尚婷婷， 閆 卉

糖尿病患者的高糖狀態(tài)是炎癥的促進(jìn)因素[1-2]。研究表明，高糖狀態(tài)下，單核巨噬細(xì)胞Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）2及 TLR4表達(dá)增高，蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）及核因子kappa B(NF-κB)表達(dá)升高，從而增加了白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α的表達(dá)，為高糖促進(jìn)炎癥發(fā)生的機(jī)制之一[3-4]。在系膜細(xì)胞中高糖能快速激活PKC，用PKC阻滯劑能有效抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生及NF-κB活化，并進(jìn)一步使活化后的NF-κB誘導(dǎo)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)減少[5-6]，這也說明PKC在高糖誘導(dǎo)的NF-κB活化中發(fā)揮了重要作用。近年來研究表明成纖維細(xì)胞在牙周組織免疫反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用[7-8]，是牙周炎癥中參與免疫炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞。本研究旨在探索小干擾RNA（siRNA）沉默PKC對高糖刺激成纖維細(xì)胞在Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)通路中TLRs及NF-κB表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑 第3～4代人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblasts,HGFs)購自上?？道噬锟萍加邢薰荆吞荄MEM培養(yǎng)基（含D-葡萄糖1 g/L）、高糖DMEM培養(yǎng)基（含D-葡萄糖4.5 g/L）及標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（FBS）均購自美國GIBCO公司，雙抗（青霉素 10 000 units/mL+ 鏈霉素10 000μg/mL）(10 000 U/mL)購 自 美 國HYCLONE，RNase-free 水（上海生工生物有限公司）、異丙醇（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）、DNA MARKER （天根生化科技有限公司），RNA提取試劑（TRIZOL）、PCR試劑盒及Realtime PCR試劑盒均購自美國INVITROGEN公司，siRNA-PKC（廣州銳博生物科技有限公司）、X-treme GENE HP轉(zhuǎn)染試劑（瑞士ROCHE公司）。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)序列與合成 設(shè)計(jì)并合成針對 HGFs PKC-α、PKC-β、PKC-δ mRNA 基 因沉默的3條特異性siRNA，詳見表1。

表1 特異性siRNA序列

1.2.2 轉(zhuǎn)染前優(yōu)化細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染前一天，接種HGFs于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×105個(gè)HGFs，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到50%～70%匯合度。12孔板每孔加入800 μL不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，采用化學(xué)合成的熒光標(biāo)記siRNA與X-treme GENE HP轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HGFs，將siRNA-ROCHE混合液分別以30、50、100 nmol/L設(shè)置轉(zhuǎn)染濃度梯度加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的培養(yǎng)板各孔中，各濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，輕輕混勻，另取3個(gè)孔作空白對照。分別以6、12、24、36、48、60、72 h設(shè)置時(shí)間曲線，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白，通過直接觀察轉(zhuǎn)染siRNA的紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)的百分比，可以確定不同時(shí)間及濃度的siRNA轉(zhuǎn)染效率，將轉(zhuǎn)染不同時(shí)間及濃度的siRNA轉(zhuǎn)染效率取3個(gè)視野統(tǒng)計(jì)結(jié)果后取平均值，以確定轉(zhuǎn)染效率最佳的轉(zhuǎn)染濃度和時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 高糖刺激下TLR2、TLR4mRNA水平的實(shí)驗(yàn)分組 (1)低糖對照組：細(xì)胞于含10% FBS低糖（含D-葡萄糖1 g/L）DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)（LG）24 h；(2)高糖刺激組：細(xì)胞于含10% FBS高糖（含D-葡萄糖4.5 g/L）DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)（HG）24 h。高糖刺激下real-time PCR，按照Invitrogenq PCR SuperMix-UDG ROX試劑盒使用說明方法檢測TLR2、TLR4的表達(dá)水平，確定何種受體發(fā)生改變后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。引物序列分別為：TLR2上游：5'-GCCAAAGTCTTGATGATTGG-3'， 下 游：5'-TTAAGTTCTCCAGCTCCTG-3'；TLR4上 游：5'-AGGATGAGGACTGGGTAAGGA-3'， 下 游：5'-CTGGATGAAGTGCTGGGACA-3'；

1.2.4 高糖刺激后檢測TLRs、NF-κB p50、NF-κB p65檢測表達(dá) (1)低糖對照組：細(xì)胞于含10% FBS低糖（含D-葡萄糖1 g/L）DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)（LG）24 h；細(xì)胞用Scramble siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后于含10% FBS低糖（含D-葡萄糖1 g/L）DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)（LG+Sc siRNA）24 h；(2)高糖對照組：細(xì)胞用Scramble siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后于含10% FBS高糖（含D-葡萄糖4.5 g/L）DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)（HG+Sc siRNA）24 h；(3)高糖實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞分別用特異性PKC-α siRNA、PKC-β siRNA、PKC-δ siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后在含10% FBS高糖（含D-葡萄糖4.5 g/L）DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)24 h。高糖刺激后realtime PCR，按照Invitrogenq PCR SuperMix-UDG ROX試劑盒使用說明方法檢測TLRs、NF-κB p50和NF-κB p65的表達(dá)情況，以低糖培養(yǎng)作對比。引物序列詳情見表2。

表2 NF-κB p50、NF-κB p65及內(nèi)參引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最佳轉(zhuǎn)染濃度及最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間 熒光標(biāo)記siRNA分別以30、50、100 nmol/L濃度瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HGFs，轉(zhuǎn)染后在倒置顯微鏡下觀察6 h時(shí)尚無紅色熒光影像，12 h時(shí)可觀察到點(diǎn)狀紅色熒光，24 h時(shí)各濃度組均可觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)清晰紅色熒光影像。自轉(zhuǎn)染開始，各組轉(zhuǎn)染效率逐漸升高，至轉(zhuǎn)染后48 h達(dá)到峰值，并且轉(zhuǎn)染效率隨著轉(zhuǎn)染濃度的增大而增大。30、50 nmol/L濃度轉(zhuǎn)染48～72 h時(shí)轉(zhuǎn)染效率變化不大，100 nmol/L濃度轉(zhuǎn)染60～72 h時(shí)熒光標(biāo)記減少且紅色熒光減弱。當(dāng)轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L時(shí)，其轉(zhuǎn)染后48 h轉(zhuǎn)染效率雖接近100%但少部分細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)變圓，因此選取50 nmol/L為最佳轉(zhuǎn)染濃度，48 h為最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間。（siRNA分別以30、50、100 nmol/L濃度瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HGFs6、12、24、36、48、60、72 h顯微鏡下影像及熒光影像觀察如圖1～圖32）（轉(zhuǎn)染效率結(jié)果見圖 33）。

圖1 100nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染6 h顯微鏡下影像（×100）

圖2 100nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染6 h熒光影像（×100）

圖3 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染12 h顯微鏡下影像（×100）

圖4 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染12 h熒光影像（×100）

圖5 30 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染24 h顯微鏡下影像（×100）

圖6 30 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染24 h熒光影像（×100）

圖7 50 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染24 h顯微鏡下影像 （×100）

圖8 50 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染24 h熒光影像（×100）

圖9 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染24 h顯微鏡下影像 （×100）

圖10 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染24 h熒光影像（×100）

圖11 30 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染36 h顯微鏡下影像（×100）

圖12 30 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染36 h熒光影像 （×100）

圖13 50 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染36 h顯微鏡下影像（×100）

圖14 50 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染36 h熒光影像（×100）

圖15 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染36 h顯微鏡下影像（×100）

圖16 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染36 h熒光影像 （×100）

圖17 30 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染48 h顯微鏡下影像 （×100）

圖18 30 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染48 h熒光影像（×100）

圖19 50 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染48 h顯微鏡下影像 （×100）

圖20 50 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染48 h熒光影像 （×100）

圖21 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染48 h顯微鏡下影像（×100）

圖22 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染48 h熒光影像 （×100）

圖23 30 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染60 h顯微鏡下影像（×100）

圖24 30 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染60 h熒光影像（×100）

圖25 50 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染60 h顯微鏡下影像（×100）

圖26 50 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染60 h熒光影像（×100）

圖27 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染60 h顯微鏡下影像（×100）

圖28 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染60 h熒光影像（×100）

圖29 50 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染72 h顯微鏡下影像（×100）

圖30 50 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染72 h熒光影像（×100）

圖31 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染72 h顯微鏡下影像（×100）

圖32 100 nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染72 h熒光影像（×100）

圖33 HGFs轉(zhuǎn)染后不同轉(zhuǎn)染濃度不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)染效率

2.2 高糖促進(jìn)HGFs中TLRs mRNA表達(dá) 高糖刺激后高糖刺激組(HG)與低糖對照組(LG)間TLR2的mRNA表達(dá)有差異，高糖刺激下TLR2的mRNA水平顯著升高（P＜0.05），但兩組間TLR4的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖 34。

圖34 高糖刺激組與低糖刺激組TLR2、TLR4的mRNA水平比較

2.3 HGFs 中 TLR2、TLR4、NF-κB p50、NF-κB p65 mRNA的表達(dá)水平比較 分別收集PKC-α、PKC-β、PKC-δ siRNA轉(zhuǎn)染后48 h的各組細(xì)胞，提取RNA反轉(zhuǎn)錄后，采用real-time PCR檢測目的基因TLR2、NF-κB p50、NF-κB p65 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示高糖對照中TLR2、NF-κB p65mRNA水平顯著升高；而PKC-α和PKC-δ siRNA 對 TLR2、NF-κB p65基 因 的 表達(dá)有抑制作用（P<0.05），其抑制后高糖刺激下TLR2、NF-κB p65的mRNA水平并無顯著升高。NF-κB p50在高糖刺激中無改變，見圖35。

圖35 轉(zhuǎn)染PKC不同位點(diǎn)的siRNA后高糖刺激下HGF細(xì)胞中TLR2、NF-κB p50、NF-κB p65表達(dá)

3 討論

TLRs是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，Devaraj等[9]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高糖狀態(tài)下單核細(xì)胞中TLR2及TLR4表達(dá)增高，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化，引起免疫應(yīng)答[10-11]。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在內(nèi)皮細(xì)胞中，血糖濃度的波動(dòng)變化能最大程度地上調(diào)TLR4而非TLR2的表達(dá)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與低糖對照相比，高糖刺激下HGFs中TLR2的mRNA表達(dá)顯著升高，而TLR4的mRNA表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高糖刺激下不同類型的細(xì)胞可表達(dá)不同的TLR，參與高糖刺激引起的炎癥反應(yīng)。

研究表明，高糖刺激下單核細(xì)胞中PKC調(diào)節(jié)TLR2 及TLR4的表達(dá)，PKC-α siRNA可下調(diào)TLR2的表達(dá)，而PKC-δ siRNA則下調(diào)TLR4的表達(dá)[14]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成的靶向PKC-α、PKC-δ基因的siRNA均能在一定程度上抑制HGFs中 TLR2、NF-κB p65的表達(dá)，而 PKC-β基因的siRNA則沒有抑制作用，表明在HGFs中PKC-α、PKC-δ參與了TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路，而PKC-β可能不參與TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路，這與巨噬細(xì)胞中PKC-β不參與高糖刺激炎癥傳導(dǎo)通路結(jié)果相一致[15]，說明在不同類型的細(xì)胞中PKC不同亞單位對下游基因的調(diào)節(jié)作用有所不同。

NF-κB是由一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)家族組成，主要發(fā)揮作用的是p50/p65異源二聚體[16]。在高糖培養(yǎng)的鼠系膜細(xì)胞中，Kumar等[15]研究發(fā)現(xiàn)激活的PKC從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，與此同時(shí)，NF-κB p65蛋白也從胞質(zhì)進(jìn)入胞核而被活化，說明PKC的激活能誘導(dǎo)NF-κB p65蛋白的優(yōu)先活化。本實(shí)驗(yàn)中HGFs高糖刺激下NF-κB p65升高，而NF-κB p50則無明顯變化，與上述研究結(jié)果相符，由此推測在高糖環(huán)境下HGFs中PKC通過調(diào)節(jié)NF-κB p65起作用。

HGFs中高糖刺激下TLR2的mRNA表達(dá)顯著升高，同時(shí)NF-κB p65也伴隨升高，而TLR4、NF-κB p50的mRNA表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在高糖刺激下炎癥是通過TLR2調(diào)節(jié)其下游的NF-κB p65表達(dá)。PKC-α siRNA、PKC-δ siRNA可下調(diào)HGF細(xì)胞中TLR2、NF-κB p65的表達(dá)，提示在TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路中PKC-α、PKC-δ基因位于TLR2、NF-κB p65的上游。

綜上分析，TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路上下游位置關(guān)系為：PKC-α、δ-TLR2- NF-κB65。提示在HGFs中，可通過抑制PKC-α、PKC-δ的活性而下調(diào)其下游炎癥因子的表達(dá)，從而抑制牙周炎癥的相關(guān)反應(yīng)。該研究為闡明高糖環(huán)境下PKC不同亞型在HGFs中TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用機(jī)制提供依據(jù)，并為糖尿病牙周炎患者的預(yù)防和治療提供新的思路和治療靶點(diǎn)。