陳可欽，雷瑩瑩，郭運娜，宋夢如，劉麗馥，代紅艷

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，沈陽110161）

植物次生壁主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成[1]。在志留紀(jì)時期，維管束植物首次出現(xiàn)在陸地上，這些維管束植物中的次生壁幫助它們建立起堅固的機械組織來支撐和運輸水，并適應(yīng)干旱的土地和惡劣的環(huán)境[2]。

在擬南芥中，多個MYB 轉(zhuǎn)錄因子作為植物中次生壁生物合成基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[3-7]。轉(zhuǎn)錄因子MYB46是控制擬南芥中整個次生壁生物合成的主要和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄開關(guān)[8-9]。在擬南芥和水稻中，MYB46 啟動子的SNBE基序是NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族成員SND1 的直接靶標(biāo)[7,10]。AtMYB46 在花序莖的纖維和導(dǎo)管中高水平表達，從而產(chǎn)生含有次生壁的束間纖維和木質(zhì)部細胞。擬南芥中MYB46 的過表達導(dǎo)致次生壁在許多表皮和葉肉細胞中異位沉積，從而表現(xiàn)出生長矮小，葉片嚴(yán)重向上卷曲的表型[8]。已有證據(jù)表明，MYB46 轉(zhuǎn)錄因子不僅與次生壁的所有3 個主要成分（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）的生物合成基因的啟動子直接結(jié)合，而且還與轉(zhuǎn)錄因子的啟動子結(jié)合[11]。另外，MYB46 及其緊密同源物MYB83 在調(diào)節(jié)次生壁的形成上具有功能冗余。在擬南芥中，MYB83 的過表達導(dǎo)致與MYB46 過表達相同的表型。與單一的myb46 或myb83 功能缺失的突變體相比，myb46/myb83 雙重突變體顯示出“幼苗致死”表型，并且在導(dǎo)管和纖維中均缺乏次生壁形成[12]。研究者對MYB46 轉(zhuǎn)錄因子的直接靶標(biāo)基因的啟動子區(qū)域進行分析[9,13]，鑒定出順式作用元件（M46RE），它是由8 個核苷酸（[A/G][G/T]T [A/T]GGT [A/G]）組成的基序。M46RE 對于MYB46 介導(dǎo)的靶基因的轉(zhuǎn)錄激活是必要且充分的，已在3 個纖維素合酶基因（CESA4，CESA7 和 CESA8）、4 個木聚糖生物合成基因（IRX8，IRX9，IRX14 和 IRX15-L）[11]和 9 個木質(zhì)素生物合成基因（AtPAL，AtC4H，At4CL1，AtHCT，AtC3H1，AtCCoAOMT1，AtCCR1，AtF5H 和 AtCAD6）的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了M46RE 基序，所有這些基因均被MYB46 上調(diào)[8,13,14]。MYB46 識別的啟動子中的另一個順式作用元件為SMRE（次級壁 MYB 響應(yīng)元件，ACC [A/T]A [A/C][T/C]）[7]。MYB58 和 MYB63 啟動子中含有 SMRE 基序，是MYB46/MYB83 的靶基因，并被證明是擬南芥次生壁形成過程中木質(zhì)素生物合成特異的轉(zhuǎn)錄激活因子[6,15-16]。

近年來，果樹中MYB 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控木質(zhì)素合成的研究也已經(jīng)有所報道。枇杷（Eriobotrya japonica）EjMYB1是果實木質(zhì)化的正調(diào)控因子，程序降溫和熱激處理均可負調(diào)控EjMYB1 表達而減緩木質(zhì)化進程[17]。扁桃（Amygdalus communis）內(nèi)果皮厚度與木質(zhì)素含量均呈極顯著正相關(guān)，朱秋萍等[18]推測MYB46 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控扁桃內(nèi)果皮木質(zhì)素的代謝，且熒光定量PCR 數(shù)據(jù)證明較厚殼需要更高MYB46 基因表達且持續(xù)時間較長。蘋果中MdMYB46 既可以促進木質(zhì)素的積累還可以直接調(diào)控非生物脅迫相關(guān)基因的表達，增強蘋果的抗鹽和滲透脅迫的能力[19]。

盡管擬南芥中次生壁生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵參與因子鑒定方面取得了進展，但果樹的次生壁合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究尚不深入?；谲浐撕陀埠松介贩N的果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們獲得了MYB46 轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，并推測該基因可能與山楂內(nèi)果皮木質(zhì)素的合成有關(guān)[20]。本研究旨在鑒定山楂MYB46 功能，并初步揭示其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

山楂（Crataegus pinnatifida）種質(zhì)資源垂枝山里紅田間保存于國家果樹種質(zhì)沈陽山楂圃。本實驗室篩選的蘋果（Malus domestica）基因型 GL-3[21]用于蘋果遺傳轉(zhuǎn)化。本氏煙（Nicotiana benthamiana）和擬南芥（Arabidopsis thaliana, Col-0）均保存在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹分子生物學(xué)實驗室中。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取 取垂枝山里紅的葉片，在液氮中冷凍后進行RNA 提取。使用改良的CTAB 法從植物材料中提取總 RNA[22]，用 DNase I（TaKaRa）處理 RNA 溶液 4 h。RNA 樣品的完整性通過 Agilent 2100 生物分析儀（Agilent Technologies）進行檢測。

1.2.2 CpMYB46 的分離和序列分析 用PrimeScriptTM第一鏈cDNA 合成試劑盒（TaKaRa）合成第一鏈cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝重疊群序列，設(shè)計特異性引物以獲得山楂MYB46 的全長。PCR 循環(huán)程序為：94℃初始變性 5min；94°C 30 s，58°C 30 s 和 72°C 1min，38 個循環(huán)；最后 72°C 延伸 10min。將該 cDNA 產(chǎn)物連接到 pMD18-T 載體并測序。通過搜索保守域數(shù)據(jù)庫（CDD）找到保守的R2R3-MYB 域（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd / cdd.shtml）。使用BLASTP 程序從其他物種獲得相似的序列。使用MEGA6 軟件進行多個序列比對。

1.2.3 過表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 為了在植物中過表達CpMYB46 基因，將CpMYB46 編碼區(qū)插入植物表達載體pRI101-AN 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRI101-CpMYB46。使用凍融轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pRI101-CpMYB46 分別引入根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101 和EHA105 中[23]。

對擬南芥種子進行表面滅菌，然后在含有0.7%（w/v）瓊脂和3%（w/v）蔗糖的1/2MS 培養(yǎng)基上發(fā)芽。使種子在1/2 MS 培養(yǎng)基上生長10d，然后轉(zhuǎn)移到含基質(zhì)的營養(yǎng)缽中在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為23℃、8h 光照/16h黑暗光周期。將生長30d 抽薹開花的擬南芥植株用于轉(zhuǎn)化。將擬南芥花序浸入含有10%蔗糖和0.02%Silwet 的1/2MS 液體培養(yǎng)基懸浮的根癌農(nóng)桿菌[GV3101（pRI101-CpMYB46）]菌液中，然后將擬南芥避光在23°C 的生長室中放置1d，最后移入光照培養(yǎng)箱中正常生長。每隔4d 左右侵染1 次，大約3 次以后收集種子，在含有30 mg·L-1卡那霉素的1/2MS 培養(yǎng)基中篩選陽性苗，并通過PCR 鑒定轉(zhuǎn)基因幼苗。

煙草的轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法[24]，農(nóng)桿菌菌株為EHA105（pRI101-CpMYB46）。通過PCR 和qRTPCR 對卡那霉素（30mg·L-1）篩選的抗性植株進一步鑒定。

蘋果基因型GL-3 的轉(zhuǎn)化以葉片為外植體，農(nóng)桿菌菌株為EHA105（pRI101-CpMYB46），方法詳見文獻[21]。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄激活分析 將CpMYB46 的全長編碼區(qū)，N 端和C 端區(qū)域分別與pGBKT7 載體中的GAL4 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域框內(nèi)融合。將重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y2H GOLD 中，使所得轉(zhuǎn)化體在缺乏色氨酸的合成缺失（SD）培養(yǎng)基上生長，并且還點樣在缺乏色氨酸、組氨酸和腺嘌呤的SD 培養(yǎng)基上進行X-alpha-gal 測定。

1.2.5 EMSA 檢測 將編碼NAC 轉(zhuǎn)錄因子的山楂CpSND1 基因的全長編碼區(qū)與GST 標(biāo)記的載體pGEX-5x-1進行融合，并在濃度為1 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21 中表達蛋白。使用PierceTMGST 試劑盒（Thermo Scientific）純化GST-SND1 融合蛋白，然后用于EMSA 分析。CpMYB46 啟動子中的SNBE 位點在3'端被生物素標(biāo)記。將純化的蛋白質(zhì)GST-SND1 與生物素標(biāo)記的SNBE 位點或200X 未標(biāo)記的雙鏈核苷酸（在競爭實驗中）在LightShiftTM化學(xué)發(fā)光EMSA 試劑盒（Thermo Scientific）中的結(jié)合緩沖液中孵育。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpMYB46 基因的克隆及序列分析

前期研究表明，一些R2R3 MYB 家族成員在硬核山楂中的表達水平高于軟核山楂[20]，其中8_Unigene_BMK.9503 被注釋為MYB46 基因。為了研究山楂軟硬內(nèi)果皮形成的分子機制，基于轉(zhuǎn)錄組拼接序列設(shè)計引物，本研究從山楂 cDNA 中擴增得到了 8_Unigene_BMK.9503 基因，該基因編碼區(qū)長度為1044 bp，編碼347 個氨基酸。多個氨基酸序列比對顯示，該基因產(chǎn)物包含兩個富含色氨酸的重復(fù)序列（R2 和R3），并且與AtMYB46 的R2R3 結(jié)構(gòu)域具有高度相似性，因此將該基因命名為 CpMYB46。利用 MEGA6 軟件繪制了 Cp-MYB46 與 126 個擬南芥MYB 成員的系統(tǒng)發(fā)育樹 （圖1A），也發(fā)現(xiàn) CpMYB46 與 AtMYB46 具有更高的同源性，但是 CpMYB46 與AtMYB46 在C 端激活結(jié)構(gòu)域有很大差異。氨基酸序列比對還顯示，CpMYB46 和蘋果MdMYB46 之間的序列一致性達到98.27%，在C 端激活域中只有6 個氨基酸不同（圖1B）。

2.2 CpMYB46 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性分析

為了檢測CpMYB46 是否具有與AtMYB46 一樣的轉(zhuǎn)錄激活活性，本研究進行了酵母雙雜交分析。檢測了山楂MYB46 全長，缺失C 端轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域和缺失N 端DNA 結(jié)合區(qū)域在酵母細胞中的轉(zhuǎn)錄活性（圖2A），結(jié)果表明CpMYB46 的全長和C 端能夠激活酵母細胞中LacZ 基因的表達（圖2B），表明它是轉(zhuǎn)錄激活因子。

圖1 CpMYB46 序列分析Figure 1 Analysis of CpMYB46

圖2 酵母細胞中CpMYB46 的轉(zhuǎn)錄活性分析Figure 2 Transcriptional activity analysis of CpMYB46 in yeast cells

2.3 異位表達CpMYB46 誘導(dǎo)次生壁沉積

為了研究CpMYB46 在次級細胞壁形成中是否具有與AtMYB46 相似的功能，將CpMYB46 基因的全長編碼序列插入植物過表達載體pRI101-AN 中，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將CpMYB46 基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中。20 株轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中有13 株表現(xiàn)出與AtMYB46 過表達相同的表型，例如生長矮小，葉片向上卷曲，萼片發(fā)育不良和不育（圖3A、B 和C）。為了進一步確認CpMYB46的功能，將CpMYB46 基因轉(zhuǎn)入進煙草中。與轉(zhuǎn)pRI101-AN 空載體煙草植株相比，異位表達CpMYB46 的煙草植株矮小，并且葉片向上卷曲（圖3D）。山楂與蘋果具有非常近的親緣關(guān)系，而CpMYB46 的氨基酸序列與Md-MYB46 具有高度一致性（圖1B）。由于山楂的轉(zhuǎn)化非常困難，為了進一步研究CpMYB46 在次生壁生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，本研究在GL-3 蘋果中異位表達了CpMYB46 基因。但是異位表達CpMYB46 基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株之間的形態(tài)上沒有明顯差異（圖3E）。

為進一步研究CpMYB46 對擬南芥次生細胞壁形成的影響，利用定量PCR 技術(shù)對擬南芥纖維素合成基因（AtCESA4、AtCESA7 和 AtCESA8）、半纖維素合成基因（AtFRA、AtIRX8 和 AtIRX9）、木質(zhì)素合成基因（At4CL和AtCCoAoMT1）的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，結(jié)果表明在異位表達CpMYB46 基因的擬南芥中它們的表達量顯著上調(diào)（圖4）。

CpMYB46 的異位表達導(dǎo)致木質(zhì)素在擬南芥和煙草葉片中沉積并限制了轉(zhuǎn)基因植株的生長。為了進一步確定山楂CpMYB46 在木質(zhì)素合成過程中的功能，利用石蠟切片技術(shù)觀察了異位表達CpMYB46 的擬南芥、煙草和蘋果植株莖的橫切面。分別取光照培養(yǎng)箱內(nèi)生長1 個月的擬南芥莖部（根部靠上1 cm 處），組培瓶內(nèi)生長1個月的煙草和蘋果莖部 （貼近培養(yǎng)基向上1 cm 處），經(jīng)過常規(guī)石蠟切片制作和番紅固綠染色，在顯微鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)異位表達CpMYB46 的轉(zhuǎn)基因擬南芥、煙草和蘋果植株次生壁厚度都明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株（圖5A～C）。

圖3 CpMYB46 在擬南芥、煙草和蘋果植株中異位表達的表型Figure 3 Phenotypes of CpMYB46 ectopic expression in Arabidopsis, tobacco and apple plants

2.4 CpSND1 轉(zhuǎn)錄因子對CpMYB46 啟動子的綁定

MYB46 屬于 SND1 直接靶標(biāo)[25]。為了研究山楂中CpSND1 是否對MYB46 的啟動子具有直接綁定功能，本研究根據(jù)染色體步移法從山楂總DNA 中擴增得到了1355bp 的啟動子序列。通過分析發(fā)現(xiàn)，該啟動子中含有SND1 特異識別的SNBE 綁定位點。于是將CpSND1 的CDS 序列插入原核表達載體pGEX-5X-1 中，與GST 標(biāo)簽構(gòu)成融合蛋白，經(jīng)過大腸桿菌誘導(dǎo)出GST-CpSND1的體外蛋白（圖6A 紅色箭頭所指），經(jīng)過純化后與生物素標(biāo)記的SNBE 位點序列共同孵育，pGEX-5X-1 空載體誘導(dǎo)的蛋白作為陰性對照，未經(jīng)過生物素標(biāo)記的200 倍的SNBE 位點序列作為競爭實驗，凝膠遷移率實驗結(jié)果表明，與擬南芥中調(diào)控模式相同，CpSND1 可以直接綁定CpMYB46 的啟動子（圖6B）。

圖4 異位表達CpMYB46 基因的擬南芥中次生壁合成基因的表達水平Figure 4 The expression level of secondary cell wall biosynthesis genes in CpMYB46 ectopically expressed Arabidopsis

圖5 異位表達CpMYB46 的擬南芥、煙草及蘋果植株莖部橫切面觀察Figure 5 Observation of the cross section of stems from Arabidopsis, tobacco and apple plants ectopically expressed CpMYB46

圖6 CpSND1 蛋白誘導(dǎo)（A）及凝膠遷移率（B）Figure 6 CpSND1 protein induction（A） and electrophoretic mobility shift（B）

3 討論與結(jié)論

作為調(diào)節(jié)次生細胞壁生物合成的關(guān)鍵開關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，MYB46 與MYB83 具有功能冗余。MYB46 和MYB83的表達直接受到擬南芥中SND1、NST1/2 和VND6/7 的調(diào)控[8,12]。雙突變體myb46/myb83 在次級細胞壁的合成中出現(xiàn)更嚴(yán)重的缺陷。過表達MYB46 或過表達MYB83 可以激活擬南芥中次生細胞壁成分如木質(zhì)素、纖維素和木聚糖的生物合成基因，并顯示出嚴(yán)重卷曲的葉片[8-9,12]。在楊樹中，MYB46/MYB83 直系同源物PtrMYB3、PtrMYB20、PtrMYB2 和PtrMYB21 的過表達導(dǎo)致次生壁的異位沉積，次生壁增厚[26]。擬南芥中異位表達Zm-MYB46 和OsMYB46 誘導(dǎo)木質(zhì)素和木聚糖的沉積，并增加表皮細胞壁中纖維素的積累[27]。當(dāng)樺樹的MYB46 基因在樺樹中過表達時，它可以誘導(dǎo)次級細胞壁的合成，也可以增強對非生物脅迫的抗性[28]。本研究表明，異位表達山楂CpMYB46 基因可以促進擬南芥、煙草和蘋果中次生細胞壁的生物合成并誘導(dǎo)次生壁的異位沉積（圖3和圖5）。

在樺樹中過表達或抑制BplMYB46 基因，樺樹生長表型沒有任何差異，例如生長限制和卷曲的葉子，這表明BplMYB46 不會影響樺木的生長或生長速率[28]。在本研究中，異位表達CpMYB46 的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草嚴(yán)重矮化且葉片卷曲，但是異位表達CpMYB46 的轉(zhuǎn)基因蘋果植株的生長沒有受到限制，且沒有向上卷曲的葉片（圖3E）。然而，在轉(zhuǎn)基因蘋果中次生壁在一些韌皮部細胞和幾乎所有木質(zhì)部細胞中都增厚（圖5C），這說明MYB46 雖然沒有引起木本植物的生長缺陷但是在次生壁合成過程中仍有重要的調(diào)控作用。在多年生木本植物的莖中，細胞壁木質(zhì)化程度最高，它們需要更多的木質(zhì)素以使其直立生長，但是在一年生草本植物中，莖中過多的木質(zhì)素可能會導(dǎo)致生長受限。木本植物和草本植物的表型不同，可能是由于木質(zhì)素的需求量不同。

MYB46 啟動子中含有SND1 可以識別綁定的SNBE 位點（[T/A]NN[C/T][T/C/G]TNNNNNNNA[A/C]GN [A/C/T][A/T]），能被SND1 直接綁定從而調(diào)控其表達[29]。本研究在山楂cDNA 中擴增得到了CpMYB46 的啟動子序列，并通過分析發(fā)現(xiàn)在其-347bp 處有1 個SNBE 基序，通過EMSA 實驗證明發(fā)現(xiàn)，CpSND1 可以直接綁定Cp-MYB46 的啟動子，這說明在植物次生壁合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，SND1-MYB46 的調(diào)控功能是相對保守的。

本研究表明山楂CpMYB46 的功能與AtMYB46 的功能相似，能被上游轉(zhuǎn)錄因子SND1 直接綁定調(diào)控，并且在次生壁沉積過程中起重要作用。