梁 冰 紀(jì) 雪 祝令偉 王鐵成 劉 軍 郭學(xué)軍 孫 洋

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春，130122)

保護(hù)和拯救野生動(dòng)物在全球備受關(guān)注，我國(guó)也在逐年加大對(duì)野生動(dòng)物的保護(hù)力度。2016年11月，在全國(guó)人大常委會(huì)上制定了國(guó)家公園試點(diǎn)總體方案，計(jì)劃建立“青海三江源國(guó)家公園”和“東北虎豹國(guó)家公園”。2017年在長(zhǎng)春正式成立了東北虎豹國(guó)家公園國(guó)有自然資源資產(chǎn)管理局、東北虎豹國(guó)家公園管理局。我國(guó)野生東北虎(Pantheratigrisaltaica)、東北豹(Pantherapardusorientalis)種群跨越吉林、黑龍江兩省，涉及兩個(gè)省份的多個(gè)林業(yè)局，主要以吉林省為主。大腸埃希菌(Escherichiacoli)是動(dòng)物和人的腸道中常見(jiàn)的條件致病菌，可引起多種疾病，在自然生態(tài)中亦扮演著重要角色[1]。在我國(guó)，針對(duì)不同動(dòng)物來(lái)源的大腸埃希菌研究有很多，但對(duì)于野生動(dòng)物源大腸埃希菌的研究卻相對(duì)缺乏，有限的報(bào)道也是針對(duì)人工飼養(yǎng)繁育的野生動(dòng)物。本研究為了解東北虎豹國(guó)家公園野生動(dòng)物大腸埃希菌毒力及耐藥特征，采集吉林省6個(gè)林業(yè)局管轄區(qū)內(nèi)的東北虎等野生動(dòng)物的糞便樣品，進(jìn)行大腸埃希菌的分離與鑒定，獲得野生動(dòng)物攜帶大腸埃希菌的本底數(shù)據(jù)，監(jiān)測(cè)致病性及耐藥性大腸埃希菌在野生動(dòng)物腸道內(nèi)的流行情況，為闡明野生動(dòng)物病原菌耐藥傳播規(guī)律提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 樣品來(lái)源

2016年從東北虎豹國(guó)家公園轄區(qū)內(nèi)琿春、天橋嶺、黃泥河、汪清等地，采集東北虎、東北豹、野豬(Susscrofa)、馬鹿(Cervuselaphus)、西伯利亞狍(Capreoluspygargus)、梅花鹿(Cervusnippon)、東北兔(Lepusmandshuricus)和花尾榛雞(Tetrastesbonasia)等野生動(dòng)物的糞便樣品共234份。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

麥康凱瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物公司；E-test試紙條購(gòu)自O(shè)XOID公司；2×TaqMasterMix試劑包購(gòu)自康為世紀(jì)公司；Premix ExTaqVersion 2.0 plus dye和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖購(gòu)自Genview公司。使用引物見(jiàn)表1，由吉林庫(kù)美生物科技有限公司合成。

表1 本研究所用PCR引物

續(xù)表1

1.3 主要儀器

全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)(BD PhoenixTM-100)、比濁儀(Phoenix SpecTM)為美國(guó)BD公司生產(chǎn)。生物安全柜(1300A2)為美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)，PCR擴(kuò)增儀(ETC-811)為北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn)，生化培養(yǎng)箱(LRH-70)為上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 大腸埃希菌的分離

稱取每份糞便樣品5 g，加入2 mL無(wú)菌生理鹽水，室溫振蕩10 min，靜止2 min，上清為菌懸液。吸取20 μL糞便生理鹽水菌懸液于麥康凱瓊脂平板，半板涂布半板劃線，(36±1) ℃培養(yǎng)16—18 h，觀察菌落形態(tài)，挑取疑似單菌落于麥康凱瓊脂平板二次分離純化。

2.2 模板制備

分離株接種于腦心培養(yǎng)液中，(36±1) ℃振蕩培養(yǎng)16—18 h。吸取400 μL培養(yǎng)液，12 000 r/min離心1 min，棄上清，菌體沉淀用100 μL無(wú)菌去離子水重懸，95 ℃加熱7 min，室溫冷卻后12 000 r/min離心1 min，取上清液作為PCR檢測(cè)的DNA模板。

2.3 大腸埃希菌鑒定

參考文獻(xiàn)[2]合成大腸埃希菌特異性16S rDNA引物(表1)。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 預(yù)混酶12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。PCR陽(yáng)性大腸埃希菌分離株于BD PhoenixTM-100全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定和藥敏檢測(cè)。

2.4 最小抑菌濃度(MIC)檢測(cè)

挑取大腸埃希菌的單菌落接種于2 mL MH肉湯培養(yǎng)液中，(36±1) ℃培養(yǎng)16—18 h，將增菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷岫葌溆?。蘸?.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木涸贛H平板上均勻涂布。將四環(huán)素E-test試紙條放置于MH平板中央，(36±1) ℃培養(yǎng)16—18 h，參考CLSI標(biāo)準(zhǔn)(2018版)判定最小抑菌濃度MIC(minimal inhibitory concentration)。

2.5 四環(huán)素耐藥基因檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[3-4]合成tetA、tetB、tetC、tetD、tetW和tetM6種耐藥基因引物(表1)。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix預(yù)混酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.6 Eric-PCR指紋圖譜鑒定

參考文獻(xiàn)[5]合成引物ERIC-1(5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′)和 ERIC-2(5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′)。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix預(yù)混酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火80 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。

2.7 大腸埃希菌系統(tǒng)進(jìn)化分群分析

參考文獻(xiàn)[6]合成ChuA、YjaA和TspE4.C23對(duì)引物(表1)。多重PCR反應(yīng)體系；Mix1 0.125 μL，Mix2 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。

2.8 大腸埃希菌毒力基因檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[7]合成F41、LT、EAST1、Stx1、Stx2、eae、F6、F4、F5、F18、STa、Stx2e和STb等13對(duì)大腸埃希菌毒力基因，PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix預(yù)混酶12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。大腸埃希菌各毒力基因PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火45 s(表1)，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄分析。

3 結(jié)果

3.1 大腸埃希菌分離與鑒定結(jié)果

從234份陸生野生動(dòng)物糞便樣品中，分離獲得40株疑似大腸埃希菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定和BD PhoenixTM-100全自動(dòng)微生物鑒定，確定分離株均為大腸埃希菌，分離率為17.1%(40/234)。

3.2 大腸埃希菌藥敏檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)BD PhoenixTM-100全自動(dòng)微生物藥敏系統(tǒng)對(duì)40株大腸埃希菌進(jìn)行藥敏檢測(cè)，有8株大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素耐藥，耐藥率為20%(8/40)。

3.3 MIC檢測(cè)結(jié)果

利用四環(huán)素E-test試紙條對(duì)8株四環(huán)素耐藥大腸埃希菌進(jìn)行檢測(cè)，MIC值如表2所示，最高抑菌濃度為128 μg/mL，最低抑菌濃度為32 μg/mL。四環(huán)素耐藥菌株均來(lái)源于東北虎和野豬。

表2 四環(huán)素耐藥大腸埃希菌分離株鑒定結(jié)果

3.4 ERIC-PCR結(jié)果

通過(guò)ERIC-PCR結(jié)果如圖1所示，40株大腸埃希菌分離株存在35種不同指紋圖譜。

圖1 大腸埃希菌ERIC-PCR鑒定結(jié)果(部分)Fig.1 ERIC-PCR identification results of Escherichia coli(partial) 注：M：DNA標(biāo)準(zhǔn)100 bp；1—12：大腸埃希菌分離株 Note：M，DNA marker 100 bp.1-12，Escherichia coli isolates

3.5 大腸埃希菌系統(tǒng)進(jìn)化分群

40株野生動(dòng)物源大腸埃希菌的系統(tǒng)進(jìn)化分群結(jié)果顯示A群占7.5%(3/40)，B1群占30%(12/40)，B2群占15%(6/40)，D群占37.5%(15/40)，未知群占10%(4/40)，PCR結(jié)果如圖2所示。

圖2 大腸埃希菌ABD分群PCR結(jié)果(部分)Fig.2 PCR results of Escherichia coli on phylogenetic clustering(partial) 注：M：DNA標(biāo)準(zhǔn)100 bp；1—9：大腸埃希菌分離株；N：陰性對(duì)照 Note：M，DNA marker 100 bp.1-9，Escherichia coli isolates.N，negative

3.6 大腸埃希菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)40株大腸埃希菌進(jìn)行13種毒力基因檢測(cè)，有10株大腸埃希菌攜帶EAST1基因，攜帶率為25%(10/40)，其余毒力基因未檢出。

3.7 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)8株四環(huán)素耐藥大腸埃希菌進(jìn)行四環(huán)素耐藥基因檢測(cè)，僅檢測(cè)到tetA和tetB(表2)，未檢測(cè)到tetC、tetD、tetW和tetM耐藥基因。

4 討論

腸桿菌基因間共有重復(fù)序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC)分散在細(xì)菌的基因組中，保守性極強(qiáng)，不易突變。ERIC-PCR是在RAPD-PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的對(duì)細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行指紋圖譜分析的一種方法，可用來(lái)區(qū)別不同種的細(xì)菌和同一種細(xì)菌的不同菌株[8]。本研究分離獲得的大腸埃希菌ERIC圖譜分散度高，同源性低，在40株分離株出現(xiàn)35種不同的指紋圖譜，說(shuō)明不同物種野生動(dòng)物之間菌群交換存在屏障。

大腸埃希菌是常見(jiàn)條件性致病菌之一，也是細(xì)菌群落在腸道微環(huán)境中獲得和傳遞毒力及耐藥相關(guān)遺傳元件的重要菌屬，大腸埃希菌的耐藥譜也是腸道菌群耐藥基因水平傳播評(píng)估的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明東北虎豹國(guó)家公園棲息的陸生野生動(dòng)物攜帶大腸埃希菌耐藥情況并不嚴(yán)重，僅存在四環(huán)素耐藥表型并檢出相關(guān)耐藥基因，表明東北虎豹國(guó)家公園自然生態(tài)基本未受到人類畜牧養(yǎng)殖等活動(dòng)的嚴(yán)重影響，但亦不能掉以輕心。Timonin等[9]對(duì)棲息于海島的加拿大野馬(Equuscaballus)做了類似的研究，大腸埃希菌分離率為28.7%(146/508)，97%的分離株對(duì)全部抗生素敏感，僅有4株(2.7%)對(duì)四環(huán)素耐藥，1株對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。而與人類活動(dòng)接觸更為密切的野生動(dòng)物如鳥(niǎo)類、嚙齒類等通常耐藥與毒力元件攜帶率更高[10]。本研究檢出四環(huán)素耐藥株也多從與人類活動(dòng)區(qū)域有交集的野豬分離獲得。

四環(huán)素作為臨床上常用的抗生素，在我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用，長(zhǎng)期大量的使用不僅造成家畜體內(nèi)細(xì)菌四環(huán)素的耐藥水平增高，同時(shí)也對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的抗生素污染。王基偉[11]報(bào)道吉林地區(qū)豬源大腸埃希菌四環(huán)素耐藥率為83.63%，張瑜等[12]對(duì)延邊地區(qū)豬源大腸埃希菌四環(huán)素耐藥率為89%，而本研究中，野生動(dòng)物大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率為20%，相對(duì)于周邊養(yǎng)殖業(yè)對(duì)四環(huán)素的耐藥率，我國(guó)“東北虎豹國(guó)家公園”中野生動(dòng)物源大腸埃希菌的耐藥情況較為樂(lè)觀，但耐藥菌四環(huán)素MIC值已高達(dá)128 μg/mL，需要加以關(guān)注。大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素的耐藥機(jī)制主要以外排和核糖體保護(hù)機(jī)制為主[13]，本研究在8株具有四環(huán)素耐藥表型大腸埃希菌中分別檢出tetA和tetB基因，均為攜帶單一耐藥基因，這與國(guó)內(nèi)流行特點(diǎn)一致。

大腸埃希菌系統(tǒng)進(jìn)化分群可分為A、B1、B2、D和未知群，其中B2群和D群為主要致病群[6]，腸道外大腸埃希菌感染主要以B2群為主[14]。本研究中D群占較大比例，其次為B1群、B2群和A群。D群和B2群所占比例為52.5%。其中25%的分離株檢出EAST1(enteroaggregativeEscherichiacoliheat-stable enterotoxin 1)毒力基因。EAST1為腸集聚性大腸埃希菌耐熱腸毒素，是一種小蛋白質(zhì)類毒素，與很多致病性大腸埃希菌家族有關(guān)聯(lián)[15]。EAST1(38aa)由astA基因編碼，編碼基因和免疫原性均與STa不同，該毒素通過(guò)激活腺苷環(huán)化酶發(fā)揮活性。astA毒力基因轉(zhuǎn)移通過(guò)插入序列IS1414實(shí)現(xiàn)，可在不同屬細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移，除了大腸埃希菌，在沙門氏菌(Salmonellaenterica)中也有發(fā)現(xiàn)[16]。

本研究對(duì)陸生野生動(dòng)物源大腸埃希菌進(jìn)行了初步研究，獲得了大腸埃希菌系統(tǒng)進(jìn)化分群、毒力基因、耐藥表型、耐藥基因型及耐藥程度等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為進(jìn)一步了解陸生野生動(dòng)物攜帶致病性或耐藥性大腸埃希菌的情況提供了參考數(shù)據(jù)，為建立野生動(dòng)物和人攜帶耐藥病原菌之間的流行病學(xué)關(guān)聯(lián)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。