王 東， 梅婷婷， 楊關根， 裘建明， 傅 超， 邵書先， 袁玥旻， 肖石梅

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種有終生復發(fā)傾向的腸道慢性非特異性炎癥疾病，其病因十分復雜，發(fā)病機制尚不明確，多數(shù)學者認為其是一種自身免疫相關性疾病[1-2]。由于UC反復發(fā)作，病情嚴重程度不等，近年來已成為危害人們身體健康的主要腸道疾病之一[3-4]。淫羊藿作為我國傳統(tǒng)中草藥，研究顯示其具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌免疫、促進代謝、抗氧化、延緩衰老等功能，特別是其免疫調(diào)節(jié)作用近年來成為研究的熱點。本研究采用大鼠UC模型，通過多項指標觀察淫羊藿對UC的治療效果，并探討其治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性成年SD大鼠（體質量180～210 g）84只，在屏障環(huán)境下飼養(yǎng)和實驗，實驗室使用許可證編號：SYXK（蘇）2016-0014，動物合格證號：NO201801110023。動物飼養(yǎng)用飼料為鈷60輻射滅菌過的大小鼠專用顆粒飼料（江蘇省協(xié)同生物科技有限公司）。適應性喂養(yǎng)1周，恒溫（23±2）℃，恒濕（50±10）%，晝夜循環(huán)。

1.2 主要試劑和儀器 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）、DAB及二甲苯購自國藥集團；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；實驗所用免疫組化切片機、病理組織烘漂儀、脫水機及包埋機（BMJ-B 型）均購自常州中威電子儀器；光學顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社。

1.3 藥物及提取方法 遼寧朝鮮淫羊藿飲片由杭州市第三人民醫(yī)院藥劑科提供，取生淫羊藿飲片2000 g，加入8倍量的水，提取2次，每次1 h，過濾、常壓濃縮至100 mL，相當于生藥濃度為20 g/mL，用蒸餾水倍比稀釋至10 g/mL，5 g/mL；柳氮磺吡啶（SASP）腸溶片購自上海信誼天平藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.25g/片，生產(chǎn)批號09170907，有效期為20190904。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠潰瘍性結腸炎模型建立及分組 實驗動物適應性飼養(yǎng)1周后，禁食、不禁水24 h，稱重。隨機分為空白對照組、模型組、淫羊藿高、中、低劑量組、柳氮磺吡啶（SASP）組及聯(lián)合治療組，每組12只。

除空白對照組外，其余各組均采用TNBS法進行造模，具體方法為：動物麻醉后，將橡膠管(直徑2 mm、長15 cm)緩緩插入大鼠肛門8 cm，將抽取好的TNBS液(原液與50%無水乙醇1:1混合)注入，注入體積為0.8 mL，使藥液緩慢進入腸道，將大鼠提尾倒置30 s，共造模72只。待清醒后自由飲食，自由進水。觀察各組大鼠大便、精神狀態(tài)及皮毛等變化。造模后第7天開始灌胃給藥，連續(xù)7天。分組和給藥方案見表1。

表1 7組大鼠的試驗藥物及給藥方案

1.4.2 實驗指標及檢測方法 （1）動物狀態(tài)觀察：定期觀察記錄動物狀態(tài)（大便、精神狀態(tài)及皮毛等）。（2）體重稱量：給藥開始每天給實驗大鼠稱重1次并記錄，如給藥中途動物體重下降超過20%，停止給藥。（3）疾病活動指數(shù)（DAI）評估[5]：自實驗處理后每日觀察并記錄大鼠的精神狀態(tài)、運動、進食情況、毛發(fā)數(shù)量、密度以及光澤情況，記錄大鼠DAI=體質量變化+便血程度+大便黏度，評分標準包括體質量下降（＜1為0分，1%～5%為1分，5%～10%為2分，10%～15%為3分，≥15%為4分）、大便黏度（正常為0分，松散大便為2分，腹瀉為4分）和大便出血（正常為0分，隱血陽性為2分，顯性出血為4分）。（4）結腸大體損傷評分：實驗結束后記錄結腸中潰瘍面積、結腸重量與長度比值、結腸損傷程度（結腸外觀正常為0分；結腸沒有出現(xiàn)紅斑但無潰瘍?yōu)?分；炎癥及潰瘍?yōu)?分；嚴重的潰瘍但未出現(xiàn)壞疽為3分）。（5）病理損傷評分：將結腸組織石蠟切片行HE染色，按照Geboes等的標準，于光學顯微鏡下觀察結腸組織病理學變化并進行病理損傷評分，根據(jù)急性炎細胞、慢性炎細胞和嗜酸粒細胞在結腸組織的浸潤程度依次設為0、1、2、3分；根據(jù)隱窩破壞程度、糜爛程度的不同設為0、1、2、3分；根據(jù)水腫程度、潰瘍侵及程度設為0、1、2、3、4分。（6）免疫組化法檢測結腸組織中腫瘤壞死因子（TNF）-α、γ干擾素（IFN-γ）及白細胞介素（IL）-6表達水平：將組織放入包埋框中央，將石蠟倒入包埋框中，凝固后便可切片；將組織切片放入烘箱中燒烤20 min，將組織置于二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min，無水乙醇5 min，95%乙醇5 min，75%乙醇5 min，去離子水浸泡3次，每次1 min；將切片置于檸檬酸緩沖液中，高壓熱修復10 min；滴加適量內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10～15 min；將一抗稀釋后滴在組織切片上，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次每次5 min，將稀釋好的二抗滴在組織切片上，室溫孵育2 h；滴加適量配置好的DAB顯色劑，室溫2～5 min，自來水沖洗；蘇木精復染10～30 s，自來水沖洗；滴加中性樹膠封固后拍照。使用ImageJ軟件對各組所拍照圖片的灰度值進行分析定量測算。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用表示，多組比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較，若方差齊性用LSD-t法，方差不齊用Dunnett T3法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠試驗期間體質量變化 實驗第4天開始，各實驗組大鼠與模型組比較體質量增加，實驗第7天聯(lián)合組大鼠較SASP組體質量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠實驗期間平均體質量變化

2.2 各組大鼠DAI評分 大鼠精神狀態(tài)改善，大便逐漸成形，進食增多，皮毛逐漸有光澤，應用淫羊藿及SASP后大鼠精神狀態(tài)改善，DAI評分降低。第5天開始，各實驗組DAI評分差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 各實驗組大鼠DAI評分

2.3 各組大鼠結腸黏膜損傷評分 與模型組比較，聯(lián)合組的結腸潰瘍面積顯著減小，結腸重量與長度比減小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，淫羊藿高、中、低劑量組及聯(lián)合組的結腸損傷程度減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。聯(lián)合組的結腸潰瘍面積小于SASP組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠結腸黏膜損傷評分比較

2.4 各組結腸組織病理學評分及腸組織TNF-α、IFN-γ和IL-6表達情況：淫羊藿組高劑量組評分顯著低于模型組（P＜0.05），見表5。免疫組化檢測顯示聯(lián)合組TNF-α、IFN-γ和IL-6表達水平與模型組及SASP組比較降低（見圖1）；對各組TNF-α、IFN-γ和IL-6免疫組化表達情況（灰度值）使用Image J軟件進行量化，結果顯示聯(lián)合組及SASP組與模型組比較顯著降低（P＜0.01），聯(lián)合組較SASP組顯著降低（P＜0.01），見表5。

3 討論

潰瘍性結腸炎是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，大多累及直腸與結腸黏膜及黏膜下層，表現(xiàn)為反復發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便、體重減輕、結腸縮短等[6]，治愈難度大，嚴重影響患者生活質量。UC的病因及發(fā)病機制尚不明確，治療上盡管目前有很多新型藥物投入使用，但大多治療后僅臨床癥狀緩解，仍需長期服用藥物控制癥狀，尚缺乏特效藥物，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[7]。目前廣泛的認知認為潰瘍性結腸炎屬于自身免疫相關性疾病，與腸道菌群的失調(diào)、腸道自身免疫系統(tǒng)的失衡，飲食結構的不合理、相關遺傳敏感性、精神心理等多種因素相關聯(lián)。

潰瘍性結腸炎按照其臨床表現(xiàn)，可歸于我國傳統(tǒng)醫(yī)學“腸澼”“腸風”“泄瀉”等范疇。認為該病的發(fā)生歸咎于先天腎氣虧虛，加之后天脾胃虛損，后因外感邪氣，飲食不潔，情志異常導致。認為本病的主要病機為脾腎虧虛，胃腸積滯為標，瘀血貫穿本病始末，治療上應以建補脾腎為主，輔以祛瘀導滯。淫羊藿作為中國傳統(tǒng)的中草藥，具有溫腎壯陽，強筋骨，御風濕等功效，其主要有效成分是淫羊藿多糖（EPS）、淫羊藿苷（ICA）、淫羊藿總黃酮（TFE）?，F(xiàn)代藥理研究已經(jīng)證實淫羊藿有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[8-12]。淫羊藿苷作為提取物，現(xiàn)廣泛應用于臨床上增強免疫力，抗疲勞，增加精子活力等方面。相關研究顯示淫羊藿苷可提高環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，可恢復受環(huán)磷酰胺損傷的胸腺結構；同時對巨噬細胞吞噬功能有明顯增強效應，并且效應呈劑量依賴性關系，其機制可能與淫羊藿苷在mRNA水平通過抑制NF-κB與iNOS mRNA、TNF-α mRNA基因增強子的結合而減少TNF-α和NO量的過度表達來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[13]。

表5 各組病理學評分及TNF-α、IFN-γ、IL-6表達水平比較

圖1 各組結腸組織中TNF-α、IFN-γ和IL-6的免疫組化表達（100×）

鑒于淫羊藿的免疫調(diào)節(jié)作用，而潰瘍性結腸炎作為自身免疫相關性疾病，本研究以此為切入點研究淫羊藿對潰瘍性結腸炎是否有免疫調(diào)控作用，嘗試為潰瘍性結腸炎的臨床及科研提供新的思路。在7天的各組實驗處理監(jiān)測體質量及大鼠一般情況監(jiān)測之后，顯示大鼠短期內(nèi)無明顯不良異常反應，且各組在體重監(jiān)測上差別無統(tǒng)計學意義。潰瘍性結腸炎的TNBS可引起結腸黏膜呈慢性炎癥變化，與人類UC相似，因其造模操作簡單，經(jīng)濟實用、造模時間短、重復性好等特點[7]，本研究選用TNBS誘導UC模型進行研究，以評價淫羊藿對UC的療效。TNBS造模后大鼠出現(xiàn)精神沉郁，活動減少，大便稀軟，體重下降等癥狀，再對隨機選取4例大鼠，將病變結腸剪取后發(fā)現(xiàn)其結腸黏膜縮短，病理切片顯示隱窩膿腫形成，符合潰瘍性結腸炎的診斷標準。實驗處理我們選用淫羊藿高、中、低劑量組，希望更能反映出其量效關系。作為潰瘍性結腸炎的臨床一線用藥，SASP對潰瘍性結腸炎大鼠的治療作用明顯，但本次動物實驗顯示，相比SASP，淫羊藿聯(lián)合SASP治療潰瘍性結腸炎療效更佳。淫羊藿聯(lián)合SASP治療大鼠UC對緩解結腸損傷程度、降低DAI評分、改善大鼠精神狀況療效更顯著。在對各實驗組潰瘍性結腸炎微觀病理學檢測方面，同時顯示淫羊藿聯(lián)合SASP治療組的微觀病理緩解更為明顯。本實驗同時對各實驗組的相關炎癥介質進行的檢測，嘗試推測淫羊藿對潰瘍性結腸炎作用療效的相關作用機制，顯示在TNF-α、IFN-γ和IL-6表達水平上，聯(lián)合治療組均較其他組有明顯優(yōu)勢。本實驗大部分是從臨床癥狀及病理學上顯示淫羊藿對潰瘍性結腸炎大鼠有一定的療效，但其療效的機制尚不明確。

綜上所述，淫羊藿可減輕TBNS誘導的大鼠UC 結腸黏膜炎癥損傷、改善大鼠精神狀態(tài)、降低DAI評分、緩解潰瘍性結腸炎的病理損傷，且與緩解TNF-α、IFN-γ和IL-6細胞因子異常變化有關，但其能否作為治療潰瘍性結腸炎的藥物及其更深層次的作用機理尚需進一步的研究。