李澤清 丁軍穩(wěn) 任榮 丁啟龍 王哲 米濤 陸川 李釗偉 *

1. 青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810000 2. 青海省湟中縣第二人民醫(yī)院，青海 西寧 811601

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量(骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì))減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化(骨小梁結(jié)構(gòu)破壞、變細(xì)和斷裂)，骨生物力學(xué)改變(骨力學(xué)強(qiáng)度下降、骨載荷承受力降低、骨脆性增高)和骨折危險性增加為特征的全身代謝性骨病[1]。隨著全社會人口的老齡化，OP的發(fā)病率逐年上升，OP已成為老年人的一種常見病、多發(fā)病，其常常合并嚴(yán)重并發(fā)癥(如骨折)，且預(yù)后較差，給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。目前防治OP的藥物主要分為4類：①促進(jìn)骨礦化藥物；②促進(jìn)骨形成藥物；③抑制骨吸收藥物；④解偶聯(lián)劑。雌激素水平降低是OP的重要誘因之一，雌激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)是目前防治OP的有效措施[3]。近年來研究表明辛伐他汀具有激活成骨細(xì)胞、促進(jìn)骨合成代謝和骨形成作用，這一特性為進(jìn)一步尋找防治OP藥物指明了新方向和新思路[4]。本研究試圖觀察辛伐他汀、雌二醇聯(lián)合干預(yù)對大鼠骨質(zhì)疏松的影響，旨在為OP的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級雌性SD大鼠75只，3月齡，體重320～350 g，由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，辛伐他汀(舒降之)：40 mg/片，生產(chǎn)批號：1810261，美國默沙東公司；苯甲酸雌二醇：100 μg/支，生產(chǎn)批號：1708072，浙江仙居制藥廠。EXPERT型雙能X線骨密度測定儀購于美國LUNAR公司，MTS-858型骨生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)購于美國MA公司，堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、I型前膠原羧基端前肽(PICP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測試劑盒購于美國R&D公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理：75只雌性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分組；假手術(shù)組、去勢組、辛伐他汀組、雌二醇組、聯(lián)合藥物組。假手術(shù)組僅切除部分脂肪組織，其他4組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。造模成功后于第2天給予同藥物處理，辛伐他汀用0.9%Nacl配制1 mg/mL混懸液，假手術(shù)組、去勢組：皮下注射等量0.9% Nacl，1次/d；辛伐他汀組：辛伐他汀[4 mg/(kg·d)，灌胃，1次/d]；雌二醇組：苯甲酸雌二醇(1 mg，肌肉注射，1次/d)；聯(lián)合用藥組：辛伐他汀[4 mg/(kg·d)，灌胃，1次/d]+苯甲酸雌二醇(1 mg，肌肉注射，1次/d)，連續(xù)用藥6周。

1.2.2去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型：2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，備皮消毒，取腹背部中線第2腰椎水平做長約2 cm雙背側(cè)縱行切口，依次分離進(jìn)入腹腔，尋找卵巢組織，平鑷將卵巢牽出，嚴(yán)密結(jié)扎輸卵管及其周圍血管、脂肪組織，完整切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅切除卵巢周圍等量脂肪組織，不予切除卵巢和結(jié)扎輸卵管，沖洗傷口，止血徹底，逐層縫合，關(guān)閉腹腔，術(shù)后立即注射青霉素20萬U預(yù)防感染。

1.2.3標(biāo)本取材與處理：藥物干預(yù)6周，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，取血8～10 mL，高速冷凍離心，3 000 r/min×10 min，EP管收集上層血清1～2 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。逐層剝離L4腰椎和雙側(cè)股骨，剔除周圍軟組織，以無菌生理鹽水濕紗布包裹，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。另留取椎體10%甲醛溶液固定，10% EDTA 6周，乙醇脫水，二甲苯透明，制備石蠟切片，60 ℃烤箱4 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)檢測：取出上清液，采用ELISA試劑盒檢測血清中ALP、BGP、PICP、TRAP，按試劑盒說明書步驟操作。

1.2.5骨組織骨密度(bone mineral density，BMD)和礦物含量(bone mineral content，BMC)測定：取出待測大鼠L4腰椎和右股骨，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測，采用小物體Discovery Wi掃描模式：掃描類型hHi-Res、掃描精度1%、掃描速度60 mm/s、掃描寬度5.0 cm、分辨率1.0 mm×1.0 mm等參數(shù)值，用儀器選定興趣區(qū)，以2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，應(yīng)用小動物軟件分析計(jì)算BMD和BMC值。

1.2.6骨生物力學(xué)指標(biāo)檢測：取出腰5椎體和右側(cè)股骨，游標(biāo)卡尺測量椎體和股骨長度，將置于電子萬能生物力學(xué)材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲力學(xué)試驗(yàn)，固定骨標(biāo)本位置，保持標(biāo)本上下面水平，支點(diǎn)跨距20 mm，最大量程1 000 N，加載速度1 mm/min，計(jì)算機(jī)記錄儀記錄載荷-變形曲線，計(jì)算最大載荷、最大應(yīng)力、最大位移和結(jié)構(gòu)剛度。

1.2.7HE染色：取出石蠟切片，脫蠟，水化，流水沖洗，蘇木精染色10 min，流水沖洗，0.5%鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗30 min，返藍(lán)，蒸餾水洗滌3～5 s；伊紅染色2～3 min，流水沖洗；再次脫水，透明；封片，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)

去勢組血清ALP、BGP、PICP、TRAP水平較假手術(shù)組顯著增高(P<0.05)，辛伐他汀組、雌二醇組、聯(lián)合藥物組血清ALP、BGP、PICP、TRAP水平較去勢組均降低，其中尤以聯(lián)合用藥組降低最顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)比較Table 1 Comparison of serum bone metabolism markers among the groups

2.2 骨組織BMD和BMC

去勢組腰椎和股骨BMD和BMC較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，辛伐他汀組、雌二醇組、聯(lián)合藥物組較去勢組腰椎(L4)和股骨BMD和BMC均增高，其中以聯(lián)合藥物組增高最顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腰椎和股骨BMD和BMC比較Table 2 Comparison of BMD and BMC in lumbar spine and femur among the groups

2.3 骨生物力學(xué)指標(biāo)

去勢組股骨最大載荷、最大應(yīng)力、最大位移和剛度較假手術(shù)組均顯著降低(P<0.05)，辛伐他汀組、雌二醇組、聯(lián)合藥物組較去勢組股骨最大載荷、最大應(yīng)力、最大位移和剛度均顯著增高，其中以聯(lián)合用藥組增高最顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)比較Table 3 Comparison of biomechanical indexes of femur among the groups

2.4 骨組織形態(tài)學(xué)

假手術(shù)組腰椎骨組織結(jié)構(gòu)完整，骨小梁密集，粗細(xì)適中，排列整齊，連接成網(wǎng)狀，脂肪細(xì)胞少。去勢組骨組織呈骨質(zhì)疏松特征性表現(xiàn)，骨小梁明顯減少，稀疏，游離端多，排列紊亂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，大量纖維組織，髓腔內(nèi)大量空泡狀脂肪細(xì)胞。辛伐他汀組和雌二醇組骨小梁數(shù)量增多，排列尚規(guī)則，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)略微修復(fù)，結(jié)構(gòu)仍不完整，脂肪細(xì)胞變少。聯(lián)合藥物組骨組織結(jié)構(gòu)較完整，骨小梁數(shù)目明顯增多，致密均勻粗壯，連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，脂肪細(xì)胞明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠HE染色觀察骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(×200) A：假手術(shù)組；B：去勢組；C：辛伐他汀組；D：雌二醇組；E：聯(lián)合藥物組。Fig.1 Morphological changes of bone tissue observed with HE staining (×200) A：Sham operation group；B：Castration group；C：Simvastatin group；D：Estradiol group；E：Combination drug group.

3 討論

隨著我國人口老齡化進(jìn)程的加劇，21世紀(jì)中葉將步入老年高峰期，OP嚴(yán)重危害中老年人群的健康和生活質(zhì)量，對公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重危害。目前治療臨床防治OP藥物種類繁多，作用特點(diǎn)不同，但單藥在療效、副作用和安全性等方面存在很多問題，治療效果皆不夠理想[5]。因此，進(jìn)一步尋找抗骨質(zhì)疏松的聯(lián)合藥物干預(yù)對防治OP有重大意義。

雌激素水平下降是老年骨質(zhì)疏松的主要誘因。雌激素匱乏可打破成骨與破骨效應(yīng)平衡環(huán)境，成骨和破骨比例失衡，骨形成減少，骨吸收增強(qiáng)，骨量丟失，引發(fā)骨質(zhì)疏松[6]。雌激素是目前臨床應(yīng)用防治OP的主要藥物，HRT治療OP的目的是用雌激素進(jìn)行生理性補(bǔ)充，發(fā)揮其最大臨床效應(yīng)[7]。雌激素的抗骨質(zhì)疏松作用主要是通過直接結(jié)合破骨細(xì)胞表面受體，抑制破骨細(xì)胞生長、分化，延緩骨量減少進(jìn)程，抑制骨吸收；又可直接結(jié)合成骨細(xì)胞表面受體，調(diào)節(jié)成骨代謝，誘導(dǎo)促進(jìn)骨形成骨重建等[8]。

辛伐他汀是目前臨床常用于降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病的藥物，屬于3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑。其通過增加骨密度，恢復(fù)骨微結(jié)構(gòu)，抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成等，起到抗骨質(zhì)疏松作用[9]。辛伐他汀既能促進(jìn)骨形成，又抑制骨吸收，它通過多種路徑發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用：①抑制HMG-CoA還原酶活性，誘導(dǎo)骨形成蛋白-2(BMP-2)基因表達(dá)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，骨基質(zhì)形成及基質(zhì)的礦化過程，促進(jìn)新骨形成[10]；②抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成脂分化，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨形成；③激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶(ALP)合成，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨形成[11]；④激活Ras/MAPK途徑，抑制白細(xì)胞介素-6(IL-6)表達(dá)，從而抑制骨吸收；⑤通過抑制HMG-CoA還原酶，減少甲羥戊酸(MVA)的合成，減少破骨細(xì)胞數(shù)量，抑制破骨細(xì)胞作用，抗骨吸收[12]。

本研究證實(shí)辛伐他汀聯(lián)合雌二醇干預(yù)對大鼠骨質(zhì)疏松起到很好的防治作用，辛伐他汀聯(lián)合雌二醇可通過調(diào)節(jié)去勢骨質(zhì)疏松性大鼠骨代謝，增加骨密度和骨礦物質(zhì)，改善骨生物力學(xué)和骨組織微結(jié)構(gòu)，起到抗骨質(zhì)疏松療效及骨保護(hù)作用。他汀類和雌激素類藥物可能通過復(fù)雜的信號通路誘導(dǎo)BMP-2表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)新骨形成，從而發(fā)揮抗OP作用[13]。馬慶芬等[14]研究說明雌激素和辛伐他汀序貫療法可以增加骨密度、提高骨鈣素、降低IL-6，通過抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成有效地治療骨質(zhì)疏松。王春先等[15]研究表明辛伐他汀和雌激素聯(lián)合應(yīng)用可增加成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性，提高細(xì)胞的礦化能力，對成骨細(xì)胞的分化和成熟有協(xié)同作用。張麗彥等[16]研究表明雌激素與辛伐他汀序貫療法可有效促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨形成，促進(jìn)骨愈合。

綜上所述，他汀類和雌激素類藥物聯(lián)合干預(yù)抗大鼠骨質(zhì)疏松作用較單藥作用更佳，這可能與兩藥的協(xié)同作用機(jī)制有關(guān)。但目前仍有許多問題急需解決，如提高他汀類的生物利用度、尋找最優(yōu)給藥劑量、給藥方式以及降低長期使用雌激素不良反應(yīng)。本研究的結(jié)果給后續(xù)研究留下了廣闊的空間，可能還有許多不為人知的作用機(jī)制，尚有待于進(jìn)一步深入研究。相信隨著上述問題的解決，辛伐他汀和雌激素的應(yīng)用空間將更加廣闊。