吳方貴，田菁燕，彭倩雯，董倩，劉尚杰，張敏旗

(深圳大學第三附屬醫(yī)院(深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院)生殖醫(yī)學科，深圳 518001)

隨著輔助生殖技術的發(fā)展和完善，囊胚培養(yǎng)成功率逐步提高，囊胚移植比卵裂期胚胎移植可以獲得更好的妊娠結局。在臨床實踐中，美國生殖醫(yī)學協(xié)會倡導的“移植一個胚胎，獲得一個健康孩子”理念成為更多生殖中心的選擇[1]，單囊胚移植成為主要手段。現(xiàn)有的研究表明，囊胚形態(tài)學選擇主要依賴于其發(fā)育速度、內細胞團和滋養(yǎng)層等因素的評價[1]；對于優(yōu)質囊胚而言，其發(fā)育時期和/或內細胞團、滋養(yǎng)層情況并不影響單囊胚移植的臨床妊娠率[1]。而單囊胚移植中復蘇囊胚的擴張狀態(tài)對于臨床結局的影響尚未見報道。我們探索2019年在本中心部分凍融胚胎移植(FET)周期中，原始擴張囊胚經過解凍復蘇后擴張程度和妊娠結局的相互關系，探討單囊胚移植中復蘇囊胚擴張程度對于胚胎選擇的影響。

資料和方法

一、研究對象

選擇本生殖中心2019年3月17日至2019年12月31日的FET周期數(shù)據(jù)(總計1 204例樣本)，以優(yōu)質單囊胚移植樣本為具體研究對象。

納入標準：女方年齡21～40歲；囊胚經過激光皺縮后冷凍；移植胚胎均來源于2PN胚胎；FET周期；單囊胚移植；優(yōu)質囊胚(發(fā)育時期Ⅲ期及Ⅲ期之后，內細胞團和滋養(yǎng)層均為B級以上評分)；內膜轉化日子宮內膜厚度>7 mm。

同時滿足上述所有納入標準樣本為研究對象，總共入組190例。

根據(jù)冷凍復蘇培養(yǎng)2 h后囊胚擴張是否超過50%、100%或出現(xiàn)孵化為分組標準，探究原始擴張囊胚經過冷凍復蘇后，不同囊胚擴張狀態(tài)和妊娠結局。

二、囊胚FET周期回顧

1.囊胚培養(yǎng)及評分說明：體外授精后于37℃、6%CO2、5%O2環(huán)境下G1 plus卵裂期培養(yǎng)液(Virtrolife，瑞典)中培養(yǎng)至第3天后，轉移至G2 plus囊胚培養(yǎng)液(Virtrolife，瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)，受精后第5、6日觀察胚胎發(fā)育情況，按照Gardner評分標準[2]對囊胚進行評分。優(yōu)質囊胚為受精后第5及第6日為Ⅲ期及Ⅲ期以上、內細胞團(ICM)及滋養(yǎng)層細胞(TE)均為B級及以上者。

2.囊胚冷凍與復蘇：囊胚冷凍前均行激光皺縮，30 min內進行玻璃化冷凍。冷凍/解凍參照日本加藤公司試劑盒說明書操作。室溫下將囊胚放入平衡液(ES)中10～12 min，然后將囊胚轉移至玻璃化冷凍液中45～60 s后將囊胚置于冷凍載桿上，迅速浸入液氮中保存。解凍時將載桿迅速浸入37℃解凍液(TS)中，1 min內將胚胎轉移至稀釋液(DS)中作用3 min，再依次轉移至洗滌液1及2(WS1、WS2)中各作用5 min后再將胚胎轉移至G2 Plus囊胚培養(yǎng)液(Virtrolife，瑞典)中，置37℃、6%CO2、5%O2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，等待移植。

3.內膜準備及囊胚移植：采用人工或自然周期準備內膜，移植日子宮內膜厚度超過7 mm方可移植；在有經驗高年資醫(yī)師指導下行腹部超聲引導下行單囊胚移植。移植后第14日查血HCG，HCG>50 U/L為HCG陽性；移植后28～35 d行B超檢查，見孕囊者為臨床妊娠；移植3個月后復核持續(xù)妊娠和流產。

三、囊胚質量細化評分及囊胚擴張程度分級

1.冷凍囊胚細化評分：我們對Gardner評級后的優(yōu)質囊胚進行細化評分[1-2]：囊胚發(fā)育期數(shù)Ⅲ期計1.5分，IV期計2分，V期計2.5分；內細胞團(ICM)評級A級計1.75分，B級計1.25分；滋養(yǎng)層細胞(TE)A級計1.5分，B級計1.0分。將3個得分累加得出胚胎質量得分。

2.復蘇囊胚擴張分級：原達到冷凍標準的優(yōu)質囊胚經過復蘇培養(yǎng)2 h后，擴張程度表現(xiàn)出差異，常見有四種狀態(tài)：擴張程度不足1/2，甚至部分囊胚不擴(我們稱之為E1)；擴張程度超過1/2但是非完全擴張，空腔擴張不全，可以見到囊胚和透明帶間隙明顯(我們稱之為E2)；擴張程度完全，囊胚在旋轉觀察中可見貼近透明帶，但是囊胚腔未孵化孵出(我們稱之為E3)；擴張程度完全，囊胚在旋轉觀察中可見貼近透明帶，并且囊胚孵化孵出(我們稱之為E4)(圖1)。

圖1 冷凍囊胚復蘇2 h后囊腔擴張情況分級

四、觀察指標

患者一般資料(患者年齡，內膜轉化日子宮內膜厚度，周期數(shù)，不孕年限和體重指數(shù)(BMI)；不同發(fā)育速度(D5、D6)及復蘇后囊腔不同擴張程度(E1～E4)囊胚移植的臨床妊娠率(臨床妊娠例數(shù)占總FET周期數(shù)的百分比)、孕早期流產率(孕3月內流產周期數(shù)占妊娠周期數(shù)百分比)、持續(xù)妊娠率[統(tǒng)計日(均已妊娠3個月以上)持續(xù)妊娠周期數(shù)占總FET周期數(shù)的百分比]。

五、統(tǒng)計分析

采用SPSS21.0軟件(IBM，美國)進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)均數(shù)比較采用t檢驗或方差分析，計數(shù)數(shù)據(jù)比較采用卡方檢驗；并采用二分類Logistic回歸分析對相關參數(shù)對臨床妊娠率的影響進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、患者總體資料

本研究總計納入190例優(yōu)質單囊胚FET患者的臨床資料?；颊咂骄挲g為(31.61±4.32)歲，不孕年限為(4.18±2.73)年，BMI為(21.35±4.71)kg/m2，平均周期數(shù)為(1.31±0.73)，移植日子宮內膜厚度為(10.95±2.39)mm。

囊胚復蘇率為100%，臨床妊娠率為60.0%，早期流產率為3.7%，持續(xù)妊娠率為52.6%。

二、囊胚復蘇后不同擴張程度組的妊娠結局

按照復蘇2 h后囊胚不同擴張程度分為E1～E4組。不同組別間年齡、不孕年限、BMI、子宮內膜厚度和胚胎質量評分均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；各組間HCG陽性率和臨床妊娠率均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，HCG陽性率和臨床妊娠率排序相同，依次為E3、E2、E4、E1；各組間持續(xù)妊娠率有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，從高到低依次為E3、E4、E2、E1；各組間早期流產率有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，在E2組達到18.8%，在E3組為7.0%，在E4組為1.9%(表1)。

三、不同發(fā)育速度單囊胚FET周期移植結局比較

不同發(fā)育速度(D5、D6)優(yōu)質單囊胚FET周期比較，患者基礎數(shù)據(jù)一般臨床妊娠資料(不孕年限、年齡、 BMI、平均周期數(shù)、移植日子宮內膜厚度和胚胎質量評分)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；D5臨床妊娠、早期流產和持續(xù)妊娠情況均優(yōu)于D6，但均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表1 復蘇囊胚不同擴張程度組基本情況和FET周期結局[(-±s)，n(%)]

表2 不同發(fā)育速度囊胚FET周期結局[(-±s)，n(%)]

四、臨床妊娠影響因素分析

采用二分類Logistic 回歸分析。在校正可能混雜因素后，Ⅲ期及Ⅲ期以上優(yōu)質冷凍囊胚復蘇后擴張程度對于持續(xù)妊娠具有顯著影響[OR=0.19，95%CI(0.03，1.05)，P=0.037]，其他因素如發(fā)育期數(shù)、ICM評級、TE評級、內膜厚度、周期數(shù)、不孕年限、胚胎總體評分和內膜準備方案均無顯著影響(P>0.05)(表3)。

表3 優(yōu)質單囊胚FET持續(xù)妊娠影響因素Logistic分析

討 論

本研究結果顯示，在基礎條件保持一致的前提下，復蘇的優(yōu)質冷凍囊胚擴張程度與妊娠結局具有密切關聯(lián)。各組別間FET周期結局指標(HCG陽性率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率)最佳的是E3組，最差是E1組；在HCG陽性率和臨床妊娠率中，E2組優(yōu)于E4組，但是持續(xù)妊娠率則剛好相反，主要是E2組流產率遠高于E4組(18.8% vs. 1.9%)(詳見表1)。綜合分析可知，復蘇囊胚擴張程度小于1/2的組別(E1)妊娠結局不理想，不完全擴張(包含E1和E2組)囊胚持續(xù)妊娠率低于其他組別；培養(yǎng)2 h后，囊胚有無孵出對于持續(xù)妊娠率影響不大。

在胚胎選擇上，形態(tài)學評價是目前最為重要且應用最為廣泛的方法。目前，對于囊胚移植的形態(tài)學選擇主要基于胚胎發(fā)育速度、內細胞團(ICM)評級和滋養(yǎng)層(TE)評級[1-2]。最近，Zhao等[3]研究顯示，凍融囊胚移植中，囊胚發(fā)育速度對臨床妊娠率呈現(xiàn)顯著影響，而患者年齡、不孕不育原因、胚胎冷凍處理方式、內膜藥物準備方式、ICM和TE評分對于臨床妊娠率均無顯著影響。在胚胎體內發(fā)育中，ICM在母體內會發(fā)育為胎兒，而TE則發(fā)育為母體和胎兒的連接部分，提供營養(yǎng)、免疫、發(fā)育和代謝等通道作用[1]。在胚胎選擇上，普遍觀點是ICM評級優(yōu)于TE評級[1-2]。同時，早在2011年，Goto等[4]發(fā)現(xiàn)在1 488例單囊胚凍融移植中，囊胚發(fā)育速度對于妊娠結局影響顯著大于ICM/TE評分；2016年Du等[5]也證實囊胚發(fā)育速度相較于ICM/TE評分在新鮮或者凍融胚胎移植周期具有更好的預測活產率潛能。本研究采用上述觀點，首次對囊胚進行了賦分評價：并且予以同級別的ICM較同級別的TE高0.25分的賦值，IV期囊胚得分高于最優(yōu)質的ICM評分0.25分(具體評分細節(jié)見方法部分)。研究發(fā)現(xiàn)：在入組的研究對象中，不同復蘇后擴張程度(E1～E4)的優(yōu)質囊胚得分并無明顯差異，其他一般基礎資料(女性年齡、不孕年限、體重指數(shù)、周期數(shù)和移植日子宮內膜厚度)均無明顯差異，但是其妊娠結局卻顯示出統(tǒng)計學差異，我們直觀看到原始擴張優(yōu)質囊胚在復蘇后的擴張狀態(tài)可以有效預測其臨床結局。

隨后，我們又分析了入組樣本不同冷凍日(D5和D6)患者組的基礎資料和妊娠結局。結果顯示，不同冷凍日囊胚的女性年齡、不孕年限、體重指數(shù)、周期數(shù)、囊胚質量評分和移植日子宮內膜厚度均無顯著差異；D5優(yōu)質單囊胚的臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率均稍優(yōu)于D6優(yōu)質單囊胚，且流產率偏低，但均無顯著差異。方媛等[6]研究顯示，非優(yōu)質胚胎囊胚凍融移植周期中，低級別囊胚凍融移植成功率較低，D5囊胚較D6囊胚具有更高的移植成功率。該結論部分支持了我們的結果，但沒有揭示優(yōu)質單囊胚移植后妊娠結局的關鍵因素。本研究采用優(yōu)質囊胚為研究對象，減少了胚胎質量差異對妊娠結局的影響。張怡等[7]研究表明，不同時間形成優(yōu)質的囊胚(D5、D6)，囊胚發(fā)育速度對FET周期單囊胚移植結局影響不大；Gardner等[1]在2017年也報道，囊胚發(fā)育時期和/或ICM/TE情況并不顯著影響單囊胚移植的臨床妊娠率；邱乒乒等[8]也發(fā)現(xiàn)，囊胚復蘇周期移植成功率與囊胚發(fā)育天數(shù)無關；黎佩怡等[9]2020年也報道，復蘇周期單囊胚移植中，對于優(yōu)質囊胚，內細胞團和滋養(yǎng)層細胞的形態(tài)學評分差異對于妊娠結局無顯著影響，均可選擇用于復蘇周期移植；而王雪等[10]研究表明，單囊胚的凍融周期移植時，優(yōu)先選擇D5的優(yōu)質胚胎。我們的研究與上述多數(shù)研究[1，7-9]結果吻合。

最后，我們采用Logistic回歸分析探究優(yōu)質單囊胚FET的關鍵影響因素。結果顯示，冷凍復蘇后的胚胎恢復擴張程度是持續(xù)妊娠率的顯著且獨立因素，而與患者年齡、周期數(shù)、發(fā)育期數(shù)、發(fā)育速度、ICM評級、TE評級、子宮內膜準備方案、胚胎評分和不孕年限等均無顯著關系。這或許與本研究選擇了優(yōu)質單囊胚行FET有關系。同時，諸多的研究表明囊胚擴張程度與早期胚胎定植有密切關系，這些研究表明囊胚擴張與透明帶內孵化、HCG介導的子宮內膜的信號傳導、粘附和浸潤有關聯(lián)[11-14]。這也從側面解釋了本研究中冷凍復蘇后囊胚復蘇擴張程度為何相較于胚胎發(fā)育速度、TE和ICM具有更強的預測持續(xù)妊娠的能力，復蘇后胚胎擴張程度一定程度反映了胚胎活性及其移植后發(fā)育潛能。夏夢等[15]分析了復蘇后IV～VI期囊胚移植的妊娠結局，移植前囊胚腔擴張程度與臨床妊娠率及活產率并無顯著相關性；通過分析該文獻可知，該研究并未對不同擴張時期的影響妊娠結局的基礎資料加以分析，未排除胚胎質量、年齡或移植日子宮內膜厚度等差異帶來的影響。

伴隨囊胚培養(yǎng)體系的完善和培養(yǎng)試劑的優(yōu)化，現(xiàn)階段囊胚培養(yǎng)成功率和優(yōu)胚率逐步提高。后續(xù)實驗中，我們也可對于部分優(yōu)質胚胎在冷凍復蘇后延長體外培養(yǎng)時間，在不同時間節(jié)點收集胚胎培養(yǎng)液成分分析，確定胚胎持續(xù)發(fā)育的關鍵因子；同時采用不同培養(yǎng)時間、擴張程度和臨床結局的關聯(lián)分析，可為輔助生殖人工智能技術的完善提供更多可靠參數(shù)。此外，本研究為單中心優(yōu)質單囊胚FET周期研究，今后可增加擴大樣本量，實施多中心隨機對照試驗，評價終點至活產率，進一步評價囊胚復蘇后擴張程度作為移植形態(tài)學指標的參考價值。

綜上所述，優(yōu)質單囊胚冷凍復蘇后囊胚非完全擴張的囊胚妊娠結局欠佳，囊胚復蘇擴張程度可以作為單胚胎選擇的一個重要參數(shù)。