié)果表明NS-DLP的中性糖含量較高(63.77%±0.01%),糖醛酸含量為16.86%±0.02%,還含有少量的蛋白質(zhì)(4.65%±0.01%)。NS-DLP為一類分子量在2.3×105Da的以葡萄糖為主的雜多糖;且單糖組成分析結(jié)果表明NS-DLP主要含有葡萄糖、鼠李糖和半乳糖醛酸。紅外分析結(jié)果顯示NS-DLP中含有明顯的多糖特征官能團結(jié)構(gòu),且電鏡掃描結(jié)果顯示該多糖表面微觀形貌為片狀,聚集時具有一定的方向性。同時,抗氧化實驗數(shù)據(jù)顯示:NS-DLP具有一定的抗氧化活性,抗氧化活性與該多糖呈現(xiàn)量效關(guān)系,與濃度成正比;但對不同自由基,其相應(yīng)的清除能力有差異。此外NS-DLP的抑菌試驗結(jié)果表明NS-DLP具有一定的抑菌效果,在枯草芽孢桿菌、志賀氏菌、李斯特菌以及大腸桿菌這四種菌中,NS-DLP對李斯特菌的抑制效果最強,對另外三種菌的抑制較弱。研究結(jié)果表明 NS-DLP具有一定的抗氧化性及抑菌性能,可為增加白扁豆的附加值提供依據(jù),為詮釋白扁豆的活性功能與高效開發(fā)利用白扁豆提供參考。