劉曉宇，陳立杰，邢志富，王海明，段玉璽

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 植 物保護(hù)學(xué)院/北方線蟲(chóng)研究所，沈陽(yáng)110161）

植物寄生線蟲(chóng)種類繁多，已報(bào)道的植物寄生線蟲(chóng)有200 多屬、5000 余種，其中南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）是當(dāng)前難以解決的、對(duì)設(shè)施蔬菜危害嚴(yán)重的植物病害。病害發(fā)生后，減產(chǎn)約10%，嚴(yán)重的高達(dá)75%甚至絕收，每年給世界主要農(nóng)作物造成相當(dāng)于1000 億美元的損失[1-2]。目前，生產(chǎn)上根結(jié)線蟲(chóng)病的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主，農(nóng)戶為了追求高產(chǎn)而過(guò)量使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致環(huán)境污染、線蟲(chóng)抗藥性和殘留超標(biāo)等問(wèn)題日益突出。隨著環(huán)境保護(hù)、食品安全及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要，研發(fā)環(huán)境友好型的生物源殺線蟲(chóng)劑勢(shì)在必行。蟲(chóng)生真菌因兼具控制害蟲(chóng)和維護(hù)生態(tài)環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)成為該方向的研究熱點(diǎn)。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是研究與應(yīng)用最多的殺蟲(chóng)真菌[3-4]。目前我國(guó)登記注冊(cè)的球孢白僵菌產(chǎn)品共24 個(gè)，主要用于薊馬、粉虱、蚜蟲(chóng)等蔬菜害蟲(chóng)的防治，未見(jiàn)線蟲(chóng)病害防治產(chǎn)品的注冊(cè)。沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲(chóng)研究所致力于功能生防菌的篩選，獲得多株具有殺線蟲(chóng)活力的球孢白僵菌，其中球孢白僵菌Snef23 的次生代謝物對(duì)腐爛莖線蟲(chóng)、大豆胞囊線蟲(chóng)、南方根結(jié)線蟲(chóng)的致死率均達(dá)80%以上，具有很好的生防潛力[5-10]。

目前微生物農(nóng)藥多為活菌制劑，田間防治效果常受到定植環(huán)境、儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)和菌株退化等因素的影響，因此解決微生物農(nóng)藥防效穩(wěn)定性的措施之一就是通過(guò)化學(xué)方法分離和解析菌株次生代謝產(chǎn)物中的活性化合物，一方面以活性化合物的含量作為微生物農(nóng)藥藥效的評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，另一方面也可以將活性化合物的結(jié)構(gòu)作為先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)新型微生物源殺線蟲(chóng)劑。本研究利用活性追蹤法，分離純化了球孢白僵菌Snef23 的代謝產(chǎn)物中活性化合物，經(jīng)質(zhì)譜和核磁波譜解析活性化合物的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步化學(xué)合成了該化合物，最后通過(guò)室內(nèi)生測(cè)和盆栽試驗(yàn)評(píng)估了該化合物對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的毒力和防治效果，為球孢白僵菌Snef23 的推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試球孢白僵菌Snef23，由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲(chóng)研究所分離并保存。供試南方根結(jié)線蟲(chóng)2 齡幼蟲(chóng)（J2），在溫室內(nèi)用感病番茄（L402）單卵塊繁殖，挑取卵囊，0.5%NaClO 處理3 min 后無(wú)菌水沖洗3 次，于25℃培養(yǎng)箱孵化出J2 收集備用[11]，用于室內(nèi)生測(cè)和盆栽試驗(yàn)。供試番茄（Solanum lycopersicum Mill.）品種為L(zhǎng)402，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

供試苯乙烯為安耐吉化學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)，乙酰氨基丙二酸二乙酯和碘化鉀為阿拉丁試劑公司生產(chǎn)。其他試劑均為分析純并按常規(guī)法進(jìn)行干燥。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液中活性物質(zhì)的分離純化和活性檢測(cè)[10]球孢白僵菌Snef23 發(fā)酵液[3]過(guò)濾去除菌絲體，上清液旋蒸濃縮至1/4，加入4 倍體積無(wú)水乙醇，4℃靜置24h，離心取上清。減壓濃縮，凍干后冷藏備用。

取凍干粉末用去離子水配成10%濃度的溶液，上樣D101 大孔樹(shù)脂（Φ=2cm），分別用0%、30%、50%、70%、90%乙醇水溶液（V/V）進(jìn)行洗脫，流速為1.5～2.0BV·h-1，每個(gè)梯度洗脫約3～4 倍柱體積，各分3 部分收集，最終可獲得15 個(gè)級(jí)分，旋蒸濃縮后凍干，配制1mg·mL-1溶液。

以南方根結(jié)線蟲(chóng)J2 作為靶標(biāo)，測(cè)定分離純化過(guò)程中各級(jí)分的活性，尋找活性最高的級(jí)分。貝氏小皿經(jīng)高溫滅菌后分別加入50μL 線蟲(chóng)懸浮液（約含50 條J2）和1mg·mL-1的待測(cè)液1mL，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。將貝氏小皿放入（25±2）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察線蟲(chóng)的死亡情況，并計(jì)算線蟲(chóng)死亡率和校正死亡率。

1.2.2 發(fā)酵液中活性化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 濃縮活性最高的級(jí)分溶液，利用制備型薄層層析板獲得其中活性最高的化合物。在IonSpec 7.0T 傅利葉變換粒子回旋共振質(zhì)譜儀上測(cè)定質(zhì)譜。

將 10 mg 樣品溶于 0.5 mL DMSO-d6。在 Bruker AV 600 MHz spectrometer 上測(cè)定13C NMR 和1HNMR。

1.2.3 活性化合物的化學(xué)合成[12]根據(jù)菌株發(fā)酵液中活性化合物的結(jié)構(gòu)，利用文獻(xiàn)[12]中的方法合成活性化合物。

1.2.4 活性化合物對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的毒力測(cè)定 將化合物溶于甲醇，加入少量吐溫80 助溶，用無(wú)菌蒸餾水制成1.0×104mg·L-1的母液。吸取母液加入滅菌的小皿中，以無(wú)菌水定容至800μL，混勻后加入200μL 線蟲(chóng)懸浮液（內(nèi)含約 50 條 J2）。使活性化合物的測(cè)定終濃度分別為 100，200，400，800，1000mg·L-1。每個(gè)處理重復(fù) 5 次，分別以1%，2%，4%，8%，10%的甲醇水溶液為對(duì)照。將貝氏小皿放入（25±2）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在24h 和48h后進(jìn)行活體顯微鏡檢查，記錄供試線蟲(chóng)總數(shù)和死亡總數(shù)，計(jì)算半致死濃度（LC50）[13]。

1.2.5 活性化合物促生防病盆栽試驗(yàn)[14]2019 年5 月進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。番茄種子經(jīng)1%NaClO 消毒后播種于32孔穴育苗盤(pán)育苗。準(zhǔn)備10cm×10cm 的營(yíng)養(yǎng)缽，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中裝入500g 滅菌的混合土壤，土∶基質(zhì)∶沙（m/m/m）=2∶1∶1，當(dāng)番茄苗長(zhǎng)到2 葉1 心時(shí)，將長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄苗移栽到營(yíng)養(yǎng)缽，每缽1 株。培養(yǎng)條件為：相對(duì)濕度65%，溫度（28±2）℃，光照不少于16h。在移栽2d 后對(duì)番茄苗進(jìn)行試驗(yàn)處理。將化合物溶于甲醇，加入少量吐溫80 助溶，用無(wú)菌蒸餾水配置梯度濃度處理液。試驗(yàn)共設(shè)置6 個(gè)處理：只接南方根結(jié)線蟲(chóng)作為對(duì)照組（CK，0mg·L-1+J2）；100mg·L-1濃度處理（100mg·mL-1+J2）；200mg·L-1濃度處理（200mg·L-1+J2）；400mg·L-1濃度處理（400mg·L-1+J2）；800mg·L-1濃度處理（800 mg·L-1+J2）；1000mg·L-1濃度處理（1000mg·L-1+J2）。每株番茄苗接種 2000 條根結(jié)線蟲(chóng)J2。接種后，立刻向各株番茄苗灌根施用處理液50mL，每個(gè)處理重復(fù)10 次。所有處理均隨機(jī)放置在溫室的架子上，每2d 各澆無(wú)菌水50mL，常規(guī)培養(yǎng)。

處理30d 后，每處理隨機(jī)選取5 棵番茄植株連根挖出，保持根系完整。用流水將根系的泥沙沖洗干凈后，測(cè)量番茄植株的株高、根長(zhǎng)、根鮮重和根干重[15-16]；同時(shí)，檢測(cè)每株根上的根結(jié)數(shù)量，并計(jì)算根結(jié)減退率[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Microsoft Excel 和SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并采用Duncan's 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性化合物的分離純化和活性檢測(cè)

球孢白僵菌Snef23 發(fā)酵液的醇沉上清部分經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附，共收集15 個(gè)級(jí)分，活性成分主要集中在級(jí)分5 中，24h 對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的校正死亡率為50.8%，其余級(jí)分的校正死亡率均小于30%。級(jí)分5 經(jīng)薄層層析板分析，以 CH2Cl2∶CH3OH=9∶1 為展層劑，碘熏蒸為檢測(cè)手段，獲得 3 個(gè)含量較高的化合物，Snef23-E5-1、Snef23-E5-2 和 Snef23-E5-3，Rf 值分別為 0.74，0.23，0.10。利用制備型薄層層析板制備富集 3 個(gè)化合物。以南方根結(jié)線蟲(chóng)J2 為靶標(biāo)，1000mg·L-1的3 個(gè)化合物對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)J2 的校正死亡率分別為57.69%、11.31%和20.56%，繼續(xù)利用制備型薄層層析大量制備Snef23-E5-1，獲得11.8mg 用于結(jié)構(gòu)鑒定。

2.2 活性化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 質(zhì)譜分析 化合物的質(zhì)譜分析如圖1，分子離子峰m/z 222.1097[M+H]+，244.0934 為[M+Na]+，465.1914 為[2M+Na]+，260.0697 為[M+K]+。結(jié)合13C NMR（圖2a）和1H NMR（圖3a）譜圖的分析，最終確定活性物質(zhì)的分子式為C12H15NO3。

圖1 Snef23-E5-1 的質(zhì)譜圖Figure 1 The MS spectrogram of Snef23-E5-1

2.2.2 核磁共振波譜分析 圖2a 是 Snef23-E5-1 的13C NMR 圖譜。126.51，127.71，128.16，142.86ppm 是單取代苯環(huán)的特征峰，40.97ppm 和57.49ppm 為叔碳的吸收峰；18.62 和22.30ppm 為甲基吸收峰。173.02ppm 和169.12ppm 為羰基吸收峰。

圖2 Snef23-E5-1 的 13C NMR 圖譜（a.Snef23-E5-1；b.化學(xué)合成 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸）Figure 2 The 13C NMR spectrogram of Snef23-E5-1（a.Snef23-E5-1; b.Chemically synthesized N-acetyl-βmethyl-phenylalanine）

圖3a 為 Snef23-E5-1 的1H NMR 圖譜。1.204ppm 和 1.216ppm（d,J=7.2Hz,3H）為 β-甲基吸收峰；1.703ppm和 1.711ppm（d, J=4.8Hz, 3H）為乙酰基中甲基的吸收峰；3.065～3.115ppm（m, 1H）和 4.440～4.469ppm（t, J=8.4,17.4Hz） 為化合物中 2 個(gè)叔氫的吸收峰；7.232～7.286ppm （m, 5H） 為苯環(huán)上 5 個(gè) H 的吸收峰；7.942ppm 和7.957ppm（d,J=9.0Hz）為仲胺氫的吸收峰。

圖3 Snef23-E5-1 的 1H NMR 圖譜（a.Snef23-E5-1；b.化學(xué)合成 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸）Figure 3 The 1H NMR spectrogram of Snef23-E5-1（a.Snef23-E5-1; b.Chemically synthesized）

綜合化合物的質(zhì)譜和核磁共振圖譜的檢測(cè)結(jié)果，最終確定該化合物為N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸，其結(jié)構(gòu)為：

2.3 活性化合物的合成

N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸的合成工藝見(jiàn)圖4。所得產(chǎn)物為白色固體粉末，產(chǎn)率為89.6%，熔點(diǎn)為180～181℃。其13C NMR 和1H NMR 如圖2b 和圖3b。與發(fā)酵液提取獲得的Snef23-E5-1 的13C NMR 圖2a 和1H NMR圖3a 對(duì)比，兩者完全一致?；瘜W(xué)合成的N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸可用于進(jìn)一步的活性測(cè)試。

圖4 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸的合成路線Figure 4 Synthetic route of N-acetyl-β-methyl-phenylalanine

2.4 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的毒力

由表1 可知，24h 和 48h 的 LC50分別為 1018.467mg·L-1和 614.606mg·L-1，結(jié)果表明 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸對(duì)J2 具有中等活性[21]，是Snef23 發(fā)酵液中的主要活性成分。

表1 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng) J2 的毒力測(cè)定結(jié)果Table 1 Toxicity effect of N-acetyl-β-methyl-phenylalanine on J2 of Meloidogyne incognita

2.5 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸的促生防病效果

由表2 和圖6 可知，灌根施藥30d 后，各處理組與對(duì)照組的番茄生長(zhǎng)具有差異。當(dāng)處理液濃度為1000 mg·L-1時(shí)，根結(jié)減退率高達(dá)68.83%。在30d 的生長(zhǎng)期中，番茄苗接種J2 后，根部受到線蟲(chóng)侵染，產(chǎn)生根結(jié)，根部發(fā)育受到損傷，因此對(duì)照的根最短，各處理的株高、根長(zhǎng)、根鮮重和根干重?cái)?shù)值隨處理液濃度的增大而增大，當(dāng)處理液濃度為1000mg·L-1時(shí)，分別提高29.67%、74.60%、35.7%和10.5%，差異性顯著，說(shuō)明各處理經(jīng)N-乙酰氨基-β-甲基苯丙氨酸處理后根結(jié)發(fā)生量減少，但株高、根長(zhǎng)、根鮮重、干重有明顯增加，說(shuō)明該化合物不僅有殺線蟲(chóng)活性，還有促生作用。

表2 N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸對(duì)番茄植株生長(zhǎng)和根結(jié)形成的影響（30 d）Table 2 Effect of N-acetyl-β-methyl-phenylalanine on plant growth of tomato and root knot formation of Meloidogyne incognita 30 days after inoculation

圖6 盆栽試驗(yàn)中不同處理后番茄根系的癥狀表現(xiàn)（30d）Figure 6 Symptom performance of the tomato roots in 30 days after different treatments in the pot experiment

3 討論與結(jié)論

白僵菌是繼轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉BT 毒蛋白之后最有機(jī)會(huì)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)化的新型綠色生物農(nóng)藥[22]。目前研究最多并被商品化作為殺蟲(chóng)劑的是球孢白僵菌[3,23-26]，它的防治對(duì)象包括松毛蟲(chóng) (Dendrolimus spp)、蠐螬(Holotrichia diomphalia)、茶小綠葉蟬(Empoasca flavescens) 、玉米螟(Ostrinia palustralis)等。球孢白僵菌在線蟲(chóng)防治方面的研究和報(bào)道相對(duì)較少，仍處于菌株篩選[6,27]、防效測(cè)試[5,9-10]和代謝物殺線蟲(chóng)機(jī)理初探[8,28]的階段。作為生物農(nóng)藥，球孢白僵菌在生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用中對(duì)環(huán)境的要求比較高，需要根據(jù)使用地區(qū)的蟲(chóng)害類別、季節(jié)和地理位置等因素來(lái)調(diào)整施放量，惡劣的環(huán)境和不良的定植環(huán)境容易使白僵菌制劑失去活性，這也是所有微生物農(nóng)藥在應(yīng)用方面的共同缺陷。解析微生物次生代謝產(chǎn)物中的有效化合物組成是解決微生物農(nóng)藥穩(wěn)定性的有效辦法之一。本研究從對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)有高毒力的球孢白僵菌株Snef23 的次生代謝產(chǎn)物中分離獲得了化合物N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸，其對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)J2 具有毒殺作用。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)中可顯著降低根結(jié)指數(shù)，促進(jìn)植株生長(zhǎng)。1000 mg·L-1的N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸根結(jié)減退率可達(dá)68.83%，株高、根長(zhǎng)、根鮮重和根干重分別增加29.67%、74.60%、35.71%和10.53%。

微生物的次生代謝產(chǎn)物是生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的重要寶庫(kù)。目前，已確定結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物數(shù)量超過(guò)一百萬(wàn)，來(lái)源于微生物的活性化合物大約22000～23000 個(gè)[18]，這些化合物中有些毒性大或活性不夠高而無(wú)法直接應(yīng)用。20世紀(jì)80 年代初阿維菌素（avermectin，AVM）的發(fā)現(xiàn)是微生物源天然產(chǎn)物農(nóng)藥研究的劃時(shí)代突破[19]，也是目前商品化最成功的一種生物農(nóng)藥。阿維菌素的成功不僅在于它的獨(dú)立活性，還在于形成了基于相同化合物骨架而合成的系列衍生物，如伊維菌素（ivermectin）、道拉菌素（doramectin）和?，斁兀╡mamectin）等[20]。因此，如果能用化學(xué)方法合成出天然有效成分，或者以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，提高活性而降低毒性，那么許多天然產(chǎn)物活性成分都有可能被開(kāi)發(fā)成新型生物農(nóng)藥。本研究以苯乙烯和乙酰氨基丙二酸二乙酯為原料，經(jīng)加成、取代、水解和脫羧等化學(xué)反應(yīng)合成了N-乙酰-β-甲基苯丙氨酸，產(chǎn)率為89.6%。雖然該化合物對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)僅具有中等毒殺能力，但是它可以作為先導(dǎo)化合物，通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾提高活性，具有進(jìn)一步研究的潛力，為新型微生物源殺線蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)提供借鑒。

伴隨著設(shè)施蔬菜種植面積的逐漸擴(kuò)大，根結(jié)線蟲(chóng)病害也逐年加劇，獲得安全、高效、低毒的殺線蟲(chóng)藥劑已經(jīng)迫在眉睫。從微生物次生代謝物中獲得具有殺線蟲(chóng)活性的化合物，明確作用機(jī)理，開(kāi)展仿生合成是新型藥劑研究開(kāi)發(fā)的趨勢(shì)。球孢白僵菌株Snef23 的次生代謝產(chǎn)物對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)具有高毒力，它的活性化合物分離、提純和結(jié)構(gòu)解析的工作尚需繼續(xù)，并深入各化合物的殺線蟲(chóng)機(jī)理研究，為球孢白僵菌Snef23 的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。