孫會杰，高德學，程洪森，那艷斌，孫敏杰，張曉波

（遼寧省經(jīng)濟作物研究所，遼寧 遼陽 111000）

芝麻（Sesamum indicum L.）是世界上重要的油料作物之一[1]，世界上大約有76 個國家有規(guī)模種植芝麻，但產(chǎn)量以亞洲和非洲等國家為主。印度、蘇丹、緬甸、中國是芝麻的主要生產(chǎn)國。芝麻籽富含脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)[2]。芝麻油不僅是人們食用油的重要來源，也是色漆、清漆、肥皂、香水、殺蟲劑和藥物等生產(chǎn)的工業(yè)原料[3]。同時也是一種藥食同源的特色油料作物，蛋白質(zhì)含量高達25%，富含黃酮類和多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、增強免疫力等多種生理活性[4-5]。芝麻病害是嚴重影響芝麻產(chǎn)量的重要因素[6]，芝麻病害不僅降低籽粒產(chǎn)量，而且病菌產(chǎn)生毒素影響人畜健康[7]。近年來，由多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）侵染芝麻的根部，導致苗期或成株期死亡的芝麻病害在我國首次發(fā)現(xiàn)[8]。據(jù)調(diào)查目前該病在遼寧、吉林和內(nèi)蒙等省區(qū)芝麻上均有不同程度發(fā)病，重病地塊發(fā)病率高達100%，個別地塊甚至因病造成絕收。由于該病是我國芝麻新病害，國內(nèi)外關于此病的研究報道缺乏，該病害發(fā)生原因不清，缺乏有效的控制病害措施，使之危害加重，已成為芝麻生產(chǎn)中亟待解決的問題。諸多研究表明，病原菌生物學特性和病害癥狀認知是對于新病害深入研究不可缺少的基礎資料，為此，本研究針對芝麻生產(chǎn)上新見病害問題，對其病害癥狀及病原菌的生物學特性進行系統(tǒng)觀察和研究，旨在為該病流行學、抗病品種選育與有效防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017～2018 年，在遼寧省經(jīng)濟作物研究所芝麻試驗地采集芝麻發(fā)病植株的發(fā)病組織，并分離保存病原菌。芝麻品種為遼芝8 號。

供試 PDA 培養(yǎng)基為：馬鈴薯(去皮)200g，葡萄糖 20g，瓊脂 20g，蒸餾水 1000mL，pH 值自然。查彼培養(yǎng)基（Czapek）為：蔗糖 30g，NaNO33g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂 15g，蒸餾水1000mL，pH 值 7.0 ～7.2。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及病害癥狀描述 采集遼寧省經(jīng)濟作物研究所芝麻試驗地的芝麻病株，將病根切成3～4cm小段，用2%次氯酸鈉（NaClO）液體表面消毒2min，無菌水漂洗3 次，置于水瓊脂培養(yǎng)基（WA）上，25°C 培養(yǎng)5d，待病菌分生孢子產(chǎn)生后，在高倍體視鏡下從PDA 培養(yǎng)基上用接種針挑取單孢，獲得純化菌株備用。通過人工土壤接菌法發(fā)病癥狀觀察和田間病害癥狀調(diào)查對該病害癥狀進行系統(tǒng)描述。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對病菌生長的影響 考察V8 培養(yǎng)基、酪蛋白-乳糖水解液培養(yǎng)基（ATCC）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA）、麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基（MEA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、芝麻種子煎汁瓊脂培養(yǎng)基（ZMZA），芝麻莖桿煎汁瓊脂培養(yǎng)基（ZMGA）、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）和水瓊脂培養(yǎng)基（WA）等12 種培養(yǎng)基對病菌生長的影響。將純化培養(yǎng)的芝麻棒孢根腐病菌菌落，用打孔器，從菌落邊緣打孔打取直徑5mm 菌餅，在無菌操作下分別移入不同種類培養(yǎng)基平板中心，每皿1 片，每處理重復4 次，置入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，采用十字交叉法測量菌落直徑，并對菌落形狀進行記載和描述。

1.2.3 不同溫度對菌絲生長的影響 病菌活化培養(yǎng)后，用打孔器從菌落邊緣打取直徑5mm 移植到PDA 培養(yǎng)基平板中心，每皿 1 片，設 10 種處理，分別置于 5，8，10，15，20，25，28，30，35，40℃下培養(yǎng)，每個處理重復 4 次。培養(yǎng)10d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，觀察其培養(yǎng)性狀及形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。

1.2.4 不同 pH 值對菌絲生長的影響 用 1mol·L-1NaOH 和 1mol·L-1HCl 調(diào)節(jié) PDA 的 pH 值，將純化培養(yǎng)的菌落，用打孔器從菌落邊緣打取直徑 5mm 的病菌片移置于不同 pH 值（3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5，11.5，12.5）的PDA 平板中央，于28℃恒溫培養(yǎng)，每個處理重復4 次，采用十字交叉法分別在培養(yǎng)7d 和10d 測量菌落直徑，并觀察菌落形狀及顏色。

1.2.5 不同碳源對菌絲生長的影響 以查彼培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，硝酸鈉(NaNO3)為固定氮源，病原菌活化培養(yǎng)后，移植直徑5mm 的病原菌片到不同碳源（葡萄糖、蔗糖、木糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇、果糖、可溶性淀粉、山梨醇）的培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)7d 和10d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理4 次重復，并觀察菌落形狀及顏色。

1.2.6 不同氮源對菌絲生長的影響 以查彼培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，固定碳源為蔗糖，將直徑5mm 菌片移到不同氮源（硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、蛋白胨、牛肉浸膏、苯丙氨酸、尿素、草酸銨、乙酸銨）的平板培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)7d 和10d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，考察不同氮源對菌絲生長的影響，每處理4次重復，并觀察菌落形狀及顏色。

1.2.7 不同光照對菌絲生長的影響 病原菌活化培養(yǎng)后，從菌落邊緣打取直徑5mm 的病菌菌片到PDA 培養(yǎng)基上，考察全光照處理（300lx）、全黑暗培養(yǎng)（0lx）和光暗交替(300lx 12h/0lx 12h)處理對菌絲生長的影響，每個處理重復4 次，置于28℃恒溫培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)7d 和10d 后采用十字交叉法測量菌落直徑，觀察菌落形狀及顏色。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

通過在芝麻生產(chǎn)田自然發(fā)生的病株和人工接種條件下病株癥狀表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該病的典型癥狀為植株萎蔫，葉片自下而上黃化和盛花后期落葉，逐漸干枯，死亡。根系發(fā)育不良，根毛明顯減少，根部紅棕色或紅褐色病斑（圖1）。隨著發(fā)病進展,根逐漸變成紫褐色,表皮脫落,局部或全部腐爛。病株早衰，蒴果不能正常成熟，嚴重影響了芝麻種子和芝麻葉片的產(chǎn)量和品質(zhì)。幼苗期病害癥狀為植株發(fā)育遲緩，葉片失綠，植株萎蔫、枯死，根部腐爛呈紫紅色。

圖1 芝麻棒孢菌根腐病癥狀Figure 1 The symptoms of sesame root rot caused by C.cassiicola

2.2 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

由表1 可知，不同培養(yǎng)基對芝麻根腐病菌的生長量和菌落形狀有顯著影響，在V8、CMA、ATCC、PSA、OA、PDA 等 6 種培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑最大，分別為 77.75，77.22，76.51，76.31，74.01，73.67mm，菌絲短、致密，是病菌培養(yǎng)良好培養(yǎng)基。在MEA 培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）上生長較慢，在WA 培養(yǎng)基上生長最慢。

2.3 不同溫度對菌絲生長的影響

由圖2 可知，不同溫度對芝麻棒孢菌的菌落直徑有顯著影響，病菌的適宜生長溫度范圍為25～30℃，最適生長溫度為28℃，低于5℃，高于40℃該病菌停止生長?？梢?，該病菌是高溫類型菌，這也可能是每年7～8 月高溫多雨季節(jié)病害加重流行的原因。

2.4 不同pH 值對菌絲生長的影響

由圖3 可知，芝麻棒孢菌的最適pH 值為6.5，培養(yǎng)7d 和10d 時菌落直徑最大，分別為40.65mm 和58.00mm，當pH 值大于8.5，小于5.5 時病原菌生長較慢，當pH 值小于3.5 或大于12.5 時，病原菌菌絲死亡，不再生長。

2.5 不同碳源對菌絲生長的影響

由圖4 可知，不同碳源對棒孢菌的生長量和菌落形狀有影響，培養(yǎng)7d 時以葡萄糖、木糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇、果糖為碳源的病原菌生長較快，在蔗糖、山梨醇、可溶性淀粉上生長較慢。菌落生長10d 時以木糖為碳源的棒孢菌生長最快，菌落直徑為79.50mm，以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、半乳糖、甘露醇、果糖為碳源的棒孢菌生長較慢，以山梨醇、可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長最慢。

2.6 不同氮源對菌絲生長的影響

由圖5 可知，培養(yǎng)7d 時以蛋白胨為氮源的病原菌生長最快，菌落直徑為72.50mm，培養(yǎng)10d 時以蛋白胨、牛肉浸膏為氮源的病原菌生長最快，菌落直徑為85mm，兩者差異不顯著，以硝酸鉀、硝酸鈉、苯丙氨酸、乙酸銨為氮源時病原菌生長較快，以硫酸銨為氮源時生長最慢。

表1 不同培養(yǎng)基對棒孢菌的影響（10d）Table 1 Effect of culture medium on mycelial growth of C.cassiicola（10d）

圖2 溫度對菌落直徑的影響Figure 2 Colony diameter of pathogen cultured at different temperature

圖3 pH 對菌落直徑的影響Figure 3 Colony diameter of pathogen cultured at different pH value

2.7 不同光照對菌絲生長的影響

由表2 可知，病原菌菌絲生長對光照要求存在差異，3 種處理病菌均能正常生長，菌落形態(tài)均為圓形，邊緣整齊，棉絮狀，連續(xù)光照培養(yǎng)菌絲生長較快，光暗交替(12h/12h)、24h 黑暗培養(yǎng)菌絲生長較慢，連續(xù)光照培養(yǎng)的棒孢菌日生長量較大，與其他兩種處理差異顯著，3 種處理菌落顏色有所不同，黑暗培養(yǎng)菌為深灰色，而光暗交替和連續(xù)光照的菌落顏色稍深，為橄欖綠色。

3 討論與結(jié)論

圖4 不同碳源對菌落直徑的影響Figure 4 Colony diameter of pathogen cultured at different carbohydrate source

圖5 不同氮源對菌落直徑的影響Figure 5 Colony diameter of pathogen cultured at different nitrogen source

表2 不同光照對棒孢菌生長的影響Table 2 Effect of light treatment on mycelial growth of C.cassiicola

針對我國芝麻上發(fā)生一種嚴重影響產(chǎn)量新病害--棒孢菌根腐病問題，從病害癥狀及病原菌生物學特性等方面進行研究。通過田間自然發(fā)病癥狀和人工接種癥狀觀察，明確芝麻棒孢菌根腐病典型的發(fā)病癥狀為植株萎蔫，葉片自下而上黃化和盛花后期落葉，逐漸干枯，死亡。病株根系發(fā)育不良，紅棕色，須根明顯減少，表皮粗糙,局部腐爛，導致芝麻早衰，蒴果不能正常成熟。幼苗表現(xiàn)發(fā)育遲緩，葉片失綠，部分病株枯死，根部腐爛呈紅或紫紅色。該病害癥狀與尖孢鐮孢菌引起的枯萎病癥狀有相似之處，均為植株枯萎和根部腐爛[10]，其不同之處在于芝麻棒孢菌根腐病根呈紫紅色、腐爛。

對芝麻棒孢根腐病菌生物學特性研究表明，芝麻棒孢菌的生長受培養(yǎng)基、溫度、氮源、碳源、pH 等因素的影響：芝麻棒孢菌在V8 培養(yǎng)基、酪蛋白-乳糖水解液培養(yǎng)基（ATCC）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）6 種培養(yǎng)基上生長最快；病菌的最適生長溫度為28℃，低于5℃，高于40℃病菌不能生長；對碳源利用較為廣泛，以蛋白胨、牛肉浸膏為氮源的病原菌生長最快；在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)芝麻棒孢菌的最適pH 為6.5；不同光照時間對棒孢菌的日生長量略有影響，連續(xù)光照培養(yǎng)菌絲生長較快、菌落顏色較深為橄欖綠色。秦人全等[10-11]報道引起木棉褐斑病及巴西橡膠樹棒孢霉落葉病的多主棒孢菌的最適生長條件為pH 值6、28℃，與本研究結(jié)果基本相似。從本試驗結(jié)果看，該病害是一種高溫高濕型病害, 最適溫度28℃, 與田間病情調(diào)查結(jié)果吻合，在遼寧，7～8 月高溫且逢多雨時節(jié)病害流行加重的規(guī)律一致。

橡膠多主棒孢菌株不能侵染其他寄主，存在明顯的寄主專化性現(xiàn)象[12-13]，多主棒孢菌的致病力同其寄主來源存在顯著的相關性，不同菌株致病性及其生物學特性等方面存在一定差異[14]，而且諸多研究發(fā)現(xiàn)多主棒孢病菌致病性易發(fā)生變異，寄主范圍廣泛[15-16]，而有關芝麻棒孢菌對其他寄主的致病力有待于進一步的研究。本研究通過對芝麻棒孢菌生物學特性的研究，闡明病菌生長和環(huán)境條件的關系，為解釋芝麻棒孢菌根腐病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律提供了重要依據(jù)，也為人工接種鑒定芝麻品種的抗病性明確了病菌生長、產(chǎn)孢最適條件；同時也為該病害的最佳防治藥劑選擇提供一定的理論基礎。

近年對多主棒孢引起的病害報道較為廣泛，多主棒孢可以引起橡膠棒孢葉斑病、黃瓜棒孢葉斑病、甜瓜棒孢葉斑病、蓮藕棒孢霉葉斑病、草莓棒孢葉斑病等多種作物的葉斑病，主要侵染寄主的葉片、莖桿等部位[17-21]。植物病原真菌寄主選擇性毒素對寄主植物具有特異性生理活性和?；宰饔梦稽c，可以對寄主的生理生化代謝酶系統(tǒng)活性及核酸代謝等產(chǎn)生顯著的影響，可誘發(fā)寄主產(chǎn)生典型的病害癥狀[22-24]，報道由棒孢菌侵染寄主葉部或莖部的發(fā)病的較多，該菌侵染寄主根部的病害報道極少，僅SATO 等[25-26]報道了棒孢菌可以侵染大豆的根部，引起大豆根腐病。本試驗首次發(fā)現(xiàn)了芝麻棒孢菌可以侵染芝麻根部，打破了棒孢菌只侵染寄主葉部和莖部的傳統(tǒng)認知，明確了該病菌侵染根部的發(fā)病癥狀，為生產(chǎn)上的病害識別和防治提供了科學依據(jù)。