步 營(yíng)， 何 瑋， 王 飛,2， 朱文慧,*， 李學(xué)鵬，儀淑敏， 徐永霞， 勵(lì)建榮,*

(1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/國(guó)家魚(yú)糜及魚(yú)糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心， 遼寧 錦州 121013；2.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心， 遼寧 大連 116034)

2019新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染的肺炎(COVID-19)嚴(yán)重威脅著全球公共衛(wèi)生安全，截至2020年7月1日，全球累計(jì)COVID-19確診病例已超1 059萬(wàn)，累計(jì)死亡病例超過(guò)51萬(wàn)[1]。我國(guó)海洋生物活性物質(zhì)資源豐富，利用計(jì)算機(jī)模擬從水產(chǎn)原料中篩選具有抗SARS-CoV-2能力的生物活性的肽段，可為研發(fā)相應(yīng)的海洋功能食品提供新的發(fā)展方向。

SARS-CoV-2屬于β型冠狀病毒，與人類嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)具有79%的序列相似性，序列同源性較高[2]；與其他冠狀病毒相似，表現(xiàn)為包膜包被的單股正鏈RNA病毒。SARS-CoV-2由刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)四種主要結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成[3]。構(gòu)成病毒刺突的S蛋白，在病毒侵襲宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，S蛋白在結(jié)構(gòu)上分為S1和S2兩個(gè)亞基，其中S1亞基中具有的受體集合域(RBD)核心部位，與SARS-CoV的RBD核心部位高度一致[2,4]。不僅如此，對(duì)SARS-CoV-2的構(gòu)象研究表明，許多單克隆抗體[5-7]也能夠如同針對(duì)SARS-CoV一樣以S蛋白的RBD作為關(guān)鍵靶標(biāo)，并與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)相互作用進(jìn)入呼吸道上皮細(xì)胞[8]，達(dá)到抑制病毒侵染的目的。另外，經(jīng)過(guò)測(cè)量，SARS-CoV-2的RBD不僅可以與人ACE2發(fā)生強(qiáng)力結(jié)合，其親和力和SARS-CoV的S蛋白與人ACE2之間的親和力相當(dāng)[9]，而且SARS-CoV-2/ACE2結(jié)合蛋白與SARS-CoV/ACE2的原結(jié)構(gòu)構(gòu)象相比并未發(fā)生太大改變[10]。因此推測(cè)，SARS-CoV-2的感染和傳播所依靠的受體和機(jī)制與SARS-CoV相差無(wú)幾。除此之外，主蛋白酶(Mpro)作為冠狀病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)通過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制病毒時(shí)是必不可少的關(guān)鍵酶[11]，以Mpro為靶標(biāo)進(jìn)行模擬篩選，也為研發(fā)抗SARS-CoV-2的功能性食品提供了新的思路。

分子模擬作為強(qiáng)大的科學(xué)研究工具，可通過(guò)模擬、計(jì)算和分析分子系統(tǒng)及其相互作用來(lái)研究實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象或指導(dǎo)新實(shí)驗(yàn)的發(fā)展。分子對(duì)接的廣泛利用可以清晰地了解活性肽和受體蛋白的對(duì)接位點(diǎn)及二者之間存在的相互作用力，從而分辨出肽段的生物活性和有效性。國(guó)內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)在利用分子模擬進(jìn)行SARS-CoV-2的防治藥物研究方面做出頗多成果[12-16]，但多數(shù)是在已知藥物成分中進(jìn)行篩選，未見(jiàn)有從食品原料中提取活性肽進(jìn)行模擬研究的報(bào)道。蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)是一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)貝類，同時(shí)具有較大的藥用和保健價(jià)值。據(jù)報(bào)道，蝦夷扇貝肌球蛋白的酶解肽段具有較好的潛在生物活性，部分還表現(xiàn)出優(yōu)良的抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性[17]。經(jīng)蛋白基因庫(kù)查詢可知，蝦夷扇貝肌球蛋白的蛋白序列明確且易得可供我們進(jìn)行虛擬篩選。

本研究擬通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬，從水產(chǎn)動(dòng)物蝦夷扇貝肌球蛋白中篩選出具有抗SARS-CoV-2潛在活性的小分子功能肽段，希望為抗SARS-CoV-2功能食品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 模擬水解蝦夷扇貝肌球蛋白

利用ExPASy PeptideCutter(http:∥web.expasy.org/peptide_cutter)軟件對(duì)蝦夷扇貝的肌球蛋白序列(GenBank: BAB40711.1)進(jìn)行模擬酶解，預(yù)測(cè)肌球蛋白被蛋白酶或化學(xué)物質(zhì)裂解的潛在裂解位點(diǎn)，并在其上映射可能的切割位點(diǎn)和切割位點(diǎn)位置表。采用胃蛋白酶(pH值1.3)、低特異性胰凝乳蛋白酶(C端指[FYWML]，而非P之前)和胰蛋白酶[17]對(duì)肌球蛋白進(jìn)行模擬水解，整理水解所得肽段，以備后續(xù)研究。

1.2 肽段的活性和毒性預(yù)測(cè)

采用Peptide Ranker(http:∥distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)服務(wù)器預(yù)測(cè)生物活性肽的生物學(xué)活性并對(duì)肽進(jìn)行分類，當(dāng)預(yù)測(cè)的肽段分?jǐn)?shù)超過(guò)0.5，則表明肽段具有潛在生物活性。在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)BIOPEP-UWM(http:∥www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)中搜索預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)超過(guò)0.5，即具有潛在活性的肽段序列，根據(jù)搜索結(jié)果選擇蛋白庫(kù)內(nèi)未知的肽段進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)，采用ToxinPred(http:∥www.imtech.res.in/raghava/toxinpred/)程序預(yù)測(cè)所選肽段毒性。

1.3 受體蛋白晶體的選擇

選擇的受體蛋白晶體為SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白[18-19]和COVID-19 Mpro 水解酶[20]的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，可從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.rcsb.org)中獲得，PDB蛋白庫(kù)編號(hào)分別為2AJF和6LU7。

1.4 分子對(duì)接

采用Discovery Studio(v17.2.016349)軟件進(jìn)行分子對(duì)接。首先使用DS /Macromoleculars根據(jù)肽段氨基酸序列構(gòu)建肽段的三維結(jié)構(gòu)，在構(gòu)建好選定肽段的初始結(jié)構(gòu)后，對(duì)肽段結(jié)構(gòu)進(jìn)行最小化優(yōu)化，隨后進(jìn)行受體準(zhǔn)備。小分子肽段處理結(jié)束后，將SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入軟件中，選擇SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白晶體結(jié)構(gòu)中的A鏈和E鏈作為受體，二者分別代表著ACE2和SARS-CoV-S蛋白結(jié)構(gòu)。去除蛋白晶體結(jié)構(gòu)周圍存在的水分子和配體集團(tuán)，做“Prepare Protein”處理，COVID-19 Mpro 水解酶蛋白晶體的三維結(jié)構(gòu)與SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白晶體處理方式相同。參考沈亮亮等[21]的研究，選擇SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白晶體結(jié)構(gòu)中A鏈上的ASP38、GLU42、GLN325和GLU329以及E鏈上的TYR436和TYR491共6個(gè)關(guān)鍵氨基酸定義為SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白分子對(duì)接的活性口袋，選擇COVID-19 Mpro 水解酶蛋白晶體上的THR24、THR25、THR26、LEU27、ASN28和ASN119 共6個(gè)關(guān)鍵氨基酸定義為COVID-19 Mpro水解酶蛋白分子對(duì)接的活性口袋。將小分子肽段分別與SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白上確定的活性結(jié)合口袋、COVID-19 Mpro水解酶蛋白上確定的活性結(jié)合口袋進(jìn)行LibDock半柔性分子對(duì)接，選擇構(gòu)象參數(shù)為“BEST”，其余參數(shù)仍為默認(rèn)值。對(duì)接成功的肽段結(jié)果按照LibDock Score分值高低降序排列，分析肽段與兩種蛋白活性口袋中關(guān)鍵氨基酸形成的相互作用力，從而篩選出具有潛在COVID-19/ACE2結(jié)合阻斷能力和COVID-19 Mpro水解酶抑制能力的肽段。

2 結(jié)果與討論

2.1 蝦夷扇貝肌球蛋白模擬酶解及酶解肽段潛在活性、毒性預(yù)測(cè)

經(jīng)模擬酶解后1 945個(gè)氨基酸的肌球蛋白序列被酶解為415條肽段，將所有肽段進(jìn)行Peptide Ranker預(yù)測(cè)，選擇預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)大于0.5的共28條肽段序列，序列位置及評(píng)分如表1。對(duì)表中28條具有潛在生物活性的肽段進(jìn)行BIOPEP-UWM蛋白庫(kù)搜索，肽段已知生物活性如表2 。表2中，肽段GM、GR、GY、GI、NCW和VAF具有不同程度的ACE抑制活性，NW、QW、GY、IM、NM和GI具有DPP IV抑制活性；除此之外，三肽ADF具有抗氧化活性，四肽QRPR能夠進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，其余肽段并未在活性蛋白庫(kù)中搜索到明確的生物活性。在此基礎(chǔ)上，對(duì)28條肽段序列進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)。表3預(yù)測(cè)結(jié)果表明，28條肽段均無(wú)毒性，可以用于后續(xù)抑制劑研究。

2.2 SARS-CoV-S/ACE2 蛋白受體與肽段的分子對(duì)接

以SARS-CoV-S/ACE2蛋白為對(duì)接受體，從而選擇能夠與復(fù)合蛋白構(gòu)象關(guān)鍵氨基酸結(jié)合形成氫鍵的肽段，達(dá)到篩選COVID-19/ACE2結(jié)合阻斷肽的目的。

圖1為SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白A鏈和E鏈的三維結(jié)構(gòu)圖，根據(jù)已知關(guān)鍵氨基酸所選擇的結(jié)合口袋空間坐標(biāo)為11.825 486、-2.174 257、70.748 771，半徑13.051 520。28條肽段與SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白對(duì)接結(jié)果匯總?cè)绫?。表4中，28條肽段均能進(jìn)入復(fù)合蛋白結(jié)合口袋并與受體上的氨基酸結(jié)合，其中17條肽段能夠與蛋白受體上的關(guān)鍵氨基酸形成氫鍵。圖2為活性肽段與SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白對(duì)接2D示意圖。由圖2(a)、圖2(b)可見(jiàn)，肽段AM和QPGL除了能與關(guān)鍵氨基酸TYR491形成氫鍵外，還能以疏水相互作用力與之結(jié)合，LibDock Score 打分為103.22、86.64；而肽段CSNAIPEL可以與A鏈上的GLN42和E鏈上的GLU329兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸形成氫鍵(見(jiàn)圖2 (c))，肽段LibDock Score打分136.03；肽段LPIY既能與受體蛋白E鏈上的TYR491作用形成氫鍵，也能夠以靜電作用與A鏈上的ASP38產(chǎn)生相互作用(見(jiàn)圖2 (d))，LibDock Score為142.85。與其他能夠與關(guān)鍵氨基酸形成氫鍵的肽段相比，CSNAIPEL和LPIY肽段能夠與更多關(guān)鍵氨基酸發(fā)生相互作用，因此可以預(yù)測(cè)二者與SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白結(jié)合更加緊密，具有更大阻斷COVID-19/ACE2 蛋白受體結(jié)合的潛力。除此之外，雖然肽段HM、IM、NM、GM也可以與兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸以靜電作用、疏水作用等方式發(fā)生相互作用，但它們并未與關(guān)鍵氨基酸形成氫鍵，結(jié)合強(qiáng)度較弱，因此阻斷結(jié)合潛力相對(duì)較弱，不適合進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表1 具有潛在生物活性的模擬酶解肽段Tab.1 Peptides with potential biological activity generated from Mizuhopecten yessoensis myosin digestedin silico

表2 BIOPEP-UWM蛋白庫(kù)已知生物活性肽Tab.2 Known bioactive peptides in BIOPEP-UWM protein database

表3 選擇肽段的模擬毒性預(yù)測(cè)Tab.3 Simulated toxicity prediction of selected peptides in silico

圖1 SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白A鏈和E鏈的 三維結(jié)構(gòu)Fig.1 3D structure of SARS-CoV-S/ACE2 complex protein A and E chain

2.3 COVID-19 Mpro 水解酶蛋白受體與肽段的分子對(duì)接

選用的COVID-19 Mpro 水解酶高分辨率晶體結(jié)構(gòu)如圖3，根據(jù)已知關(guān)鍵氨基酸定義的結(jié)合口袋空間坐標(biāo)為-9.063 889、24.552 533、65.154 444，半徑11.788 826，對(duì)接結(jié)果匯總?cè)绫?。表5顯示，28條肽段雖均能進(jìn)入結(jié)合口袋并與受體上的氨基酸結(jié)合，但僅有10條肽段能夠與蛋白受體上的關(guān)鍵氨基酸形成氫鍵。肽段QRPR、QPGL、LPIY和SITGW都能與關(guān)鍵氨基酸THR24、THR25和THR26形成氫鍵(見(jiàn)圖4)，LibDock Score打分為154.93、131.36、168.04和150.46；與此同時(shí)除SITGW之外的3條肽段還能與LEU27產(chǎn)生相互作用，與受體蛋白產(chǎn)生強(qiáng)烈的結(jié)合，表現(xiàn)出較強(qiáng)的Mpro水解酶抑制活性；肽段QRPR能夠與關(guān)鍵氨基酸形成最多的氫鍵，與COVID-19 Mpro構(gòu)象結(jié)合能力最緊密，從而預(yù)測(cè)出其為最有潛力的COVID-19 Mpro的水解酶抑制肽。

3 結(jié) 論

本研究以SARS-CoV-2和SARS-CoV所具有的相似作用機(jī)制為基礎(chǔ)，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬和分子對(duì)接篩選蝦夷扇貝肌球蛋白中的小分子抗新冠病毒活性肽段。通過(guò)模擬酶解蝦夷扇貝肌球蛋白，從中篩選出具有潛在活性的28條肽段進(jìn)行肽段和受體蛋白Y能夠通過(guò)與SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白中的關(guān)鍵氨基酸形成最多相互作用而表現(xiàn)出較好的病毒結(jié)合阻斷作用；同時(shí)肽段QRPR、QPEL、LPIY和SITGW能夠起到較好的COVID-19 Mpro水解酶抑制作用，其中QRPR與COVID-19 Mpro水解酶的關(guān)鍵氨基酸形成的相互作用數(shù)最多，結(jié)合能力最為穩(wěn)定，相應(yīng)的對(duì)水解酶的抑制能力最為理想。值得一提的是，肽段LPIY除了具有SARS-CoV-S/ACE2阻斷能力，也顯示出不俗的COVID-19 Mpro水解酶抑制能力，這也為后期研發(fā)出有助于提高人體抗感染能力和免疫能力雙重作用的抗SARS-CoV-2病毒功能食品提供了可能性。

表4 28條肽段與SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白對(duì)接結(jié)果評(píng)分與氫鍵作用氨基酸Tab.4 LibDock Score of docking results and hydrogen bonding amino acids of 28 peptides and SARS-CoV-S/ACE2 complex protein

圖2 活性肽段與SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白對(duì)接2D示意圖Fig.2 2D diagrams of interaction between bioactive peptides with SARS-CoV-S/ACE2 complex protein

圖3 COVID-19 Mpro水解酶晶體三維結(jié)構(gòu)Fig.3 3D structure of COVID-19 Mpro hydrolase

表5 28條肽段與COVID-19 Mpro 水解酶對(duì)接結(jié)果評(píng)分與氫鍵作用氨基酸Tab.5 LibDock Score of docking results and hydrogen bonding amino acids of 28 peptides and COVID-19 Mpro hydrolase

圖4 活性肽段與COVID-19 Mpro蛋白對(duì)接2D示意圖Fig.4 2D diagrams of interaction between bioactive peptides with COVID-19 Mpro protein