白璐，吳利英，呂艷紅，楊紅

(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710032)

卵巢癌是最為常見的惡性腫瘤之一，目前排在婦科惡性腫瘤的第三位，近年來發(fā)病率呈現(xiàn)升高趨勢，手術(shù)治療是臨床根治卵巢癌的方法之一，但是術(shù)后患者存在較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，因此通過尋找早期可靠的血清學(xué)指標(biāo)對卵巢癌病情發(fā)展變化進(jìn)行判斷對于改善患者治療效果具有重要意義[1]。錯(cuò)配修復(fù)蛋白MutL同系物1(MLH1)屬于人體DNA錯(cuò)配修復(fù)基因家族重要的成員，其突變后會(huì)導(dǎo)致修復(fù)基因的功能缺失，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。蛋白質(zhì)精氨酸甲基化在生物體內(nèi)廣泛存在且具有重要作用，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(PRMT5)屬于催化此過程的關(guān)鍵酶，對細(xì)胞增殖、凋亡均具有重要作用，在多種惡性腫瘤呈現(xiàn)過度表達(dá)，但是對于兩種因子在卵巢癌中的研究相對少見[2]。本研究分析了MLH1和PRMT5在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，以期為臨床提供指導(dǎo)和依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年1月至2019年8月中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院保存的卵巢癌組織標(biāo)本132例作為卵巢癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)病理學(xué)確診；(2)術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療；(3)臨床資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；(2)合并有自身免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等其他嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病。選取同期因全子宮雙側(cè)附件切除術(shù)獲得的正常卵巢組織80例作為對照組。

二、試劑與方法

1.主要試劑及儀器：MLH1與PRMT5小鼠抗人單克隆抗體、DAB 染色液(北京中杉金橋)；Leica ASP300 S組織脫水機(jī)、Leica EG1150石蠟包埋機(jī)、Leica RM2255轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(萊卡，德國)；蘇泊爾YL206 G1高壓鍋(蘇泊爾，法國)；DNP-9272電熱恒溫箱(上海精宏)。

2.實(shí)驗(yàn)方法：采取免疫組化法對MLH1和PRMT5進(jìn)行測定。標(biāo)本在4%中性甲醛溶液中進(jìn)行固定6 h，石蠟包埋后進(jìn)行切片，厚度為3 μm；58℃烤箱烘干溶蠟3 h，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精進(jìn)行水化，高壓鍋抗原熱修復(fù)3 min，PBS洗滌3次；一抗(稀釋比例1∶100)4℃孵育過夜后再次PBS洗滌3次，滴加二抗(稀釋比例1∶100)PBS洗滌3次；DAB顯色后自來水沖洗10 min，蘇木精復(fù)染60 s，1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗返藍(lán)、脫水，中性樹膠封片。隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)高倍視野中陽性細(xì)胞所占百分比，陽性細(xì)胞率大于20%為陽性表達(dá)，按照陽性表達(dá)例數(shù)與總例數(shù)計(jì)算陽性表達(dá)率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0軟件。計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析，生存曲線采用Kaplan-Meier法描繪，比較采用Log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

一、卵巢癌和正常卵巢組織中MLH1、PRMT5的表達(dá)

MLH1、PRMT5主要表達(dá)于卵巢上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中(圖1)。卵巢癌組MLH1陽性表達(dá)率顯著低于對照組(P<0.05)，而PRMT5陽性表達(dá)率顯著高于對照組(P<0.05)(表1)。

A：卵巢癌組MLH1(×400)；B：卵巢癌組PRMT5(×400)；C：對照組MLH1(×200)；D：對照組PRMT5(×200)圖1 MLH1和PRMT5在卵巢組織中的定位(免疫組化染色)

表1 卵巢癌和正常卵巢組織MLH1、 PRMT5表達(dá)率[n(%)]

二、MLH1、PRMT5表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征關(guān)系

FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期組織MLH1陽性表達(dá)率顯著低于Ⅰ～Ⅱ期組織(P<0.05)；FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織PRMT5陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.05)(表2)。

表2 MLH1、PRMT5表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征關(guān)系

三、卵巢癌組織中MLH1和PRMT5相關(guān)性分析

MLH1陽性PRMT5陰性的病例有44例，MLH1陰性PRMT陽性的病例有61例，二雙陽性和雙陰性分別只有21例和6例，卵巢癌組織中MLH1與PRMT5表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.605，P<0.05)(表3)。

表3 卵巢癌組織中MLH1和PRMT5相關(guān)性分析

四、MLH1與PRMT5表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

MLH1陽性/PRMT5陰性表達(dá)患者中位總體生存時(shí)間為19.80(12，25)個(gè)月，顯著高于MLH1陰性/PRMT5陰性患者[12.40(7，14)個(gè)月]、MLH1陽性/PRMT5陽性患者[10.40(6，14)個(gè)月]和MLH1陰性/PRMT5陽性患者[8.40(5，10)個(gè)月](P<0.05)(圖2)。

A：MLH1陽性/PRMT5陽性；B：MLH1陽性/PRMT5陰性； C：MLH1陰性/PRMT5陽性；D：MLH1陰性/PRMT5陰性圖2 不同MLH1與PRMT5表達(dá)組的生存曲線

討 論

卵巢癌是臨床女性最為常見的惡性腫瘤之一，幾年來發(fā)病率呈現(xiàn)升高趨勢，對女性生命健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，有報(bào)道指出卵巢癌的分期對患者預(yù)后產(chǎn)生嚴(yán)重影響，I期患者五年生存率可高達(dá)90%以上，而晚期卵巢癌患者五年生存率則僅為25%左右[3]。目前臨床卵巢癌患者多數(shù)就診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，因此早期診斷對于指導(dǎo)臨床治療和改善預(yù)后具有重要意義[4-5]。傳統(tǒng)的診斷方法是采取組織學(xué)檢查，但是卵巢的位置極為特殊，因此組織學(xué)檢查在卵巢癌的早期診斷中價(jià)值有限[6]。影像學(xué)檢查一直也是卵巢癌診斷的重要方法，常用的有超聲、CT以及核磁共振檢查，但是在檢查過程中可能受到醫(yī)師主觀因素影響，而且部分檢查具有輻射性，且費(fèi)用高昂，在基層醫(yī)院使用受到限制[7-8]。血清學(xué)指標(biāo)雖然是臨床診斷卵巢癌的重要依據(jù)，但是腫瘤標(biāo)記物種類較多，而且影響因素較多，在部分子宮內(nèi)膜異位或者盆腔炎癥病變中也會(huì)升高，因此臨床特異性不高[9]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)腫瘤最主要的生物學(xué)特征是侵襲與轉(zhuǎn)移，正常細(xì)胞在病理狀態(tài)下失去了極性轉(zhuǎn)換的活動(dòng)能，腫瘤細(xì)胞在原發(fā)灶生長增殖，隨著黏附松解而脫落，同時(shí)釋放多種蛋白水解酶水解胞外基質(zhì)、基膜，組織間隙被破壞導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向局部浸潤或經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)向遠(yuǎn)處縱深發(fā)展[10-11]。

本研究MLH1和PRMT5在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，目前認(rèn)為人體基因失活一方面是遺傳學(xué)機(jī)制造成，基因缺失或者突變均會(huì)導(dǎo)致基因序列改變，屬于不可逆性改變，另一方面表觀遺傳學(xué)機(jī)制則是核苷酸序列未出現(xiàn)變化，基因通過化學(xué)修飾包括甲基化、非編碼等造成基因表達(dá)受到影響，具有可逆性[12-13]。錯(cuò)配修復(fù)基因功能異常是導(dǎo)致腫瘤基因激活、抑癌基因失活和細(xì)胞周期改變的重要原因，最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡變與腫瘤發(fā)生發(fā)展。MLH1是錯(cuò)配修復(fù)基因家族重要的成員，該基因啟動(dòng)子出現(xiàn)高甲基化后表達(dá)水平降低，造成DNA堿基錯(cuò)配修復(fù)能力降低，DNA復(fù)制過程出現(xiàn)錯(cuò)誤，誘發(fā)了腫瘤的發(fā)生[14]。既往研究認(rèn)為MLH1屬于細(xì)胞保護(hù)性蛋白，MLH1蛋白缺失也會(huì)造成腫瘤細(xì)胞難以應(yīng)對DNA損傷時(shí)對腫瘤細(xì)胞自身的影響，而且在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)其基因表達(dá)同腫瘤生物學(xué)行為關(guān)系密切，但是基因表達(dá)同腫瘤分級、分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則不具有相關(guān)性[15-16]。人體正常細(xì)胞的增殖分化依靠細(xì)胞有序的周期性活動(dòng)，PRMT5對細(xì)胞周期G1期調(diào)控具有重要作用[17]。有學(xué)者在乳腺癌患者中研究發(fā)現(xiàn)PRMT5會(huì)引發(fā)G1期阻滯、S期顯著縮短，從而抑制細(xì)胞增殖過程[18]。還有學(xué)者證實(shí)了PRMT5表達(dá)下降后細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子-1的表達(dá)會(huì)升高，抑制細(xì)胞生長，PRMT5直接甲基化還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，但是臨床對于其在卵巢癌中的具體作用機(jī)制還未明確[19]。目前證實(shí)PRMT5在細(xì)胞正常生長、分化和發(fā)展方面具有關(guān)鍵作用，其過度表達(dá)同腫瘤細(xì)胞的過度增長有關(guān)，通過抑制其表達(dá)可以引發(fā)抑癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制和細(xì)胞生長變慢，說明其具有成為卵巢癌基因治療靶基因的潛力[20]。

本研究顯示，卵巢癌組織MLH1陽性表達(dá)率明顯低于正常卵巢組織，而PRMT5陽性表達(dá)率明顯高于正常卵巢組織，說明在卵巢癌組織中MLH1陽性降低，PRMT5陽性表達(dá)升高。FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期組織MLH1陽性表達(dá)率顯著低于Ⅰ～Ⅱ期組織；FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織PRMT5陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，說明MLH1同卵巢癌分期有關(guān)，而PRMT5同卵巢癌的分期、分化程度以及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織MLH1與PRMT5表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。通過繪制生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，MLH1陰性PRMT5陽性表達(dá)患者中位總體生存時(shí)間19.80個(gè)月長于MLH1陰性PRMT5陰性、MLH1陽性PRMT5陽性和MLH1陽性PRMT5陰性患者，這有助于對臨床醫(yī)師對患者預(yù)后進(jìn)行早期預(yù)判。本研究優(yōu)勢在于證實(shí)了卵巢癌組織中MLH1與PRMT5表達(dá)情況，為臨床合理尋找評估患者分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移尋找了新的分子生物學(xué)指標(biāo)，但是本研究隨訪時(shí)間短，入組患者數(shù)量較少，而且受到多種因素影響可能導(dǎo)致結(jié)果存在偏倚，因此還需擴(kuò)充樣本量、長期隨訪深入分析。

綜上所述，卵巢癌組織MLH1表達(dá)下調(diào)而PRMT5表達(dá)上調(diào)，與臨床病理特征有一定關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。