陳垚焱 劉頌蕊 蘇小艷 耿 毅* 黃文俊 陳 欣 白明煥 程子瑄

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都，611130；2.成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都，610000)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)屬哺乳綱(Mammalia)，食肉目(Carnivora)，熊科(Ursidae)，大熊貓屬，被譽(yù)為“活化石”和“中國(guó)國(guó)寶”，屬國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)動(dòng)物，是世界生物多樣性保護(hù)的旗艦物種。據(jù)第四次全國(guó)大熊貓野外種群調(diào)查，野生大熊貓劃分為秦嶺、岷山、邛崍山、大相嶺、小相嶺和涼山六大種群，33個(gè)相對(duì)獨(dú)立的局域種群，總數(shù)不足2 000只[1]，表明大熊貓已形成較為穩(wěn)定的種群，但其保護(hù)形勢(shì)依然嚴(yán)峻。研究表明，野生動(dòng)物種群數(shù)量的下降不僅受氣候變化、棲息地破壞以及人類活動(dòng)等因素的影響，同時(shí)疾病的危害也對(duì)種群數(shù)量的下降造成嚴(yán)重的威脅[2-3]。目前報(bào)道的大熊貓疾病有寄生蟲病(包括蛔蟲病、吸蟲病和體外寄生蟲病)[4]、細(xì)菌病(肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、大腸埃希菌Escherichiacoli和銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa等)[5-8]和病毒病(犬瘟熱病毒CDV與輪狀病毒RV等)[8-10]等給大熊貓健康與生存造成嚴(yán)重影響。2018年7月，在四川某自然保護(hù)區(qū)發(fā)現(xiàn)1只死亡成體大熊貓，我們對(duì)其進(jìn)行了病理學(xué)與病因?qū)W分析，旨在明確其死因，為更好地開展大熊貓保護(hù)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

四川某自然保護(hù)區(qū)發(fā)現(xiàn)的1只死亡成年雄性大熊貓，體重52.9 kg。

1.1.2 主要試劑

福爾馬林固定液，TSA培養(yǎng)基，BHI培養(yǎng)基(購(gòu)于英國(guó)OXOID公司)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)于北京天根生化科技有限公司)，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)于生工生物工程(上海)股份有限公司成都分公司合成，2×TaqPCR Mastermix(購(gòu)于北京天根生化科技有限公司)，ddH2O，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)于北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(購(gòu)于北京天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢與病理組織學(xué)觀察

對(duì)死亡大熊貓進(jìn)行系統(tǒng)病理剖檢，觀察各器官、組織的大體病變。同時(shí)取心、肺、胃、小腸、大腸、肝、胰、腎、脾、淋巴結(jié)、腦與肌肉等器官，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，H.E.染色，顯微鏡觀察。

1.2.2 病原學(xué)檢測(cè)

1.2.2.1 細(xì)菌學(xué)檢查

無(wú)菌操作從死亡大熊貓的肝、脾、心血、淋巴結(jié)及壞死肌肉等處取樣分別劃線接種于TSA與BHI平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24—48 h，挑取形態(tài)大小一致的單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落在相應(yīng)平板上再次劃線培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株，并觀察菌落與菌體形態(tài)特征。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌液，離心收集菌體，參考試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌基因組DNA。采用擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因的通用引物PCR 擴(kuò)增 16S rRNA基因，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 500 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，送擎科梓熙(成都)有限公司測(cè)序。將分離菌株的16S rRNA基因序列與GenBank中已知核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。采用DNA Star軟件的Multiple Sequence Aligment程序進(jìn)行多序列比對(duì)，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2.2 病毒學(xué)檢查

取死亡大熊貓的肝、脾、腎組織提取RNA，參考郭玲等[11]的方法進(jìn)行犬瘟熱病毒的特異性檢測(cè)。參考雷燕等[12]的方法進(jìn)行輪狀病毒的特異性檢測(cè)。

1.2.2.3 寄生蟲檢查

參考艾必燕等[13]的方法進(jìn)行體外與體內(nèi)寄生蟲的檢查。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢

死亡大熊貓右耳皮膚4處開放性損傷，右肩部一深度約2.5 cm的潰瘍損傷灶(圖1-A)，右后肢掌第二趾墊缺損0.5 cm2，掌墊0.5 cm深潰瘍?cè)?處。剝離皮膚確認(rèn)無(wú)組織器官自溶后，發(fā)現(xiàn)死亡大熊貓右肩部肌肉呈藍(lán)褐色(圖1-B)，并有惡臭味，肩部潰瘍處皮下肌肉壞死。腋下淋巴結(jié)、頸部淋巴結(jié)與頜下淋巴結(jié)等淺表淋巴結(jié)腫大，呈藍(lán)褐色，切面色澤不均勻，質(zhì)地變脆(圖1-C)；胸肌與肋間肌萎縮，睪丸大小不對(duì)稱，左側(cè)大于右側(cè)。心臟擴(kuò)張，冠狀溝血管擴(kuò)張淤血，心室與心房?jī)?nèi)積血；肺門淋巴結(jié)腫大，呈紫褐色，肺萎縮，體積縮小，邊緣銳薄，被膜皺縮，并見斑狀出血(圖1-D)。肝腫脹，呈紫黑色(圖1-E)，膽囊擴(kuò)張，膽汁充盈；脾萎縮，體積縮小，被膜皺縮(圖1-F)；腎腫脹，色澤不均勻，切面見部分區(qū)域呈暗紫色(圖1-G)，腎門淋巴結(jié)腫大，呈紫褐色；胰腺呈灰白色，輕度腫大；腸系膜淋巴結(jié)腫大，呈暗紫色(圖1-H)，胃腔與腸腔內(nèi)未見明顯的異常，但黏膜易脫落。

圖1 死亡大熊貓剖檢病變Fig.1 Gross lesions of the dead giant panda 注：A：右肩部皮膚潰瘍；B：右肩部肌肉呈藍(lán)褐色；C：右側(cè)腋下及頸淋巴結(jié)腫大；D：右側(cè)肺斑塊狀出血；E：肝腫脹，呈紫黑色；F：脾萎縮，被膜皺縮；G：腎切面色澤不均，部分呈紫褐色；H：腸系膜淋巴結(jié)腫大，呈紫褐色 Note：A，skin ulcer in right shoulder.B，the muscles of the right shoulder were blue and brown.C，right axillary and cervical lymph node enlargement.D，hemorrhage in right lung.E，swelling in liver with purplish black.F，atrophy of spleen and the capsule was shrinking.G，the section of kidney was inhomogeneity in color，part of which is bluish brown.H，enlargement in mesenteric lymph nodes with bluish brown

2.2 病理組織學(xué)觀察

病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，死亡大熊貓心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、肌肉與腸道等組織器官都發(fā)生較明顯的病理?yè)p傷，并在心、肝、肺與淋巴結(jié)等都發(fā)現(xiàn)大量細(xì)菌入侵。

心：心肌纖維表現(xiàn)為顆粒變性，肌間隙增寬，其間偶見細(xì)菌團(tuán)塊，并致心肌局部形成局灶性溶解壞死灶(圖2-A)。

肝：局部區(qū)域肝小葉中央靜脈與肝血竇擴(kuò)增淤血(圖2-B)，肝細(xì)胞較為廣泛性顆粒與水泡變性，部分中央靜脈與小葉間血管內(nèi)見長(zhǎng)短不一桿狀細(xì)菌，且部分肝小葉內(nèi)見細(xì)菌入侵，并致灶性壞死(圖2-C)。

脾：被膜增厚，實(shí)質(zhì)內(nèi)大量結(jié)締組織小梁增生，白髓區(qū)域縮小，紅髓與白髓區(qū)淋巴細(xì)胞顯著減少，紅髓淤血，大量含鐵血黃素沉著(圖2-D)。

肺：部分區(qū)域肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)增淤血，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)多少不等的紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及中性白細(xì)胞，并在部分血管與肺泡內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量桿狀細(xì)菌入侵(圖2-E)；另外，部分區(qū)域表現(xiàn)為肺萎陷(圖2-F)，肺泡明顯縮小，肺泡壁結(jié)締組織增生。

腎：腎小囊內(nèi)出現(xiàn)多少不等的蛋白滲出，腎小管腔內(nèi)有蛋白樣管型，腎小管上皮細(xì)胞廣泛性壞死，腎間血管內(nèi)見多量桿狀細(xì)菌，腎組織內(nèi)也見桿狀細(xì)菌入侵，并引起入侵部位組織壞死(圖2-G)。

骨骼肌(右肩部)：肌纖維肌漿凝固，肌橫紋與縱紋消失，肌纖維壞死，肌間隙大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2-H)，并在肌間隙見多量入侵的藍(lán)染細(xì)菌團(tuán)塊(圖2-I)。

淋巴結(jié)：淋巴結(jié)血管腔內(nèi)見多量桿狀細(xì)菌，淋巴竇內(nèi)多量滲出的漿液、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，同時(shí)有細(xì)菌的入侵(圖2-J)；皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞廣泛性壞死，同時(shí)有多量細(xì)菌入侵(圖2-K)。

腸：十二指腸、空?qǐng)?、回腸、結(jié)腸與直腸黏膜上皮脫落，腸腺上皮變性、壞死(圖2-L)。

圖2 死亡大熊貓病理組織損傷Fig.2 Histopathological lesions of the dead giant panda 注：A：心肌間隙內(nèi)細(xì)菌團(tuán)塊，肌纖維壞死；B：肝中央靜脈與肝血竇淤血；C：肝小葉內(nèi)細(xì)菌入侵，肝細(xì)胞顆粒變性；D：脾淤血，淋巴細(xì)胞減少，脾小梁增生；E：肺泡腔漿液滲出，細(xì)菌入侵，出血；F：肺萎陷；G：腎內(nèi)血管細(xì)菌入侵，腎小管上皮壞死；H：骨骼肌壞死，肌間隙大量中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；I：侵入骨骼肌的細(xì)菌團(tuán)塊；J：淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞壞死與細(xì)菌團(tuán)塊；K：侵入淋巴結(jié)的細(xì)菌；L：腸上皮壞死脫落，腸腺細(xì)胞變性、壞死 Note：A，bacterial mass in intermyocardial space，necrosis in myocardial fiber.B，congestion in hepatic central vein and hepatic sinus.C，bacterial invasion in hepatic lobules，granulosa degeneration in hepatic cells.D，congestion in spleen，lymphopenia and splenic trabecular hyperplasia.E，serous exudation，bacterial invasion，and hemorrhage in pulmonary alveoli.F，pulmonary collapse.G，bacterial invasion in renal blood vessels，necrosis in renal tubular epithelia.H，necrosis in skeletal muscle，massive neutrophil and macrophage infiltration in intermuscular space.I，bacterial mass in skeletal muscle.J，necrosis of lymphocytes and bacterial masses in lymph nodes.K，bacterial invasion in lymph nodes.L，necrosis and exfoliation of intestinal epithelia，degeneration and necrosis of intestinal gland

2.3 病原學(xué)檢查

2.3.1 細(xì)菌學(xué)檢查

2.3.1.1 細(xì)菌的分離與純化

從死亡大熊貓的肝、脾、心血、淋巴結(jié)與壞死肌肉等處取樣劃線接種于 TSA 與 BHI平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24—48 h，結(jié)果在平板上均出現(xiàn)2種菌落形態(tài)、色澤較為一致的優(yōu)勢(shì)菌。分別挑取單菌落在BHI平板進(jìn)行劃線，37 ℃恒溫 24 h，對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行純化，獲得純化優(yōu)勢(shì)菌2株(SM1與SM2)。SM1在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成較大的灰白色黏液菌落，以接種環(huán)挑之，易拉成絲，為G-、無(wú)芽孢、兩端鈍圓的桿菌；SM2在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成以接種部位為中心的厚薄交替的波紋狀菌苔，為G-，單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列的桿菌。

2.3.1.2 分離菌16S rDNA序列分析

提取純化細(xì)菌 DNA 為模板，擴(kuò)增出預(yù)期 1 500 bp 大小的DNA 片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) DNA 純化試劑盒純化后，送擎科梓熙(成都)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)得的 16S rDNA 序列在GenBank 中進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2分離菌16S rDNA 序列分別與肺炎克雷伯菌及奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)的16S rDNA 序列同源性最高，達(dá)99%以上。采用DNAStar軟件分別將2分離菌的16S rDNA序列與GenBank中同源性較高的16S rRNA序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示，在系統(tǒng)發(fā)育樹上分離株菌SM1與Klebsiellapneumoniae聚為一支；分離株菌SM2與Proteusmirabilis聚為一支。由此鑒定2分離菌分別為Klebsiellapneumoniae與Proteusmirabilis。

2.3.2 病毒學(xué)檢查

犬瘟熱病毒和輪狀病毒PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.3.3 寄生蟲學(xué)檢查

未見蜱、虱等體外寄生蟲；剖檢死亡大熊貓的腸道和臟器也均未見大量蛔蟲等內(nèi)寄生蟲。

3 討論

病理剖檢發(fā)現(xiàn)，死亡大熊貓身體具有明顯的外傷，進(jìn)一步的組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肩部骨骼肌、肝、腎、肺與淋巴結(jié)內(nèi)都發(fā)現(xiàn)大量細(xì)菌入侵，且這些組織與器官都發(fā)生明顯的變性、壞死與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致相應(yīng)器官功能障礙，尤其是心、肝、腎與肺損傷所致的多器官功能障礙應(yīng)該是該例大熊貓的死因。病毒學(xué)檢查犬瘟熱病毒和輪狀病毒均為陰性；寄生蟲學(xué)檢查腸道內(nèi)有少量蛔蟲，不足100條，不屬于致病原因[14]；細(xì)菌學(xué)檢查從死亡大熊貓肝、脾、心血、淋巴結(jié)及壞死肌肉等組織分離到細(xì)菌，表明死亡大熊貓發(fā)生了全身性感染。分離菌的16S rDNA序列分析表明，感染的細(xì)菌為肺炎克雷伯菌及奇異變形桿菌，這些細(xì)菌通過身體的外傷途徑入侵致菌血癥引起全身性感染是本例大熊貓死亡的病因。

菌血癥指血液中出現(xiàn)微生物，多是細(xì)菌由局部病灶入血引起全身性感染。據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌都有引起菌血癥的相關(guān)報(bào)道。Bleich等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌等機(jī)會(huì)性病原體會(huì)引起菌血癥導(dǎo)致全身性感染，病理觀察表現(xiàn)為全身性多組織器官損傷，并有大量細(xì)菌團(tuán)塊入侵。Wei等[16]建立了奇異變形桿菌機(jī)會(huì)性感染的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其感染能致小鼠全身性菌血癥。本次病例的病理學(xué)觀察結(jié)果與上述報(bào)道基本一致，表明肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌感染是本例大熊貓的組織器官損傷與致死的重要原因。

克雷伯菌(Klebsiellaspp.)是能引起多種動(dòng)物患病的條件性致病菌，國(guó)內(nèi)外先后從患病的馬、牛、豬、雞、鴨、麝鼠、珍珠雞等動(dòng)物體內(nèi)分離到該菌[17-18]。在大熊貓自鄔捷等[19]1988年首次從2例患出血性腸炎大熊貓?bào)w內(nèi)和糞便中分離出作為致病菌的肺炎克雷伯氏菌后，該菌對(duì)大熊貓的危害與相關(guān)研究受到了關(guān)注[7，20-21]。肺炎克雷伯菌對(duì)大熊貓的致病在臨床上分為腸炎型和敗血型兩種類型[17]，本病例表現(xiàn)為全身性感染，全身多組織器官變性與壞死，雖見腸黏膜上皮脫落，腸腺上皮變性、壞死，但未見明顯腸炎表現(xiàn)，因此，本病例屬于敗血型。

奇異變形桿菌廣泛分布于自然界、人與動(dòng)物體表，是一種較常見的條件致病菌。P.m.在人、動(dòng)物體內(nèi)或體表的適宜環(huán)境生長(zhǎng)并大量繁殖時(shí)，可誘發(fā)尿道炎、腎盂腎炎、中耳炎、菌血癥及急、慢性腹瀉、脊髓炎等多種疾病，嚴(yán)重時(shí)可致死[22]。2007年，王承東等[23]發(fā)現(xiàn)了一例雌性大熊貓生殖道感染奇異變形桿菌感染。奇異變形桿菌在大熊貓腸道較為常見，屬腸道內(nèi)的正常菌群，一般不會(huì)致病，只有在當(dāng)其定居部位改變、機(jī)體抵抗力降低或菌群失調(diào)時(shí)可致病[24]。本病例中大熊貓的脾臟明顯萎縮，淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少，表明其免疫力較為低下，可能是其易發(fā)生感染的重要原因。

對(duì)于本只大熊貓外傷形成的原因，根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果我們還不能做出較為確切的判定。Martinez等[25]的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在毗鄰野生動(dòng)物棲息地的農(nóng)村，家養(yǎng)犬只可能會(huì)攻擊野生動(dòng)物，導(dǎo)致野生動(dòng)物受傷，對(duì)野生動(dòng)物生存造成潛在威脅；Chaudhary等[26]也發(fā)現(xiàn)，保護(hù)區(qū)周圍的犬只不僅野生動(dòng)物生存構(gòu)成威脅，同時(shí)存在較高疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。由此可見，犬只對(duì)野生動(dòng)物的生存與保護(hù)有重要影響，不但會(huì)攻擊野生動(dòng)物，而且還可能會(huì)傳播疾病。盡管目前還未見犬只攻擊大熊貓的案例報(bào)道，但也要引起關(guān)注，加強(qiáng)保護(hù)區(qū)周邊犬只的管理。