胡 杰,郜海燕,房祥軍,吳偉杰,陳杭君,穆宏磊

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點實驗室,中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室,浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室,浙江杭州 310021)

楊梅(Myricarubra(Lour.)S. et Zucc.)屬楊梅科,多年喬木植物,多產(chǎn)于浙江、福建、四川等省份,是我國江南地區(qū)久富盛名的水果[1]。其營養(yǎng)豐富,色澤誘人,口感酸甜,含有大量的生物活性成分如花色苷、酚酸類化合物等,因而具有較好的保健功效和較高的經(jīng)濟(jì)價值[2]。酚酸類物質(zhì)具有抗炎、抗過敏、保護(hù)血管、抗氧化、抗腫瘤及保肝等功效,有益于人體健康[3]。但酚酸結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,在高溫、光照等環(huán)境下容易發(fā)生酯鍵水解、呋喃環(huán)斷裂和脫羧反應(yīng)[4]。同時,酚酸在人體胃腸等復(fù)雜生物環(huán)境中易發(fā)生降解,導(dǎo)致其在人體中的吸收利用率降低[5]。因此,提高酚酸穩(wěn)定性對于楊梅營養(yǎng)成分的保持及利用至關(guān)重要。

目前保持生物活性的方法主要有包埋、乳化等。β-環(huán)糊精是常用的壁材之一,李延嘯等[6]采用β-環(huán)糊精為壁材,通過過飽和溶液析出法包埋大蒜素,置于模擬胃液4 h后大蒜素的釋放率為96%;大蒜素在pH1.0環(huán)境中處理4 h后,其分解率為39.48%,而經(jīng)β-環(huán)糊精包埋的大蒜素分解率僅為12.20%,可見β-環(huán)糊精包埋能有效提高大蒜素的穩(wěn)定性。

此外,近年的研究發(fā)現(xiàn)乳液為動力學(xué)穩(wěn)定體系,可包裹相應(yīng)的營養(yǎng)成分,避免其因外界環(huán)境的改變而遭到損失或破壞,被廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的包埋和遞送中[7]。莊豐辰等[8]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白是不飽和脂肪酸微膠囊的優(yōu)質(zhì)壁材,但是對敏感芯材的包埋效率和保護(hù)效果都存在一定的局限性,需要進(jìn)一步改善以提高其應(yīng)用性能。復(fù)合乳液具有熱力學(xué)不穩(wěn)定性,最近大量學(xué)者通過優(yōu)化配方來研究復(fù)合乳液的穩(wěn)定性[9]。蛋白質(zhì)與多糖具有較高的化學(xué)和膠體穩(wěn)定性,當(dāng)與乳液結(jié)合使用時具有優(yōu)異的乳化性能[10],蛋白質(zhì)起主要穩(wěn)定劑的作用[11],而多糖則通過其增稠和空間穩(wěn)定行為來促進(jìn)乳液的穩(wěn)定性[12]。Huang等[13]采用乳清蛋白-果膠復(fù)合物乳液(1∶3)對熊果苷和香豆酸進(jìn)行包埋,形成的涂層結(jié)構(gòu)緊密,具有更強的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),最高包埋率分別為91.08%和80.92%,表現(xiàn)出較好的粘度和穩(wěn)定性。

本研究分別以乳清蛋白、β-環(huán)糊精、乳清蛋白-果膠為包材對楊梅酚酸進(jìn)行包埋,在不同的環(huán)境條件(pH、溫度、光照)下研究楊梅酚酸穩(wěn)定性的變化情況,并測定包埋后的楊梅酚酸在體外模擬人體胃腸液中的穩(wěn)定性。旨在確定一種提高楊梅酚酸在儲藏和加工過程中穩(wěn)定性的保持技術(shù),并為其生產(chǎn)和綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

東魁楊梅(Myricarubra(Lour.)S. et Zucc.) 由浙江仙居縣南峰水果專業(yè)合作社提供,經(jīng)液氮冷凍粉碎至粉末,-30 ℃保存?zhèn)溆?高甲氧基果膠、乳清蛋白、β-環(huán)糊精 上海源葉生物科技有限公司;胃蛋白酶(3000 U/mg)、胰酶(3000 U/mg) 美國Genview公司。

BX51奧林巴斯顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社;GL-3250磁力攪拌器 中國江蘇其林貝爾儀器制造有限公司;UV-9000雙光束紫外可見分光光度計 中國上海精密科學(xué)儀器有限公司;G70F20CN3L-C2(CO)型微波爐 中國廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司;KQ-3000TDE型高頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Bifugo stratos型高速冷凍離心機 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 楊梅酚酸的提取 參考魏欣等[14]的方法,稱取楊梅粉末,按料液比1∶15 (w/v)加入50%(v/v)乙醇,微波輔助提取30 s(700 W)后,超聲輔助提取15 min,在5000 r/min下離心10 min后取上清液,40 ℃真空濃縮至較少體積,加入等體積的乙醚/乙酸乙酯混合溶劑(1∶1,v/v)振蕩提取分液(3～5次),獲得楊梅酚酸有機溶劑提取液,40 ℃下真空濃縮至呈現(xiàn)油滴狀后(得率為22 μg/g),取出溶解于乙醇中(100 μg/mL)備用。

1.2.2 乳液的制備 壁材乳液的制備:使用蒸餾水分別制備4%(w/w)乳清蛋白(WPC)乳液,4%(w/w)高甲氧基果膠(PEC)乳液和4%(w/w)β-環(huán)糊精(β-CD)乳液,將乳清蛋白乳液和高甲氧基果膠乳液按3∶1比例混合制備蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物。將各乳液的酸堿度調(diào)至pH3.5,而后采用磁力攪拌器(23 ℃,1000 r/min)攪拌30 min,4 ℃保存過夜以使其完全水合[13]。

芯材的制備:將楊梅酚酸溶于水、并加入3%明膠(w/v)和3% NaCl(w/v),配制成10 mL含楊梅酚酸的乳液。橄欖油中加入8%聚甘油聚蓖麻油酸酯(v/v),55 ℃下攪拌10 min。將10 mL含楊梅酚酸的乳液逐滴加入30 mL含聚甘油聚蓖麻油酸酯的橄欖油中,55 ℃攪拌5 min后即為芯材。

復(fù)合乳液的制備(包埋過程):將10 mL芯材滴入30 mL壁材乳液(WPC,β-CD或WPC-PEC)中,25 ℃下攪拌10 min后,超聲處理3 min即為復(fù)合乳液,4 ℃保存?zhèn)溆肹13]。

1.2.3 酚酸含量的測定 參照陳燕霞[15]的方法,稍作修改。吸取樣品1.0 mL置于25 mL量瓶中,加無水乙醇至5 mL,加0.3%十二烷基硫酸鈉2 mL及0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1∶0.9)混合溶液1 mL,混勻,在暗處放置5 min,加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度,在暗處放置20 min,以顯色劑為空白,在736 nm波長處測定吸收度。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.3683x+0.0013,R2=0.998,其中x為酚酸含量(μg/mL),y為吸光度。以沒食子酸來計算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酚酸含量。

1.2.4 酚酸乳液的包埋率測定 將含有楊梅酚酸的復(fù)合乳液加入10 mL乙醇中混勻,超聲(450 W)2 min后,離心(2000 r/min)10 min,取上清液,參照1.2.3方法計算酚酸濃度后再計算包埋率,計算公式如下:

式中:W表示包埋率,%;No表示根據(jù)吸光度值計算出未被包埋的楊梅酚酸濃度,μg/mL;Na表示添加到乳液中楊梅酚酸濃度,μg/mL。

1.2.5 酚酸在不同pH下的穩(wěn)定性試驗 參考盧召戰(zhàn)等[16]方法,將一定量的楊梅酚酸乳液,乳清蛋白-果膠包埋的楊梅酚酸乳液,乳清蛋白包埋的楊梅酚酸乳液,β-環(huán)糊精包埋的楊梅酚酸乳液,分別置于pH3.0、5.0、7.0、9.0和11.0的環(huán)境中,避光靜置120 min后檢測,加入甲醇破壞乳化結(jié)構(gòu),并以初始總酚酸含量為100%,計算總酚酸相對含量。

1.2.6 酚酸在高溫環(huán)境下的穩(wěn)定性試驗 參考鄭亞明[17]方法,將一定量的楊梅酚酸乳液,乳清蛋白-果膠包埋的楊梅酚酸乳液,乳清蛋白包埋的楊梅酚酸乳液,β-環(huán)糊精包埋的楊梅酚酸乳液,分別置于60、90 ℃水浴120 min,間隔30 min取樣檢測,加入甲醇破壞乳化結(jié)構(gòu),以初始總酚酸含量為100%,計算總酚酸相對含量。

1.2.7 酚酸在不同光照下的穩(wěn)定性試驗 將一定量的楊梅酚酸乳液,乳清蛋白-果膠包埋的楊梅酚酸乳液,乳清蛋白包埋的楊梅酚酸乳液,β-環(huán)糊精包埋楊梅酚酸乳液,均置于光照(27000 lx)條件處理120 min,間隔30 min取樣分析,加入甲醇破壞乳化結(jié)構(gòu),以初始總酚酸含量為100%,計算總酚酸相對含量。

1.2.8 人工胃液中穩(wěn)定性試驗 人工胃液:取8.54%稀鹽酸16.4 mL,加水800 mL,胃蛋白酶(3000 U/mg)10 g,搖勻,加水稀釋至1000 mL[18]。

在37 ℃人工胃液(pH2.0)中分別加入5 mL的楊梅酚酸乳液,乳清蛋白-果膠包埋的楊梅酚酸乳液,乳清蛋白包埋的楊梅酚酸乳液,β-環(huán)糊精包埋的楊梅酚酸乳液,以80 r/min進(jìn)行攪拌。每30 min取消化液1 mL,加入6 mL甲醇,滅活胃蛋白酶并破壞乳化結(jié)構(gòu),檢測供試樣品液中的總酚酸含量,以初始總酚酸含量為100%,計算總酚酸相對含量[19]。

1.2.9 人工腸液中穩(wěn)定性試驗 人工腸液(pH6.8):取磷酸二氫鉀6.8 g溶于500 mL蒸餾水中,用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.8,加入胰酶(250 U/mg)10 g,定容至1000 mL[18]。其余步驟同1.2.8。

1.2.10 包埋材料結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察 分別將采用乳清蛋白、β-環(huán)糊精、乳清蛋白-果膠復(fù)合乳液包埋的楊梅酚酸乳液使用超純水稀釋100倍,置于光學(xué)顯微鏡下放大40倍進(jìn)行觀察[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差形式表示,試驗重復(fù)三次,采用SAS軟件8.0版本進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅酚酸乳液的包埋率

包埋率可表示產(chǎn)生微膠囊后核心化合物在壁材中的保留程度。不同材料楊梅酚酸的包埋率如圖1所示,包埋率均在65%以上,但是不同乳狀液楊梅酚酸的包埋效果存在差異,其中以乳清蛋白-果膠混合乳液的包埋效果最好,可達(dá)82.33%,與其余兩種包埋方式相比存在顯著性差異(P<0.05),β-環(huán)糊精的包埋率為72.12%,乳清蛋白包埋率為69.33%,兩者無顯著差異(P>0.05)。Choi等[20]也發(fā)現(xiàn)果膠與乳清蛋白結(jié)合使用可提高包埋率,原因是果膠和蛋白質(zhì)之間可以發(fā)生靜電吸引,產(chǎn)生厚的界面膜,保護(hù)核心化合物不受破壞。

圖1 不同壁材對楊梅酚酸包埋率的影響

2.2 pH對不同壁材包埋楊梅酚酸穩(wěn)定性的影響

不同壁材包埋楊梅酚酸的酸堿穩(wěn)定性如圖2所示,楊梅酚酸的相對含量隨pH的增加呈逐漸下降的趨勢,表明在酸性條件下酚酸較為穩(wěn)定,在堿性條件下酚酸易降解。Guo等[21]也發(fā)現(xiàn)酚酸的降解速率隨pH的增加而迅速增大,這可能與酚酸的分子結(jié)構(gòu)相關(guān)。pH=3.0時,楊梅酚酸是否包埋對其降解無顯著作用(P>0.05);pH=5.0時,乳清蛋白-果膠混合乳液包埋的楊梅酚酸穩(wěn)定性顯著提高(P<0.05),而對照組與其他兩種包埋材料處理的楊梅酚酸穩(wěn)定性相比并無顯著性差異(P>0.05);pH=7.0時,三種材料包埋的酚酸穩(wěn)定性均顯著高于對照組(P<0.05),其中乳清蛋白-果膠混合乳液包埋的楊梅酚酸穩(wěn)定性最佳;pH=11.0時,對照組中楊梅酚酸相對含量最低,剩余酚酸相對含量僅為25.46%,乳清蛋白-果膠混合乳液包埋的楊梅酚酸含量最高為52.23%,β-環(huán)糊精包埋組為41.35%,乳清蛋白包埋組為42.88%。在中性和堿性條件下,包埋處理對楊梅酚酸的保護(hù)作用顯著(P<0.05),其中乳清蛋白-果膠混合乳液的包埋效果最佳,與其他兩種包埋處理相比,楊梅酚酸穩(wěn)定性顯著增加(P<0.05),而乳清蛋白包埋組與β-環(huán)糊精包埋組并無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 不同pH環(huán)境對不同包埋處理的楊梅酚酸穩(wěn)定性的影響

2.3 高溫環(huán)境對不同壁材包埋楊梅酚酸穩(wěn)定性的影響

不同壁材包埋的楊梅酚酸的溫度穩(wěn)定性如圖3所示,高溫條件下生物活性物質(zhì)易降解,因而其功能活性隨之降低。60 ℃時,隨著處理時間的延長,各組楊梅酚酸的相對含量呈下降趨勢,其中乳清蛋白-果膠包埋的楊梅酚酸降解速率最為緩慢,60 ℃水浴120 min,酚酸相對含量為88.45%,其次是乳清蛋白包埋乳液為81.94%,無包膜處理的楊梅酚酸乳液穩(wěn)定性最差,相對含量僅為76.86%。90 ℃處理120 min后,各組楊梅酚酸剩余相對含量均低于60 ℃處理組(P<0.05)。由此可見,溫度的升高加速了楊梅酚酸的降解,黃世超[22]也發(fā)現(xiàn)高溫條件會加速丹酚酸B的降解。90 ℃處理120 min后,乳清蛋白-果膠混合物包埋的楊梅酚酸組穩(wěn)定性最好,酚酸剩余相對含量為68.28%,顯著高于對照組的52.39%(P<0.05)。鄭利琴[23]以耐熱性物質(zhì)乙基纖維素為壁材包埋楊梅多酚,包埋后能夠有效降低楊梅多酚在高溫中的變性損失。以上結(jié)果表明,包埋處理能提高楊梅酚酸的熱穩(wěn)定性,且以乳清蛋白-果膠混合物包膜效果最佳。

圖3 不同溫度對不同包膜處理的楊梅酚酸穩(wěn)定性的影響

2.4 光照對不同壁材包埋楊梅酚酸穩(wěn)定性的影響

不同壁材包埋的楊梅酚酸的光照穩(wěn)定性如圖4所示,對照組光照處理120 min后酚酸剩余相對含量為68.20%,而黑暗條件下酚酸相對含量(98.25%)顯著高于其他組(P<0.05),可見光照會加速楊梅酚酸的降解。這與鄭亞明[17]關(guān)于丹酚酸B的分離純化及穩(wěn)定性研究結(jié)果一致。本實驗結(jié)果顯示,乳清蛋白-果膠包埋處理能有效緩解楊梅酚酸在光照條件下的降解作用,酚酸剩余相對含量為77.67%,顯著高于對照組(P<0.05),乳清蛋白與β-環(huán)糊精包膜的楊梅酚酸相對含量與對照組無顯著性差異(P>0.05)?？赡苁且驗槿榍宓鞍?果膠復(fù)合物乳液形成的涂層結(jié)構(gòu)更緊密,可有效抵擋光照,提高酚酸光穩(wěn)定性。

圖4 光照對不同包膜處理的楊梅酚酸穩(wěn)定性的影響

2.5 不同壁材包埋楊梅酚酸在人工胃液中的穩(wěn)定性

不同壁材包埋的楊梅酚酸在體外模擬人工胃液中的穩(wěn)定性如圖5所示,隨著時間的延長,不同處理的楊梅酚酸在人工胃液中的相對含量逐漸降低,但乳清蛋白-果膠、乳清蛋白、β-環(huán)糊精等包埋的楊梅酚酸乳液均高于對照組乳液中楊梅酚酸的相對含量。陳芳寧等[19]發(fā)現(xiàn)丹酚酸B脂化乳、脂化乳粒能提高所包載藥物在人工胃腸液中的穩(wěn)定性。在本實驗中,人工胃液處理120 min后,對照組中酚酸的相對含量(60.78%)顯著(P<0.05)低于乳清蛋白-果膠包埋組(71.39%)、乳清蛋白包埋組(66.12%)和β-環(huán)糊精包埋組(63.77%),結(jié)果說明包膜體系有助于提高酚酸在人工胃液中的穩(wěn)定性,其中乳清蛋白-果膠混合物能最大程度提高所包埋楊梅酚酸的穩(wěn)定性,有效抵抗外界不利環(huán)境,從而減少楊梅酚酸的降解。

圖5 人工胃液對不同包膜處理的楊梅酚酸穩(wěn)定性的影響

2.6 不同壁材包埋楊梅酚酸在人工腸液中的穩(wěn)定性

不同壁材包埋的楊梅酚酸在體外模擬人工腸液中的穩(wěn)定性如圖6所示,不同包埋處理的楊梅酚酸含量均隨著處理時間的延長而逐漸降低。與圖5在模擬胃液中的結(jié)果對比可知,楊梅酚酸在人工腸液中的穩(wěn)定性顯著(P<0.05)低于同條件下在人工胃液中的穩(wěn)定性。前期研究也發(fā)現(xiàn)丹酚酸在空腹胃液中處理4 h僅降低了11.20%,而在大腸液中處理4 h,其含量降低40.65%[24]。可能是由于人工腸液的pH高于人工胃液,堿性環(huán)境加劇了楊梅酚酸的降解,該結(jié)果與不同壁材包埋楊梅酚酸的酸堿穩(wěn)定性一致(圖2)。在本實驗中,經(jīng)人工腸液處理120 min后,乳清蛋白-果膠包埋組、乳清蛋白包埋組和β-環(huán)糊精包埋組的酚酸剩余相對含量分別為65.12%、57.50%和50.13%,均顯著高于對照組楊梅酚酸的45.62%(P<0.05)。說明包埋體系有助于提高楊梅酚酸在人工腸液中的穩(wěn)定性,其中乳清蛋白-果膠混合物的包埋效果最佳,能最大程度提高楊梅酚酸在人工腸液中的穩(wěn)定性。

圖6 人工腸液對不同包膜處理的楊梅酚酸穩(wěn)定性的影響

2.7 光學(xué)顯微鏡觀察

通過光學(xué)顯微鏡觀察包埋乳液形態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳液呈被包裹狀,內(nèi)部水相被油滴包圍,油滴被外層結(jié)構(gòu)覆蓋,證明乳液液滴上存在包膜。與用乳清蛋白(圖7B)或β-環(huán)糊精(圖7C)包埋的乳液相比,乳清蛋白-果膠復(fù)合物(圖7A)包埋的乳液具有更大的粒徑,但是粒徑大并不是因為涂層結(jié)構(gòu)疏松引起的,而是因為乳清蛋白-果膠復(fù)合物在水-油-水乳液表面形成了更強的凝膠網(wǎng)絡(luò)和更厚的涂層結(jié)構(gòu)。Huang等[13]也發(fā)現(xiàn)乳清蛋白-果膠復(fù)合物包埋親水性熊果苷和疏水性香豆酸形成的乳液粒徑更大,且具有良好的穩(wěn)定性,可能是因為包裹更緊密所致。Faridi等[25]發(fā)現(xiàn),雖然乳清蛋白-果膠復(fù)合物包埋乳液粒徑大于其他包埋物乳液,但是可以有效地保持乳液穩(wěn)定性,該發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果一致。相反,單獨的乳清蛋白包埋或乳清蛋白-阿拉伯膠復(fù)合物包埋乳液在保存過程中粒徑會逐漸變大,穩(wěn)定性逐漸下降[26]。綜上所述,乳清蛋白-果膠包埋是一種能有效提高楊梅酚酸穩(wěn)定性的方式。

圖7 不同包埋處理的楊梅酚酸顯微鏡圖片

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)在其等電點以下(pI≈5)具有正電荷,可以通過靜電相互作用吸引多糖上的陰離子基團(tuán),從而形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物乳液包埋以抵抗各種不利的環(huán)境壓力,保證內(nèi)包物的穩(wěn)定[13]。本研究以乳清蛋白、β-環(huán)糊精和乳清蛋白-果膠混合物為壁材包埋楊梅酚酸,結(jié)果顯示乳清蛋白-果膠混合乳液對于楊梅酚酸包埋效果最好,包埋率可達(dá)82.33%,顯著高于乳清蛋白(69.33%)和β-環(huán)糊精(72.12%)的包埋率。乳清蛋白多以顆粒狀聚集,形成纖維聚集的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),同時高甲氧基果膠與乳清蛋白發(fā)生靜電相互作用形成氫鍵,從而實現(xiàn)高度穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)。

酚酸在極端環(huán)境中(高pH、高溫和光照)以及人體的胃腸條件中穩(wěn)定性較差且易分解[27-28]。通過研究不同壁材包埋楊梅酚酸在高溫、高pH、光照下穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)乳清蛋白-果膠混合乳液所包埋的楊梅酚酸在pH11.0,90 ℃及光照等極端環(huán)境中都呈現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性,且效果顯著優(yōu)于乳清蛋白或β-環(huán)糊精包埋(P<0.05)。此外,本實驗還模擬了人工胃腸環(huán)境對楊梅酚酸穩(wěn)定性的影響,發(fā)現(xiàn)乳清蛋白-果膠混合乳液對楊梅酚酸穩(wěn)定性的保持效果最佳,處理120 min后剩余相對含量仍在70%以上,有效提高了酚酸在胃腸道中的穩(wěn)定性。而且本研究還進(jìn)行了各包埋乳液的形態(tài)觀察,結(jié)果顯示乳清蛋白-果膠復(fù)合物包埋的乳液粒徑較大,表面有更牢固的凝膠網(wǎng)絡(luò)和更厚的涂層結(jié)構(gòu),這可能與強靜電相互作用和界面膜的形成有關(guān)。綜上所述,乳清蛋白和高甲氧基果膠作為楊梅酚酸的包膜材料能明顯提高楊梅酚酸的穩(wěn)定性,為后續(xù)研究開發(fā)富含酚酸的食品提供了理論基礎(chǔ)。