王晨陽　李福勝　管艷華　梁法庫

摘 ? ?要：一直以來，熒光探針反應作為一種重要的反應機理被人們廣泛關(guān)注。人們對熒光探針性質(zhì)做了大量的試驗，然而對熒光探針的理論計算關(guān)注度較低。對檢測硫化氫的熒光探針的物理性質(zhì)進行了詳細的理論研究：首先，優(yōu)化了4'-（二乙氨基）-3-羥基黃酮分子和探針分子的結(jié)構(gòu);之后，計算并分析了探針的頻率以及吸收和發(fā)射光譜，理論上清晰地闡明探測硫化氫前后探針分子熒光行為和性質(zhì)的改變;再次，還計算了探針分子的前線分子軌道，研究并分析探測過程中分子內(nèi)的電子分布情況;最后，通過詳細分析，很好地解釋了熒光探針分子的探測機制，并驗證了試驗的準確性，為以后對該熒光探針的研究提供了幫助。并且得出結(jié)論：化合物A與2，2'-二吡啶二硫基苯甲酸反應生成探針分子，并與被探測物質(zhì)硫化氫反應生成產(chǎn)物分子。

關(guān)鍵詞：分子軌道理論;溶劑致變色;電子轉(zhuǎn)移;密度泛函理論;激發(fā)態(tài)

中圖分類號：O785+ .5 ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? 文章編號：2095-7394（2020）02-0081-06

熒光探針原理是利用探針分子與被探測物反應生成新的分子，通過檢測生成的分子可以確定被探測物。熒光探針機理作為一種重要的反應機理，在生物、化學、物理等方面都發(fā)揮著重要的作用，被廣泛應用于各個領(lǐng)域[1-5]。因此，熒光探針的檢測反應機理一直以來都受到國內(nèi)外專家的重點研究。[6-9]

硫化氫（H2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種內(nèi)源性有毒氣體信號化合物（氣體傳輸器），具有臭蛋味。人的身體可以產(chǎn)生少量硫化氫，硫化氫對身體有重要的作用，正常濃度的硫化氫對調(diào)節(jié)細胞氧化還原反應和其他反應起著至關(guān)重要的作用。研究已經(jīng)證實，硫化氫不僅可以放松血管平滑肌，而且可以引起血管舒張并降低血壓;硫化氫還是一種有效的抗炎顆粒;此外，硫化氫是一種有效的抗氧化劑，可以增加抗氧化劑含量。鑒于硫化氫有眾多用途，研究硫化氫變得越來越重要。由于硫化氫本質(zhì)具有不確定性，并且在大多數(shù)組織中含量較低，因此，如何以高靈敏度且不受其他生物硫醇的影響來檢測硫化氫就很有研究意義。目前，有多種方法可用來檢測硫化氫，例如比色法、電化學分析和氣相色譜等[10-11]。在各種檢測方法中，熒光檢測是一種非常靈敏有效的方法。為了更好地檢測硫化氫，在試驗上設計合成了一種探針分子，由4'-（二乙氨基）-3-羥基黃酮分子（化合物A）與2，2'-二吡啶二硫基苯甲酸分子反應生成。該探針分子具有良好的熒光特性，并且可以與硫化氫分子進行反應生成其他分子，從而很容易地通過改變的分子熒光特性檢測到硫化氫分子，通過檢測化合物A分子的熒光顏色和探針與硫化氫反應后生成物熒光顏色的改變來判斷是否含有硫化氫，進而檢測硫化氫的含量。在本次研究中，從理論上詳細地分析了化合物A分子與硫化氫反應生成產(chǎn)物分子的熒光特性、檢測前后分子結(jié)構(gòu)的紅外振動頻率以及微觀電子結(jié)構(gòu)改變等物理性質(zhì)。通過分子層面的理論分析，解釋了探針分子檢測硫化氫的探測機理，為試驗上使用探針分子檢測硫化氫的研究工作提供了重要的理論依據(jù)。

1 ? 試驗方法

為了計算出想要的數(shù)據(jù)，使用密度泛函和含時的密度泛函理論方法，并結(jié)合高斯函數(shù)劈裂基組進行計算[12]，所有的計算過程都在高斯16軟件內(nèi)完成[13]。充分地考慮了分子在弱相互作用下的結(jié)構(gòu)、光譜以及頻率等。通過使用自洽場反應，結(jié)合連續(xù)介質(zhì)模型精確地對試驗環(huán)境進行模擬，本文所有的計算分析都是在氯仿溶劑環(huán)境中進行的。選用泛函B3LYP[14]并結(jié)合基組6-311 g （d， p）對化合物A、探針分子和生成物分子進行優(yōu)化，得到電子基態(tài)的分子結(jié)構(gòu)。然后對分子進行紅外振動光譜計算，得到的體系振動頻率，不存在任何虛頻，因此表明該基態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。隨后優(yōu)化了激發(fā)態(tài)的分子結(jié)構(gòu)并計算了分子在激發(fā)態(tài)下的光譜。對于電子能量以及結(jié)構(gòu)優(yōu)化計算，均已考慮Grimme提出的DFT-D3[15]色散矯正。為了可以更加直觀地看到分子在基態(tài)與激發(fā)態(tài)的電子密度分布是不同的，又使用視圖軟件將分子在基態(tài)下與激發(fā)態(tài)下的前線分子軌道繪制出來，通過觀察電子云排布的不同，來判斷分子的物理和化學性質(zhì)[16-19]。

2 ? 結(jié)果及討論

2.1 ?化合物A分子與產(chǎn)物分子幾何結(jié)構(gòu)

基于含時密度泛函B3LYP/6-311g （d， p）的理論水平，在氯仿溶劑環(huán)境下充分地優(yōu)化了分子幾何結(jié)構(gòu)。通過計算與優(yōu)化，成功地優(yōu)化出化合物A和探針分子的基態(tài)與激發(fā)態(tài)結(jié)構(gòu)，同時，也優(yōu)化出探針分子與硫化氫反應后生成的產(chǎn)物分子的基態(tài)與激發(fā)態(tài)結(jié)構(gòu)。如圖1所示，是探針分子探測硫化氫的反應機理。從圖1中可以清楚地看到化合物A與2，2'-二吡啶二硫基苯甲酸反應生成探針分子，在加入硫化氫后，探針分子會與硫化氫分子進行反應，探針分子上的一個苯環(huán)會被一個氫原子所取代，生成一個新的分子，可以發(fā)現(xiàn)反應前后分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。通常情況下，探針分子與被探測物質(zhì)發(fā)生化學反應，生成的產(chǎn)物分子可以呈現(xiàn)出不同的光物理以及光化學性質(zhì)，通過對產(chǎn)物分子進行熒光光譜表征，實現(xiàn)對被探測物質(zhì)的檢測。

2.2 ?紅外振動頻率分析

為了確定優(yōu)化出來的化合物A和探針分子的結(jié)構(gòu)是正確的，在同樣的理論水平B3LYP/6-311g （d， p）下計算了探針分子的振動頻率。如圖2所示：左圖（a）（c）的譜線代表分子在基態(tài)結(jié)構(gòu)時的振動頻率;右圖（b）（d）的譜線代表了激發(fā)態(tài)結(jié)構(gòu)下的振動頻率。在基態(tài)和激發(fā)態(tài)下，優(yōu)化出來的結(jié)構(gòu)都是沒有虛頻的，這說明優(yōu)化出來的基態(tài)與激發(fā)態(tài)結(jié)構(gòu)是最穩(wěn)定的。通過觀察振動頻率譜圖可以發(fā)現(xiàn)，分子在激發(fā)態(tài)時振動的幅度明顯要比基態(tài)大得多，頻率大小也整體左移變小。這說明頻率在激發(fā)態(tài)下發(fā)生了紅移，這會導致分子在激發(fā)態(tài)下更不穩(wěn)定，進而更容易進行反應。然而，在基態(tài)和激發(fā)態(tài)下化合物A的振動頻率均出現(xiàn)了位于3 500 cm-1附近的振動頻率信號，這個峰值代表化合物A中羥基的伸縮振動，表明分子內(nèi)存在很強的氫鍵相互作用。值得注意的是，通過縱向?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn)，探針分子的頻率圖譜中位于3 500 cm-1附近的特征峰消失了。這主要是因為化合物A與2，2'-二吡啶二硫基苯甲酸反應，取代了化合物分子中的羥基氫原子，破壞了分子內(nèi)氫鍵相互作用，從而導致分子熒光性質(zhì)的改變。在有機發(fā)色團中，組成分子的化學鍵或官能團的原子處于不斷振動的狀態(tài)，在理論研究中通過計算分子紅外振動頻率可以判斷物質(zhì)的成分，從而知道反應是否發(fā)生，是否有生成物生成等。對于實驗工作者來說，如果事先通過理論計算分子結(jié)構(gòu)的紅外振動光譜，定性地預測試驗中反應的可行性，那么就可以降低試驗成本并提高工作效率。

2.3 ?光譜分析

為了能夠得到探針分子的光譜數(shù)據(jù)，方便研究檢測硫化氫分子的機理，使用密度泛函B3LYP/6-311g （d， p）的理論水平計算了化合物A的吸收能和熒光發(fā)射能。繪制探針分子的吸收發(fā)射光譜如圖3（a）所示，得到的分子吸收光譜為424.47 nm，熒光發(fā)射光譜為475.69 nm和605.06 nm，發(fā)現(xiàn)光譜分別發(fā)生了51.22 nm、180.59 nm的斯托克斯位移;為了能夠更好地證明反應的發(fā)生，我們又在同樣的理論水平下計算了反應后產(chǎn)物分子的吸收與發(fā)射光譜，如圖3（b）所示，得到的產(chǎn)物分子的吸收光譜為394.09 nm，熒光發(fā)射光譜為428.00 nm，發(fā)現(xiàn)光譜發(fā)生了33.91 nm的斯托克斯位移。其中G，S，S-T分別代表基態(tài)、激發(fā)態(tài)正常結(jié)構(gòu)和激發(fā)態(tài)異構(gòu)體結(jié)構(gòu)光譜。反應前后光譜發(fā)生了明顯的變化，熒光主要由化合物A的橙色變成了產(chǎn)物分子的藍紫色。因此，可以發(fā)現(xiàn)探針分子在與硫化氫反應過后會生成新的分子，生成的分子的熒光特性與化合物A分子的熒光特性有主要的顏色差別，實現(xiàn)了對硫化氫的探測。因為反應前后的生成物和反應物有著不同的光學性質(zhì)，所以它們的光譜波長也不同。

2.4 ?前線分子軌道分析

通過計算已經(jīng)比較好地分析了分子的熒光特性及其反應方式。為了更清楚地研究分子的物理化學性質(zhì)，并解釋熒光探針分子的反應機制，本文通過視圖軟件計算化合物A分子和生成物分子在氯仿溶劑中的前線分子軌道，用來展示分子上反應前后電子云排布的差別和電子的轉(zhuǎn)移特征。如圖4所示，給出了分子的最高被占據(jù)的分子軌道（HOMO）與最低未被占據(jù)分子軌道（LUMO）?？梢园l(fā)現(xiàn)，分子在基態(tài)與激發(fā)態(tài)電子密度排布發(fā)生了很明顯的變化，電子密度發(fā)生了明顯的轉(zhuǎn)移，電子云排布由HOMO軌道上的乙二胺及其連接的苯環(huán)向LUMO軌道上的稠環(huán)芳香烴萘移動。分子的電子云排布會直接影響分子物理化學性質(zhì)，因此，分子在基態(tài)與激發(fā)態(tài)會有明顯不同的光物理學現(xiàn)象。同時，化合物A與生成分子的明顯不同，會影響他們的熒光性質(zhì)。通過前線分子軌道等值面的分析可以更加直觀地看到化合物A與產(chǎn)物分子在光誘導過程中電子結(jié)構(gòu)的變化，展現(xiàn)出探針分子在探測硫化氫前后物理性質(zhì)的改變，進而正確闡述熒光檢測機制，最終對試驗上觀測到的熒光現(xiàn)象給予分子層面的解釋和說明。

3 ? 結(jié)論

本文研究了檢測硫化氫的熒光探針機理及檢測前后熒光性質(zhì)的改變。首先，優(yōu)化并分析了分子的幾何結(jié)構(gòu)，計算了這些結(jié)構(gòu)的紅外振動頻率，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的結(jié)構(gòu)沒有虛頻，證明了優(yōu)化的結(jié)構(gòu)是準確的;然后，通過紅外振動頻率的分析，發(fā)現(xiàn)熒光探針分子在光激發(fā)過程中的振動頻率發(fā)生明顯的紅移，表明探針分子在激發(fā)態(tài)上更容易與硫化氫發(fā)生反應，證實了產(chǎn)物分子的生成;接下來，為了重現(xiàn)試驗上觀測到的光物理現(xiàn)象，計算了分子的吸收和發(fā)射光譜，從計算的熒光光譜可知，在探測硫化氫前后分子的熒光顏色從橙色變成了藍紫色，實現(xiàn)了對硫化氫物質(zhì)的探測;最后，通過計算檢測硫化氫前后的前線分子軌道等值面，從分子層面對熒光檢測機制進行探究?？梢缘贸鲆韵陆Y(jié)論：化合物A與2，2'-二吡啶二硫基苯甲酸反應生成探針分子，并與被探測物質(zhì)硫化氫反應生成產(chǎn)物分子。通過與化合物A的前線分子軌道等值面相比，可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物分子的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，分子上的電子密度更多地從乙二胺及其連接的苯環(huán)部分向分子的稠環(huán)芳香烴萘的位置進行轉(zhuǎn)移，從而影響了分子的熒光性質(zhì)，導致在檢測硫化氫前后分子的熒光顏色出現(xiàn)了明顯的變化，最終實現(xiàn)對物質(zhì)中硫化氫含量的檢測。此研究很好地解釋了熒光探針分子的探測機制，并驗證了試驗上的準確性，為后續(xù)對該熒光探針的研究提供了幫助。

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責任編輯 ? ?祁秀春

Theoretical Study on the Mechanism of Fluorescent Probes for Detecting

Hydrogen Sulfide

WANG Chenyang1，LI Fusheng2，GUAN Yanhua3，LIANG Faku4

（1. Physics Experiment Center，Qiqihaer University，Qiqihaer 161000，China;2. Keshan Xijian Center School，Qiqihaer 161000，China;3. Keshan County No. 2 Middle School，Qiqihaer 161000，China，4.School of Science，Qiqihaer University，Qiqihaer 161000）

Abstract： As an important reaction mechanism， fluorescent probe reaction has been widely concerned. People have done a lot of experiments on the properties of fluorescent probes，but they have paid less attention. The theoretical calculation of fluorescent probes can well simulate the mechanisms of probes，which provides theoretical support and improvement for experiments，and also makes important contributions to the research of fluorescent probes. In this article，we carried out detailed theoretical study of the physical properties of hydrogen sulfide fluorescent probe molecules. Firstly，the structures of 4'- （diethylamino） - 3-hydroxy flavone molecule and probe molecule are optimized. Secondly，we calculated and analyzed the infrared vibrational frequencies and absorption and emission spectra of the probe，the changes in the fluorescence behavior and properties of the probe molecules before and after the detection of hydrogen sulfide are researched in theory. At the same time，we calculated the front molecular orbitals of the probe molecules and studied the intra molecular distribution of electrons during the detecting process. Finally，through our detailed analysis，the detecting mechanisms of the fluorescent probe molecule is well explained，and the validity of experimental conclusion is verified，which provides help for the research of fluorescent probe in the future. Therefore，we concluded that the compound A reacted with 2，2'-dipyridine dithiobenzoic acid to form a probe molecule，and reacted with analyte to generate a product molecule.

Key ?words： molecular orbitals theory;solvent induced discoloration;electron transfer;density functional theory;excited state

收稿日期：2019-11-03

基金項目：黑龍江省教育廳基本業(yè)務專項“一種新型靜電動力機及熱機的研制與應用”（135209251）

作者簡介：王晨陽，高級實驗師，主要研究方向為大學物理實驗設計。