拓婷，朱飛虎

延安市人民醫(yī)院肛腸科，陜西 延安 716000

胃癌是臨床上消化道腫瘤中最常見的類型，調(diào)查顯示胃癌的年發(fā)生率為138.6/10 萬，且其病死率在所有癌癥致死病因中僅次于呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤而居第2位[1]。胃癌的臨床特點包括發(fā)病率及轉(zhuǎn)移率高、病死率高，早期診斷率低等，其治療效果不佳也多與轉(zhuǎn)移率高關(guān)系密切[2]。神經(jīng)浸潤(PNI)目前被認為是一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移途徑，是指腫瘤周圍神經(jīng)被侵及、包繞，或者瘤細胞直接進入到神經(jīng)纖維間隙，從而造成腫瘤的轉(zhuǎn)移擴散[3]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種僅合成或表達于增殖細胞中的核內(nèi)多肽，既往臨床重多重視其在炎癥反應(yīng)中的作用，現(xiàn)在認識到其在多種腫瘤組織尤其是轉(zhuǎn)移瘤中具有高表達的特點，可通過促進腫瘤細胞侵襲遷移而引起腫瘤的轉(zhuǎn)移、進展[4]。目前關(guān)于胃癌PNI 與HMGB1 關(guān)系的臨床研究尚不多見，因此本研究分析了HMGB1在伴有PNI的胃癌組織中的表達及臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析延安市人民醫(yī)院2017 年 2 月至 2019 年 2 月期間收治的 82 例胃癌患者的臨床資料。納入標準：①年齡≥18 歲；②術(shù)前均經(jīng)病理檢查證實為胃癌，術(shù)后病理進一步證實；③術(shù)前未接受放化療及生物免疫等手段治療；④臨床及病理資料完整。排除標淮：①合并嚴重的免疫系統(tǒng)疾病以及長期應(yīng)用免疫抑制劑治療者；②合并其他臟器、系統(tǒng)的嚴重病變，或其合并其他惡性腫瘤者。82例患者中男性49例，女性33例；年齡52～84歲，平均(64.1±10.2)歲。

1.2 研究方法 所有患者均接受胃癌根治術(shù)治療，收集患者的臨床及病理資料，根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果將伴有PNI 的38 例患者納入觀察組，余44 例未伴有PNI 者納入對照組。比較兩組患者的性別、年齡、飲酒、吸煙以及高血壓、糖尿病等臨床資料。飲酒標準：飲酒史＞3 年，≥100 mL/d；吸煙標準:吸煙史＞5年，≥20支/d。同時測定所有患者的胃癌組織HMGB1的表達，對PNI胃癌患者再次分組，根據(jù)HMGB1表達是否陽性將患者分別納入陽性組和陰性組，比較兩組患者的性別、年齡、臨床分期及腫瘤大小、臨床分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床和病理特征。其中臨床分期的依據(jù)為國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標準。

1.3 HMGB1表達的測定

1.3.1 免疫組織化學(xué)方法 手術(shù)結(jié)束后將胃癌組織送檢病理科，制備石蠟切片，進行免疫組化染色。采用Envision 兩步法，陰性對照選擇磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗。首先將石蠟包埋的組織進行4 μm的連續(xù)切片；使用二甲苯脫蠟，再使用梯度酒精進行逐級水化；將其放置在3%雙氧水、甲醇室溫下予以作用30 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；然后使用乙二胺四乙酸緩沖液進行抗原熱修復(fù)，時間為90 s；加入一抗HMGB1，放置在4℃條件下孵育過夜，使用PBS 充分沖洗；加入Envision 二抗，在室溫下孵育30 min；在光鏡下用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進行顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、風(fēng)干及封片等步驟，封片材料為中性樹脂。其中鼠單克隆抗體HMGB1 由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，二抗、DAB、PBS等試劑由福州邁新公司提供。

1.3.2 陽性結(jié)果的判讀 HMGB1蛋白陽性表現(xiàn)為顯微鏡下細胞核或者細胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)呈棕色，觀察顯色癌細胞比例和染色強度，然后進行半定量化評分，標準：腫瘤組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)棕色染色組織，或≤10%細胞膜/漿/核染色時判定為(-)；腫瘤組織出現(xiàn)＞10%細胞膜/漿/核部分染色，則判斷為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對照組患者的臨床資料比較 觀察組和對照組患者在性別、年齡、飲酒、吸煙及合并高血壓方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；但是觀察組患者合并糖尿病的比例明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 觀察組和對照組患者的臨床病理資料比較

2.2 觀察組和對照組患者的HMGB1表達水平比較 HMGB1蛋白表達在顯微鏡下細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕色見圖1 和圖2。觀察組中有28 例HMGB1 表達陽性，陽性率為73.68%，明顯高于對照組的47.73%(21/44)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.173，P＜0.05)。

圖1 細胞質(zhì)中HMGB1的表達（×200）

圖2 細胞核中HMGB1的表達（×200）

2.3 觀察組患者HMGB1表達與臨床病理指標的關(guān)系 觀察組患者中，HMGB1陽性組與陰性組的年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；但是陽性組患者腫瘤直徑≥3 cm、TNM Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例明顯高于陰性組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 觀察組患者HMGB1表達與臨床病理指標的關(guān)系

3 討論

胃癌在我國是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率出現(xiàn)逐年上升的趨勢，已經(jīng)成為威脅我國居民健康及生命安全的重要疾病[5]。胃癌患者早期常常缺乏典型臨床癥狀，一旦發(fā)病則出現(xiàn)快速進展，患者就診時常常處于中晚期[6-7]。近些年來，惡性腫瘤神經(jīng)浸潤的機制及意義不斷被深入研究，臨床上也越來越重視PNI 在惡性腫瘤中的重要意義[8]。目前研究認為PNI 是惡性腫瘤的一種新的轉(zhuǎn)移方式，可能獨立于既往的血道轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移、種植轉(zhuǎn)移以及直接轉(zhuǎn)移，且與惡性腫瘤的預(yù)后關(guān)系密切。目前胃癌PNI的具體機制尚不明確，但是研究指出合并PNI 的胃癌患者其預(yù)后更差[9]。周樂盈等[10]對413 例胃癌患者的臨床資料并進行回顧性分析，指出神經(jīng)浸潤與腫瘤的進展密切相關(guān)，對胃癌患者預(yù)后評估有著重要的作用。本研究對比了合并PNI的觀察組與未合并PNI的對照組的臨床資料，發(fā)現(xiàn)觀察組合并糖尿病的比例明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。既胃癌PNI 的發(fā)生與年齡、性別及飲酒、吸煙、高血壓等因素?zé)o明顯的相關(guān)性，但是糖尿病與PNI的發(fā)生可能存在關(guān)聯(lián)，說明胃癌患者如合并糖尿病則增大了其發(fā)生神經(jīng)浸潤的風(fēng)險。分析其原因可能是因為糖尿病患者長期存在高血糖狀態(tài)加重了其神經(jīng)病變，進而導(dǎo)致了神經(jīng)浸潤的發(fā)生，患者也更容易發(fā)生PNI[11]。

高遷移率族蛋白B1常位于真核生物的細胞核內(nèi)，是一種生物學(xué)功能多樣的核內(nèi)蛋白。既往認為HMGB1 在細胞外具有強大的致炎效應(yīng)，且被認為是新型的炎性細胞因子之一[12]。隨著對HMGB1研究的深入，發(fā)現(xiàn)HMGB1 在核內(nèi)主要與DNA 結(jié)合，不僅可以起到穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)的作用，還與DNA的一系列生命活動關(guān)系密切如參與重組、修復(fù)、調(diào)控等[13]。此外，HMGB1 與腫瘤關(guān)系密切，通過結(jié)合不同受體可以發(fā)揮不同作用如促進基質(zhì)降解、誘發(fā)新生血管形成、調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突生長能力等，進而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤的轉(zhuǎn)移等過程[14-15]。既往有研究指出，HMGB1 與肝癌者的臨床分期、分級密切相關(guān)[16]。CHUANG 等[17]觀察了胃癌患者血清HMGB1 濃度與臨床與病理指標的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)患者血清HMGB1 水平與胃癌腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后均存在顯著的相關(guān)性。在本研究中，觀察組胃癌組織HMGB1的陽性表達率為73.68%，明顯高于對照組的47.73%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。另一方面，在伴有PNI胃癌中，HMGB1 陽性組與陰性組比較，年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；但是陽性組其腫瘤直徑≥3 cm、TNM Ⅲ～Ⅳ、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例均明顯高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這進一步提示HMGB1可能參與了胃癌PNI的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，合并糖尿病的胃癌患者可能更容易發(fā)生神經(jīng)浸潤；而神經(jīng)浸潤胃癌組織中HMGB1 的表達高于未伴有PNI的胃癌組織，且其與腫瘤大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，有望成為胃癌的靶向治療及預(yù)后評估中的新的指標。