錢程 高涵 苗宇 贠娜娜 張娜 李顯超

摘 要：本文以黃瓜枯萎病菌為指示菌株，制備本芹種子乙醇粗提取液，采用柱層析法對本芹種子乙醇粗提取液進(jìn)行層析分離，每次分離均得到8個流分，用不同流分與黃瓜枯萎病菌進(jìn)行離體培養(yǎng)，從中篩選抑制病菌菌落生長最強(qiáng)的流分，用以研究本芹種子乙醇層析物的抑菌作用。結(jié)果表明，本芹種子乙醇層析物不同流分對黃瓜枯萎病菌均有不同程度的抑制作用。經(jīng)過三次柱層析分離之后，最終篩選出流分ZY-6-5-4、ZY-6-5-5、ZY-6-6-6和ZY-6-6-7其群落擴(kuò)展速度在96-144h時間小于其他流分，抑制作用最大，且與空白對照差異顯著（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：黃瓜枯萎病;乙醇粗提物;抑制作用;本芹

中圖分類號：S633.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? 文章編號：1673-260X（2020）09-0027-04

1 引言

黃瓜枯萎?。–ucumber Fusarium Wilt）[1]，也經(jīng)常被稱為萎蔫病、蔓割病，可經(jīng)過土壤、種子、肥料、昆蟲、農(nóng)具等途徑傳播傳染，也可借助雨水或者灌溉水遠(yuǎn)距離傳播傳染。根據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，每年由于黃瓜枯萎病引起病害可達(dá)20%，最嚴(yán)重時可高達(dá)90%，使黃瓜大量減產(chǎn)，甚至嚴(yán)重到絕收。迄今為止，黃瓜枯萎病已經(jīng)成為導(dǎo)致黃瓜減產(chǎn)絕收的病害之一[2，3]。為了保證黃瓜的生產(chǎn)質(zhì)量及生長品質(zhì)，現(xiàn)研究利用植物的化感作用[4]來防治黃瓜枯萎病是一個新的綠色防控技術(shù)。

化感作用（Allelopathy）屬于植物生態(tài)學(xué)的分支科學(xué)—生態(tài)生化學(xué)（Ecological Biochemistry）研究內(nèi)容的一部分。是指植物通過淋溶、揮發(fā)、分泌和分解等方式向環(huán)境釋放化學(xué)物質(zhì)為對該種植物或者植物周圍（包括微生物）所產(chǎn)生的直接或間接的促進(jìn)或者抑制作用的一種化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象[5]，也被稱為他感、相生相克、異株克生。

化感物質(zhì)是化感作用重要物質(zhì)支撐基礎(chǔ)，占據(jù)化感作用中心位置?；形镔|(zhì)是植物或自身發(fā)育生長所產(chǎn)生和釋放的次生代謝物質(zhì)，主要有酚類、萜類、生物堿等。其主要來源為根系分泌物、莖和葉的淋溶物、植物殘?bào)w分解物等[6]。根據(jù)植物自身分泌化感物質(zhì)的特性，并且利用化感作用防治病害操作方便、簡單、有效[7]，同時對植物的生長環(huán)境不會產(chǎn)生污染。因此，利用植物化感物質(zhì)的抑制作用來防治病害成為比較受歡迎的手段之一。課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本芹種子乙醇粗提物能夠抑制黃瓜枯萎病生長，但是粗提物里面的抑菌成分非常復(fù)雜，有必要對其進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化，基于此，開展了本芹種子乙醇層析物不同流分抑菌作用的試驗(yàn)研究。

2 材料與方法

2.1 材料與菌種

2.1.1 試驗(yàn)材料 本芹種子

2.1.2 供試菌種 黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.sp.cucumerinum），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）

2.1.3 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，水1000mL，自然pH）。

2.2 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（HWS-250B），高壓滅菌鍋（YXQ-LS-75SⅡ），超凈工作臺（VS-1300L-U）

2.3 本芹種子層析物抑菌作用試驗(yàn)

2.3.1 本芹種子粗提物的制備

稱取新鮮的干凈的本芹種子10g，放置于三角瓶中，倒入50ml乙醇。將三角瓶置于搖床震蕩24h（25℃，140r·min-1）。震蕩24h后，取出放置于超凈工作臺。首先用濾紙將多余的本芹種子從浸泡液中濾出，留取液體;然后用0.45μm細(xì)菌過濾器再次過濾以便除去細(xì)菌，之后得到濃度為200mg·mL-1本芹種子乙醇粗提液。

2.3.2 菌種活化

將黃瓜枯萎病菌接種于PDA培養(yǎng)基，倒平板后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，120h后取出待用。

2.3.3 色譜柱制備

采用硅膠作為色譜柱的填料。稱量15g硅膠置于燒杯之中，加入適量乙醇（濃度為20%），用玻璃棒進(jìn)行攪拌，直至硅膠變得粘稠，沒有塊狀為止。將攪拌后的硅膠倒入色譜柱內(nèi)，用膠頭滴管吸取乙醇，以手腕旋轉(zhuǎn)的方式對掛在色譜柱壁的硅膠進(jìn)行沖刷，打開色譜柱底部的活塞，使多余的乙醇流出，待乙醇液面距硅膠1cm時，關(guān)閉活塞。注意對樣品進(jìn)行前處理，盡可能除去雜質(zhì)避免制備色譜柱子被污染。

2.3.4 柱層析法分離

用10ml量筒每次量取10ml提取液依次倒入制備好的色譜柱，然后打開底部活塞，對所流下的液體進(jìn)行收集，每5ml為一個流分，為保持色譜柱內(nèi)液體頁面高于硅膠1cm，在粗提液面下降到距硅膠1cm時，用膠頭滴管吸取乙醇以手腕旋轉(zhuǎn)的方式沿著色譜柱內(nèi)壁加入乙醇，以保持液面高度。共收集8個流分。注意當(dāng)每個色譜柱分成8個流分后，就要重新取10ml的提取液，重新制備色譜柱。

2.3.5 室內(nèi)抑菌作用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路

將第一次層析后獲得的8個流分，記為ZY-1～8（ZY表示本芹種子乙醇提取物），與黃瓜枯萎病菌共培養(yǎng)144h后，記錄各組處理的菌落直徑，從中選取抑制效果最好的一組，用該組添加的流分再進(jìn)行第二次層析，分別收集8個流分，重復(fù)上述培養(yǎng)和計(jì)數(shù)過程，再篩選兩個抑制效果最好的流分，并進(jìn)行第三次層析分離;培養(yǎng)后記錄菌落直徑，最終得到4個抑制效果最佳的流分。

2.3.6 室內(nèi)抑菌作用實(shí)驗(yàn)操作程序

第一步 配置培養(yǎng)基：配置PDA培養(yǎng)基

第二步 高壓滅菌

第三步 稀釋流分 將之前所獲得的八個流分稀釋四倍，濃度為200mg·mL-1，待用。

第四步 制備平板 將高溫滅菌的試驗(yàn)物品及稀釋的八個流分置于超凈工作臺中。將稀釋的流分分別三次通過細(xì)菌濾器，注意保證最后有10ml的提取液。依次將其倒入80ml三角瓶中，并取滅過菌好的培養(yǎng)基倒入含有不同粗提液的三角瓶中，定容至80ml，搖勻，平均分倒入四個培養(yǎng)皿（d=9cm）中，讓每個培養(yǎng)皿中含有2ml粗提物，18ml培養(yǎng)基。對照組為20%的乙醇，記為乙醇CK，和空白對照，培養(yǎng)基中不添加任何物質(zhì)，記為白板。每個處理重復(fù)四次。

第五步 接種培養(yǎng) 待培養(yǎng)基冷卻凝固，進(jìn)行接菌。用直徑為0.6cm的打孔器對供試菌種打取菌塊，取菌塊，用接菌環(huán)將菌塊置于培養(yǎng)皿正中間位置，注意菌絲一面朝下，放置于培養(yǎng)箱（25℃）倒置培養(yǎng)。每組四次重復(fù)。

第六步 記錄數(shù)據(jù) 生長48h后開始觀察，用游標(biāo)卡尺以十字交叉法測量菌落直徑，并做好記錄。

第七步 數(shù)據(jù)分析 參照下述計(jì)算公式，計(jì)算不同流分處理的抑制率。

菌落直徑（cm）：測量菌落直徑平均值0.6

抑制率（%）：（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 本芹種子一次乙醇層析物不同流分對黃瓜枯萎病菌的抑制作用

采用硅膠柱層析方法對本芹種子的乙醇層析物流分進(jìn)行分離，總共得到8個流分，以黃瓜枯萎病菌為供試菌，分別測定了8個柱層析流分在48-144h的抑菌作用情況，8個流分處理的菌落生長情況均比對照組的菌落直徑小。進(jìn)而說明本芹種子一次乙醇層析物中含有對黃瓜枯萎病菌起抑制作用的化感物質(zhì)。不同流分的抑菌作用情況不同，其中第6號流分（編號標(biāo)記為ZY-6）在96-144h下菌落生長速度最慢，表現(xiàn)為抑制作用最大，且與對照組乙醇CK和空白對照差異顯著（P<0.05）。如圖1。

3.2 本芹種子二次乙醇層析物不同流分對黃瓜枯萎病菌的抑制作用

根據(jù)第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行本芹種子第二次乙醇層析物不同流分對黃瓜枯萎病菌的抑制作用實(shí)驗(yàn)。對第一次實(shí)驗(yàn)選取的第6號流分（編號標(biāo)記為ZY-6）通過硅膠柱層析，分離提純出8個流分，分別標(biāo)記為ZY-6-1～8，進(jìn)行抑菌作用實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，不同流分的抑菌作用情況不同，其中流分ZY-6-5和流分ZY-6-6對供試病菌的抑制率大于其他處理，表現(xiàn)為菌落生長較其他流分慢。流分ZY-6-5、流分ZY-6-6在96-144h時間下，菌落直徑與對照組乙醇CK和空白對照差異顯著（P<0.05）。如圖2。

3.3 本芹種子三次乙醇層析物不同流分對黃瓜枯萎病菌的抑制作用

根據(jù)第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行本芹種子第三次乙醇層析物不同流分對黃瓜枯萎病菌的抑制作用實(shí)驗(yàn)。對第二次實(shí)驗(yàn)選取的流分ZY-6-5通過硅膠柱層析，分離提純出8個流分，分別標(biāo)記為ZY-6-5-1～8，進(jìn)行抑菌作用實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，不同流分的抑菌作用情況不同，其中流分ZY-6-5-4和流分ZY-6-5-5對供試病菌的抑制率大于其他處理，表現(xiàn)為菌落生長較其他流分為慢。流分ZY-6-5-4、流分ZY-6-5-5在96-144h作用下，其菌落直徑均與空白對照差異顯著（P<0.05）。如圖3。

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行本芹種子第四次乙醇層析物不同流分對黃瓜枯萎病菌的抑制作用實(shí)驗(yàn)，對第二次實(shí)驗(yàn)選取的流分ZY-6-6通過硅膠柱層析分離提純出8個流分，分別標(biāo)記為ZY-6-6-1～8，進(jìn)行抑菌作用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，不同流分的抑菌作用情況不同，其中流分ZY-6-6-6、流分ZY-6-6-7對供試病菌的抑制率大于其他處理，表現(xiàn)為菌落生長速度較其他流分為慢。流分ZY-6-6-6、流分ZY-6-6-7在96-144h作用下，均與空白對照差異顯著（P<0.05）。如圖4.

4 討論與結(jié)論

芹菜（Apium graveolens L.）屬傘形科一年生或二年生草本植物，又名藥芹或旱芹[8]。在中國被廣泛栽培，其嫩葉、葉柄可以食用，芹菜籽可藥用。此外，芹菜因其具有特殊氣味，可用來趨避和防治農(nóng)業(yè)害蟲。西芹粗提物防治黃瓜枯萎病[9]、旱芹粗提物防治棉花枯萎病[10]已被先后報(bào)道。韓燕[11]研究證實(shí)西芹根水浸提液對黃瓜枯萎病菌具有低促高抑現(xiàn)象。宋文超[12]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，西芹鮮根丙酮、乙醇和蒸餾水粗提物可使黃瓜枯萎病菌菌絲生長受到抑制，病菌孢子數(shù)量分泌減少，從而揭示了化感作用機(jī)理。賈俊英[13]則對西芹種子粗提物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，西芹三種粗提物對黃瓜枯萎病菌的抑制作用隨著濃度增大而增強(qiáng)。高曉敏[14]對西芹乙醇粗提物進(jìn)行四次柱層析，結(jié)果表明，第四次層析最佳流分抑制黃瓜枯萎病菌菌落生長及分泌鐮刀菌酸能力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本芹乙醇粗提物經(jīng)過三次柱層析分離后，所得最佳流分亦能夠抑制黃瓜枯萎病菌菌落生長。這與高曉敏的結(jié)論一致。分析原因可能為本芹和西芹都屬傘形科芹菜屬，二者理應(yīng)含有一些相同的成分，而這些成分正是起到了抑制真菌菌落生長的作用。但本芹中抑制黃瓜枯萎病菌的物質(zhì)究竟是什么，目前未知，有待于開展更為復(fù)雜、更為精細(xì)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

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