谷思涵，李思博，魏松紅，劉 偉

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110161）

到2050 年，世界人口將達(dá)到90 億，伴隨著人口快速增加而來(lái)的糧食危機(jī)將愈演愈烈，而人口增長(zhǎng)又主要集中在以水稻、小麥、玉米等為主食的發(fā)展中國(guó)家[1]。為了滿足此需求，水稻生產(chǎn)將面臨諸多挑戰(zhàn)，由稻巨角間座殼（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病世界性水稻病害，也是我國(guó)水稻生產(chǎn)上的三大病害之一[2]。水稻中天然攜帶能夠抵御稻瘟病菌的抗瘟基因，目前大量的抗稻瘟病基因已被定位和克隆，為全面認(rèn)識(shí)稻瘟病菌與水稻互作提供了有力依據(jù)[3]。水稻抗稻瘟病的基因已發(fā)現(xiàn)80 余個(gè)，其中Pib、Pita 和Pi9 等28 個(gè)基因已被成功克隆，這些基因大多分布于第6，11，12 號(hào)染色體上。作為稻瘟病抗性基因密集區(qū)域，第6 染色體的Pi9 和 Pi2 位點(diǎn)周圍已被成功克隆10 個(gè)以上的抗病基因[4]。AMANTE-BORDEOS 等（1992）首次從野生稻中發(fā)現(xiàn)具有廣譜抗性基因Pi9，并獲得了RFLP 分子標(biāo)記[5]。與Pi9 來(lái)自同一位點(diǎn)上的抗病基因Pi2 由MEW 等（1994）利用分子標(biāo)記定位于RG64 和AP22 之間[6]，ZHOU 等[7]運(yùn)用圖位克隆法完成克隆?？共』蚨鄶?shù)屬于NBS-LRR 類基因，這類基因都包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）與富亮氨酸重復(fù)序列（LRR）。LRR 結(jié)構(gòu)域因重復(fù)序列數(shù)量、長(zhǎng)度及組合各不相同，導(dǎo)致組成的抗性蛋白結(jié)構(gòu)各有差異[8]。LRR 能夠與無(wú)毒基因編碼產(chǎn)物直接作用，影響植株的抗病性。當(dāng)LRR 結(jié)構(gòu)單一時(shí)，易被無(wú)毒基因編碼變異產(chǎn)物攻克，從而使品種抗性喪失，所以多基因聚合品種與抗譜多樣化已成為當(dāng)前品種抗病性改良的主要研究方向[9]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)185 份遼寧省水稻生產(chǎn)品種和實(shí)驗(yàn)材料中 9 種抗稻瘟病基因 Pi5、Pi36、Pi37、Pib、Pid2、Pid3、Pik、Pikh 和 Pita的攜帶情況進(jìn)行鑒定，以期為稻瘟病的抗病育種品種、合理布局及科學(xué)防治提供依據(jù)[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試185 份水稻（Oryza Sativa L.）材料收集自遼寧省內(nèi)7 個(gè)主要水稻產(chǎn)區(qū)：沈陽(yáng)、大連、丹東、營(yíng)口、盤錦、撫順和鐵嶺，其中29 份為生產(chǎn)品種，155 份為育種材料，1 份為對(duì)照（高感品種麗江新團(tuán)黑谷）。

遼寧省稻瘟病菌主要致病菌株采自遼寧省7 個(gè)主要水稻產(chǎn)區(qū)沈陽(yáng)、大連、丹東、營(yíng)口、盤錦、撫順和鐵嶺。

1.2 方法

1.2.1 稻瘟病菌單孢分離及產(chǎn)孢培養(yǎng) 病菌單孢分離：在TOA（番茄燕麥瓊脂培養(yǎng)基）平板上將保存于4℃或-80℃冰箱內(nèi)的稻瘟病菌活化，25℃恒溫培養(yǎng)5～10d，至有灰色孢子產(chǎn)生。然后在顯微鏡下挑取單個(gè)孢子轉(zhuǎn)入PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)，待菌絲生長(zhǎng)較多時(shí)轉(zhuǎn)入TOA 平板，25℃恒溫培養(yǎng)7～10d。

病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)：在濕潤(rùn)條件下用無(wú)菌棉簽輕刮去產(chǎn)孢平板表面菌絲。于超凈工作臺(tái)無(wú)菌風(fēng)下吹干，蓋雙層滅菌紗布。在模擬自然條件下培養(yǎng)5～7d，直至孢子大量產(chǎn)生。

菌懸液配制：用3mL 的無(wú)菌蒸餾水將產(chǎn)孢培養(yǎng)平板上的孢子洗脫。用血球計(jì)數(shù)法在顯微鏡下將稻瘟病菌的分生孢子濃度調(diào)整為每毫升2.5×106個(gè)孢子，以備接種采用。

1.2.2 水稻秧苗培育 將有機(jī)土與基質(zhì)按2∶1 混合均勻，每個(gè)穴盤內(nèi)放置一半底土，再將鑒定材料穴播于育苗盤內(nèi)，每份材料播1 穴，每穴10 粒種子，后用混合土封頂均勻。育苗期間每天換水1 次，每天保持通風(fēng)。

1.2.3 接種鑒定 于水稻3 葉1 心時(shí)期，將配制好的各菌株菌懸液均勻噴于葉片上，每品種3 次重復(fù)，接種后24h 用塑料膜覆蓋黑暗條件下保濕，模擬自然條件觀察發(fā)病情況。

1.2.4 調(diào)查記載標(biāo)準(zhǔn) 記載標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)全國(guó)稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組于1980 年制定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[11]，于接種8～10d 后調(diào)查菌株在不同供試品種上的抗?。≧）反應(yīng)類型和感病（S）反應(yīng)類型。

1.2.5 抗病比率計(jì)算 抗病比率即為表現(xiàn)為抗病的植株占總數(shù)的比率。

1.2.6 水稻品種基因組提取 采用TIANGEN 植物基因組DNA 提取試劑盒（DP320-02）提取水稻DNA。

1.2.7 引物及反應(yīng)程序 參考文獻(xiàn)引物[12-13]及優(yōu)化反應(yīng)體系和條件（表1），Primer1～9 用于稻瘟病抗性基因的鑒定。每個(gè)水稻品種檢測(cè)各類稻瘟病抗性基因設(shè)3 次重復(fù)。PCR 反應(yīng)體系 （25μL）：2×Taq PCR Master Mix（康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW0682M)12.5μL，正向引物和反向引物各 1μL（10μg·mL-1），DNA 模板1μL(20～80ng·mL-1），之后用 ddH2O 補(bǔ)足至 25μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30～60s，54～60℃退火60s，具體依據(jù)引物的G/C 含量來(lái)定，72℃延伸30～90s，具體依據(jù)目的片段長(zhǎng)度而定，30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。

1.2.8 PCR 擴(kuò)增結(jié)果的電泳檢測(cè) 4μL PCR 產(chǎn)物與 2μL 1.5×Loading buffer 混合液（4∶1）混合后，在 1%瓊脂糖凝膠中電泳，Goldview 染色后，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 185 份供試水稻材料的表型鑒定

由表2 可知，185 份材料中，接種稻瘟病菌表現(xiàn)高抗(HR)有9 份，占總數(shù)的4.86%，分別為鹽粳231、遼粳401、沈農(nóng) 315、沈農(nóng) Y16、沈農(nóng) Y65、沈農(nóng) H4、沈農(nóng) H9、沈農(nóng) H17 和沈農(nóng) H28；表現(xiàn)抗病(R)和中抗(MR)的材料各70 和71 份，分別占總數(shù)的37.84%和38.38%；表現(xiàn)感病(S)的材料為4 份，表現(xiàn)中感(MS)的材料為30份，分別占總數(shù)的2.16%和16.22%。

表1 抗病基因引物Table1 Primers for resistance genes

2.2 185 份供試水稻材料的抗稻瘟病基因型鑒定

由表3 可知，在185 份供試水稻材料中，攜帶抗病基因Pita 的共184 份，占總數(shù)的99.46%，攜帶該基因且表現(xiàn)抗病的水稻材料共149 份，占總數(shù)的80.54%，為分布頻率最高的抗病基因類型。攜帶抗病基因Pik 的共63 份，占總數(shù)的33.51%，攜帶該基因且表現(xiàn)抗病的水稻材料共53 份，占28.65%，為分布頻率最低的抗病基因類型。其余的分布頻率各不相同。

2.3 單基因及多基因聚合的材料統(tǒng)計(jì)及其抗性分析

如表4 所示，當(dāng)水稻材料只攜帶單基因Pita 時(shí)抗病比率為75%；當(dāng)水稻材料同時(shí)攜帶2 種基因Pib 和Pid3、Pid3 和 Pita、Pikh 和 Pita 時(shí)抗病比率為 100.00%；當(dāng)水稻材料同時(shí)攜帶 3 種基因 Pid3、Pikh、Pita 時(shí)抗病比率為 100.00%；當(dāng)同時(shí)攜帶 4 種基因 Pi5、Pid3、Pikh、Pita 和 Pid2、Pid3、Pikh、Pita 時(shí)抗病比率為 100.00%；當(dāng)同時(shí)攜帶 5 種基因 Pi36、Pid2、Pid3、Pikh、Pita 和 Pid2、Pid3、Pik、Pikh、Pita 時(shí)抗病比率為 100.00%，而攜帶Pi36、Pi37、Pid2、Pid3、Pita 抗病比率為0；當(dāng)同時(shí)攜帶6 種抗病基因時(shí)，抗病比率由 0.00%到100.00%不等；當(dāng)同時(shí)攜帶7 種抗病基因時(shí)抗病比率由42.86%到100.00%不等；當(dāng)同時(shí)攜帶8 種抗病基因時(shí)抗病比率由80.00%到100.00%不等；當(dāng)同時(shí)攜帶9 種抗病基因時(shí)抗病比率僅為72.73%。

3 討論與結(jié)論

植物受體常常是由抗病R 基因編碼的富亮氨酸重復(fù)蛋白或者激酶。因?yàn)榭剐砸蕾囉谑荏w配體的相互作用，大多數(shù)R 基因在抗病品種與易感品種的遺傳雜交中占主導(dǎo)地位[14-16]。大多數(shù)R 基因編碼NLR 蛋白質(zhì)，但Pid2 是例外，它對(duì)受體型激酶細(xì)胞外B 凝集素和細(xì)胞內(nèi)的血清素蘇氨酸激酶域進(jìn)行編碼。第二個(gè)例外是Pi21 基因，它編碼了一種富含蛋白質(zhì)的假定重金屬結(jié)合域。大多數(shù)的抗性基因聚集在一起，通常位于6 號(hào)和11 號(hào)染色體上[17]。Pi9與 Pi2 位點(diǎn)包含一組 NLR 基因，其中一類基因有5 個(gè)等位基因分別為 Pi9、Pi2、Piz-t、Pi50 和Pigm，另一類有3 個(gè)等位基因Pi-d3、Pid3-A4 和Pi25。抗病基因與無(wú)毒基因互作有3 種形式，第1 類主要是典型的一種R 基因和一種Avr 基因符合基因?qū)虻幕プ髂Ｊ?，例如Pi-ta 與Avr-pita[18]和Pi54 與Avr-pi54[19]，端粒連接的毒性基因Avr-pita，用中性的方式對(duì)分泌蛋白進(jìn)行編碼，其編碼的功能蛋白質(zhì)是一種成熟的蛋白酶包含c 端176 個(gè)氨基酸[20]，pita 編碼了一種有928 種氨基酸的細(xì)胞質(zhì)NLR 受體。Avr-pi54 編碼一個(gè)預(yù)測(cè)n-末端分泌一個(gè)信號(hào)肽(SP)的分泌蛋白，Pi54 前身為Pik-h，是從水稻特特普中克隆出來(lái)的編碼預(yù)測(cè)330 aa-NLR 蛋白質(zhì)，與Pita 不同Pi54 并不直接表達(dá)，而是誘導(dǎo)病原體攻擊的防御表達(dá)。第2 類是兩種R 基因和一種Avr 基因的互作模式，例如Pik-1 和Pik-2 與Avr-pik[21-22]。第3 種互作類型建立在第2 種類型之上的模式，兩種不同的Avr 蛋白可以被一個(gè)復(fù)雜的R 蛋白識(shí)別，例如，復(fù)合NLR 蛋白質(zhì)RGA4 與 RGA5異質(zhì)二聚體可以與 Avr-pia 或 Avr1-co39 其中任何一個(gè)相互作用[23]。本試驗(yàn)中攜帶 Pi36、Pi37、Pib、Pid2、Pid3、Pik、Pikh 和Pita 的23 份水稻材料的抗病比率高達(dá)100%，而攜帶9 種抗病基因時(shí)抗病比率僅為72.73%。由此可見并非攜帶抗病基因種類越多抗性越好，這可能是由于抗病基因之間存在某種關(guān)聯(lián)，或是協(xié)同作用或是拮抗作用，這種關(guān)聯(lián)促進(jìn)了水稻抗病性的提高，另一方面當(dāng)水稻所攜帶抗病基因數(shù)量較多時(shí)，體內(nèi)的抗性基因之間是否存在拮抗作用反而降低了水稻抗性，對(duì)于抗性基因之間的互作還需進(jìn)一步研究。

表2 185 份供試材料的表型鑒定Table 2 Phenotypic identification of 185 test varieties

表3 水稻抗病基因分布頻率Table 3 Gene distribution frequency of resistance genes

表4 供試185 份水稻材料所攜帶的抗稻瘟病基因類型及數(shù)目統(tǒng)計(jì)Table 4 The type and number of blast resistant genes in 185 rice samples were analyzed

試驗(yàn)結(jié)果表明攜帶抗病基因Pita 共184 份占總數(shù)的99.46%，為分布頻率最高的抗病基因類型。攜帶抗病基因Pik 共63 份占總數(shù)的33.51%，為分布頻率最低的抗病基因類型。其余基因Pi5、Pi36、Pi37、Pib、Pid2、Pid3、Pikh 的分布頻率各不相同。有 23 份水稻品種同時(shí)攜帶有 Pi36、Pi37、Pib、Pid2、Pid3、Pik、Pikh 和 Pita 且抗病比率為 100%，說(shuō)明 Pi36、Pi37、Pib、Pid2、Pid3、Pik、Pikh 和 Pita 基因之間可能存在協(xié)同效應(yīng)，它們共同作用增加了水稻材料的抗性。為了闡明寄主和病原體的共同進(jìn)化，并提供預(yù)防或控制稻瘟病的適當(dāng)方法，全世界研究人員時(shí)刻關(guān)注并開發(fā)新的能有效鑒定無(wú)毒基因和抗性基因的方法。本研究從分子生物學(xué)的角度出發(fā)，通過(guò)對(duì)遼寧省水稻品種抗稻瘟病基因型鑒定，為抗病育種及遼寧省稻瘟病的防控提供了依據(jù)。