蕭振邦，黃曉洋，陳佳麗，楊勝濤，劉 怡，千忠吉,3

鮑魚(yú)腸多肽對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC炎癥的抑制作用

蕭振邦1，黃曉洋1，陳佳麗2,3，楊勝濤2，劉 怡1，千忠吉1,3

（1. 廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；3. 廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108）

【】探究序列為KVEPQDPSEW的鮑魚(yú)腸多肽AATP對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎作用。用“MTT”法檢測(cè)細(xì)胞活力，“DCFH-DA”法測(cè)定活性氧（ROS）的含量，用蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和內(nèi)皮素-1（ET-1）以及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)白細(xì)胞介素-6（IL-6）的釋放量，分子對(duì)接分析AATP與Toll樣受體（TLR4）蛋白的相互作用。“MMT”法證明AATP對(duì)HUVEC細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用（> 0.05），且能提高脂多糖（LPS）誘導(dǎo)組的HUVEC細(xì)胞活力（< 0.05）；與對(duì)照組相比，隨著實(shí)驗(yàn)組AATP濃度增加，ROS含量明顯逐漸減少（< 0.05），內(nèi)皮炎癥因子ICAM-1、VCAM-1、ET-1和IL-6的表達(dá)也明顯逐漸減少（< 0.05），NF-κB信號(hào)通路中p65、I-κBα的磷酸化表達(dá)顯著下降（< 0.05）；對(duì)接結(jié)果表明，AATP與TLR4能形成穩(wěn)定的氫鍵，有相互作用的可能性。AATP表現(xiàn)出很好的清除ROS作用，可明顯抑制HUVEC的炎癥因子的表達(dá)和NF-κB信號(hào)通路的激活。

鮑魚(yú)；多肽；HUVEC；抗炎；脂多糖

當(dāng)前全世界心血管疾病的死亡率居高不下[1]，其中動(dòng)脈粥樣硬化是觸發(fā)心血管疾病的關(guān)鍵因素[2]。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，通常表現(xiàn)為血管炎癥、內(nèi)皮功能障礙、膽固醇積聚等病理特征[3]。開(kāi)發(fā)出針對(duì)炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙的藥物降低死亡率，已成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌感染引起的炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化間有著緊密聯(lián)系[4]。由于傳統(tǒng)抗生素直接治療動(dòng)脈粥樣硬化的效果并不理想，尋找非抗生素藥物來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素藥物，成為動(dòng)脈粥樣硬化治療的新研究方向。肽和肽類(lèi)藥物調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)是一個(gè)自然調(diào)節(jié)的過(guò)程，用其來(lái)控制人體對(duì)細(xì)菌感染的基本先天反應(yīng)，可以最大限度地降低發(fā)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。這種使用肽和肽類(lèi)藥物來(lái)增強(qiáng)抗感染反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)同時(shí)減少有害的促炎反應(yīng)的治療方式已成為研究學(xué)者關(guān)注的方向[5]。大量研究表明，許多肽和肽類(lèi)藥物顯示出良好的活性，如在高血壓等心血管疾病方面[6]，尤其是在LPS引起的炎癥反應(yīng)方面[7]。

鮑魚(yú)作為一種含有優(yōu)良蛋白質(zhì)、脂肪酸和多糖的海生腹足動(dòng)物，有海洋“軟黃金”的美稱(chēng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，從鮑魚(yú)中提取的活性物質(zhì)具有抗癌、抗菌和抗炎的能力[9-11]。多肽Lys-Val-Glu-Pro-Glu-Asp- Pro-Ser-Glu-Trp (AATP)是近期從皺紋盤(pán)鮑(Hannai)腸道中提取純化出的一種新型多肽，已發(fā)現(xiàn)AATP具有抑制癌細(xì)胞遷移和抑制血管生成的抗腫瘤作用[12]，表明AATP有較好的抗癌能力。而AATP作為從鮑魚(yú)腸道中提取的活性物質(zhì)，其抑制炎癥反應(yīng)的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以活性氧（ROS）的清除效果和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)以及NF-κB信號(hào)通路活化情況來(lái)研究AATP的抗炎作用，并通過(guò)分子對(duì)接的方法預(yù)測(cè)AATP與TLR4的作用機(jī)制，從而揭示AATP在脂多糖（LPS）促炎過(guò)程中的影響，以期為鮑魚(yú)腸多肽應(yīng)用在海洋生物活性成分研究上提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC購(gòu)于蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；鮑魚(yú)腸多肽AATP（KVEPQDPSEW，1 214.30 u）在本課題組之前的研究中獲得[12]，保存溫度≤-20 ℃；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素（雙抗）、胎牛血清FBS購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)于上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；BCA蛋白試劑盒、預(yù)染蛋白marker購(gòu)于上海賽默飛世爾科技有限公司；脂多糖LPS、2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針、細(xì)胞裂解液、PMSF、5X蛋白上樣緩沖液等購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗鼠源ICAM-1、VCAM-1、ET-1、p-p65、p65、p-I-κBα、I-κBα、二抗羊抗鼠IgG購(gòu)于Santa Cruz生物技術(shù)公司；人IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)于深圳欣博盛生物科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液和0.22 μm硝酸纖維素膜NC膜購(gòu)于GE Amersham公司。

1.1.2 儀器和設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱，松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；酶標(biāo)儀，Bioteck儀器公司；倒置熒光顯微鏡，日本東京奧林巴斯有限公司；小型垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)槽，Bio-Rad公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞放在體積分?jǐn)?shù)為1%雙抗和體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM中于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2氣體的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)細(xì)胞設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組：空白組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）、對(duì)照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基+100 ng/mL LPS）、實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞+培養(yǎng)基+100 ng/mL LPS+不同濃度AATP）。

1.2.2 樣品毒性檢測(cè) HUVEC細(xì)胞在96孔板（4×105mL-1，100 μL）中培養(yǎng)24 h。隨后加入新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基和AATP（10、30、50 μmol/L）孵育24 h。移去培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入100 μL MTT溶液（1 mg/mL），然后放入37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。移去MTT，并加入100 μL DMSO充分振蕩溶解甲瓚晶體。使用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處的光密度。

1.2.3 AATP對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC的保護(hù)作用 根據(jù)陳佳麗等的[13]方法，通過(guò)“MTT”法評(píng)估測(cè)定細(xì)胞毒性。HUVEC細(xì)胞在96孔板（4×104mL-1，100 μL）中培養(yǎng)24 h。隨后加入新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基和AATP（10、50 μmol/L）預(yù)處理1 h后，加入LPS（100 ng/mL）孵育24 h，LPS誘導(dǎo)濃度參考了Mancilla-Herrera等[14]方法。移去培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中加入100 μL MTT溶液（1 mg/mL），然后放入37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育4 h。移去MTT，并加入100 μL DMSO充分振蕩溶解甲瓚晶體。使用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處的光密度。

1.2.4 ROS的測(cè)定 通過(guò)測(cè)定DCFH-DA的熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定HUVEC中ROS的產(chǎn)生。將HUVEC接種于24孔板（3×105mL-1）中，用不同濃度ATTP（10、50 μmol/L）預(yù)處理1 h，然后用LPS（100 ng/mL）孵育24 h。隨后用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞3次，加熒光探針（每孔500 μL 10 μmol/L DCFH-DA）后，在培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。用熒光倒置顯微鏡拍照，并用Image J軟件分析。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) HUVEC細(xì)胞在6孔板（5×106mL-1）中培養(yǎng)。用AATP（10、50 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后用LPS（100 ng/mL）處理細(xì)胞24 h。用4 ℃預(yù)冷PBS洗滌HUVEC細(xì)胞，然后在冰上用溶解緩沖液溶解30 min，用Pierce-BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白質(zhì)（20 ~ 40 μg）用體積分?jǐn)?shù)10% SDS-PAGE進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維NC膜上。在室溫下，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶在TBST中封閉膜。4 h后，用一抗（稀釋比例為1∶500）在4 ℃下孵育過(guò)夜。在室溫下用二抗（稀釋比例為1∶4 000）孵育2 h，然后用TBST洗滌4次。最后，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)膜進(jìn)行顯色觀察并拍照記錄。

1.2.6 酶聯(lián)免疫分析 HUVEC細(xì)胞在6孔板（5×106mL-1）中培養(yǎng)。用AATP（10、50 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞1 h，然后用LPS（100 ng/mL）處理細(xì)胞24 h。24 h后12 000 r/min離心10 min后提取上清液。根據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行IL-6含量測(cè)定。

分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，取出實(shí)驗(yàn)所需孔板，每孔加入100 μL的不同濃度上清液和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育90 min；洗板5次，甩盡孔中液體后，加入100 μL的生物素抗體工作液，在37 ℃孵育60 min；洗板5次，甩盡孔中液體后，加入100 μL的酶結(jié)合物工作液，在37 ℃避光孵育30 min；洗板5次，甩盡孔中液體后，每孔加100 μL顯色液，37 ℃避光孵育15 min；最后每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)，藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色，混勻后立刻利用酶標(biāo)儀檢測(cè)在波長(zhǎng)為450 nm處的光密度。根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算IL-6的分泌量。

1.2.7 分子對(duì)接模擬 從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/PDB/）下載TLR4（PDB代碼：2Z64）的三維晶體結(jié)構(gòu)。為了模擬受體活性位點(diǎn)與配體分子的相互作用，使用了Discovery Studio 3.5中的CDOCKER算法。采用高分子動(dòng)力學(xué)方法隨機(jī)搜索小分子（AATP）的構(gòu)象，并采用模擬退火方法優(yōu)化受體活性位點(diǎn)（TLR4）的構(gòu)象，進(jìn)行CDOCKER對(duì)接研究。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)分析得出的，并用平均值±SD表示。采用SPSS statistics 25進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，Image J、Graphpad Grism 5.0軟件進(jìn)行分析制圖。所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，顯著性水平為為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

如圖1所示，不同濃度處理組的AATP對(duì)HUVEC細(xì)胞活力無(wú)明顯影響（> 0.05），這說(shuō)明AATP在10 ~ 50 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)HUVEC細(xì)胞無(wú)毒性作用，可選用該范圍的濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 AATP對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用

如圖2所示，與空白組相比，LPS的刺激明顯降低細(xì)胞活力（< 0.05）。與對(duì)照組相比，50 μmol/L以上的AATP可使細(xì)胞相對(duì)活力提高（< 0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在50 μmol/L濃度范圍內(nèi)，AATP對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞表現(xiàn)了保護(hù)作用。

凡含一個(gè)相同字母表示差異不顯著（P > 0.05）

凡含一個(gè)相同字母表示差異不顯著（P > 0.05）

2.3 AATP對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的ROS清除作用

如圖3、4所示，與空白組相比，對(duì)照組LPS誘導(dǎo)后的ROS水平有明顯升高（< 0.05）。AATP處理保護(hù)的樣品組ROS水平降低。顯然，AATP以劑量依賴(lài)的方式顯著抑制ROS的產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L AATP可有效降低LPS誘導(dǎo)的ROS生成（< 0.05）。

2.4 AATP對(duì)LPS誘導(dǎo)后HUVEC黏附因子和血管收縮因子的表達(dá)

如圖5~8所示，通過(guò)分析各組條帶灰度可知，與空白組相比，LPS的刺激明顯增加了黏附因子ICAM-1、VCAM-1和血管收縮因子ET-1的表達(dá)（< 0.05），隨著10、50 μmol/L AATP濃度處理，其表達(dá)有顯著性下調(diào)（< 0.05）。

圖3 不同濃度AATP對(duì)HUVEC細(xì)胞的清除ROS作用

凡含一個(gè)相同字母表示差異不顯著（P > 0.05）

圖5 LPS誘導(dǎo)后HUVEC細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、ET-1的表達(dá)

凡含一個(gè)相同字母表示差異不顯著（P > 0.05）

凡含一個(gè)相同字母表示差異不顯著（P > 0.05）

凡含一個(gè)相同字母表示差異不顯著（P > 0.05）

2.5 AATP對(duì)LPS誘導(dǎo)后NF-κB信號(hào)通路的阻斷作用

如圖9~11所示，通過(guò)分析各組條帶灰度可知，與空白組相比，LPS的刺激明顯提高了p-p65、p-I-κBα的水平（< 0.05），隨著10、50 μmol/L AATP濃度處理，其表達(dá)有顯著性下調(diào)（< 0.05）。這表明AATP可以通過(guò)抑制p65、I-κBα的磷酸化從而達(dá)到阻斷NF-κB信號(hào)通路的作用。

圖9 LPS誘導(dǎo)后HUVEC細(xì)胞p-p65、p65、p-I-κBα、I-κBα的表達(dá)情況

凡含一個(gè)相同字母表示差異不顯著（P > 0.05）

凡含一個(gè)相同字母表示差異不顯著（P > 0.05）

2.6 AATP對(duì)IL-6的抑制作用

通過(guò)酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定AATP對(duì)IL-6分泌量的影響。如圖12所示，與空白組相比，加入LPS的對(duì)照組的IL-6分泌量有顯著增加（< 0.05）。與對(duì)照組相比，加入50 μmol/L AATP HUVEC細(xì)胞的IL-6分泌量顯著下降（< 0.05）。說(shuō)明在LPS的刺激下，AATP具有下調(diào)HUVEC細(xì)胞IL-6分泌量的作用。

2.7 AATP與TLR4的相互作用

利用分子對(duì)接檢測(cè)AATP與TLR4配體之間的相互作用。通過(guò)模擬分子對(duì)接Discovery Studio軟件得到AATP與TLR4配體的可能結(jié)合位點(diǎn)，取結(jié)合能最小值的構(gòu)象作為最佳構(gòu)象結(jié)果。圖13a所示關(guān)于AATP-TLR-4對(duì)接的CDOCKER結(jié)果結(jié)合能為-201.64 kJ/mol。如圖13b，AATP與TLR4的Asp403和Arg380產(chǎn)生2個(gè)氫鍵，鍵長(zhǎng)為1.86×10-10m和2.75×10-10m。

凡含一個(gè)相同字母表示差異不顯著（P > 0.05）

圖13 AATP與TLR4的分子對(duì)接三維圖（a）和二維圖（b）

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素的炎癥性疾病，其發(fā)生與內(nèi)皮功能障礙有關(guān)，而TLR-4牽涉其中這些炎癥過(guò)程，包括損傷性自由基的形成、內(nèi)皮功能障礙和促炎因子過(guò)度表達(dá)[15]。大量的研究表明，LPS可以直接作用于HUVEC，使其發(fā)生長(zhǎng)梭狀變形，并引起細(xì)胞黏附因子的分泌和細(xì)胞凋亡，這個(gè)過(guò)程與TLR-4識(shí)別LPS后高度表達(dá)有密切關(guān)系[16-18]。近年來(lái)肽和肽的化合物的抗炎活性越來(lái)越受關(guān)注，例如從馬蹄蟹()血細(xì)胞中提取的TP-1（KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2）[19]。由于多肽具有較高的生物活性和易于合成等特點(diǎn)，在臨床試驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)鮑魚(yú)腸多肽AATP（KVEPQDPSEW）對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVEC具有良好的抗炎作用，這說(shuō)明AATP有成為抗炎藥物的潛力。

之前內(nèi)皮功能障礙的研究中表明，LPS誘導(dǎo)的炎癥與氧化應(yīng)激有關(guān)[20-21]。細(xì)胞內(nèi)過(guò)量ROS可被視為氧化應(yīng)激的原因之一，ROS可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[7]。此外，ROS還可以促進(jìn)促炎因子的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙[22]。AATP對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的ROS清除作用表明AATP具有降低ROS含量的作用，減少內(nèi)皮功能障礙發(fā)生的可能[23]。

在炎癥起始階段，ICAM-1和VCAM-1黏附分子的大量產(chǎn)生是炎癥發(fā)生的重要標(biāo)志。黏附分子與白細(xì)胞結(jié)合后，刺激內(nèi)皮細(xì)胞改變形態(tài)，細(xì)胞間隙可作為白細(xì)胞的遷移通道。降低黏附分子的表達(dá)可有效降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，AATP可以明顯下調(diào)LPS誘導(dǎo)后HUVEC中ICAM-1、VCAM-1、ET-1和IL-6的蛋白含量，這些都是參與白細(xì)胞黏附和調(diào)節(jié)血管收縮的炎癥因子。這預(yù)示著具有阻斷作用的AATP不僅具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，而且具有抗炎作用。HUVEC是ET-1的主要生物來(lái)源[25]，ET-1的大量增加可能預(yù)示著血管收縮功能的失衡并導(dǎo)致血管損傷，引起高血壓從而讓動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展[26]，此外LPS預(yù)處理的HUVEC中ET-1的增加也可能進(jìn)一步促進(jìn)ROS的生成[23]。

TLR4作為主要識(shí)別LPS的受體，在炎癥反應(yīng)中起著重要作用，與動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等心血管疾病有著密切關(guān)系[27]。TLR4識(shí)別LPS后，可以激活細(xì)胞內(nèi)的下游信號(hào)通路NF-κB并且誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-8等炎癥因子的生成[28]，AATP 通過(guò)抑制p65、I-κBα的磷酸化對(duì)NF-κB信號(hào)通路的阻斷說(shuō)明AATP在HUVEC細(xì)胞中可以發(fā)揮作用。分子對(duì)接的結(jié)果表明，AATP與TLR4產(chǎn)生兩個(gè)穩(wěn)定的氫鍵，可能存在對(duì)接位點(diǎn)，具有相互作用的可能性。這說(shuō)明AATP可能通過(guò)與TLR4相互作用的方式，阻斷TLR4-NF-κB通路，有效減少黏附分子、炎癥因子的表達(dá)，

本研究表明，AATP是具有一定的抗炎作用，通過(guò)抑制促炎因子ROS的過(guò)表達(dá)，炎癥相關(guān)的NF-κB信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎作用。同時(shí)可以使內(nèi)皮炎癥因子ICAM-1、VCAM-1、ET-1和IL-6含量下調(diào)，是一種潛在的抑制炎癥反應(yīng)的活性物質(zhì)。但本研究?jī)H從蛋白水平對(duì)相關(guān)炎癥因子進(jìn)行探討，對(duì)基因水平的研究尚不完善，今后的研究可以通過(guò)檢驗(yàn)相關(guān)炎癥因子的mRNA的變化并結(jié)合相關(guān)蛋白水平的研究，去進(jìn)一步驗(yàn)證AATP的抗炎活性。

4 結(jié)論

本研究證明體外實(shí)驗(yàn)中AATP能夠明顯減少HUVEC的ROS生成，表現(xiàn)出很好的清除ROS能力以減緩細(xì)胞損傷，AATP可降低細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，抑制NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。分子對(duì)接結(jié)果表明AATP和TLR4之間能形成穩(wěn)定氫鍵，存在相互作用的可能性。這些結(jié)果表明AATP具有成為潛在抗炎活性物質(zhì)的可能性，并有助于為海洋生物多肽的活性研究提供有效佐證。

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Effect of Abalone Polypeptide on LPS Induced HUVEC Cell Inflammation

XIAO Zhen-bang1, HUANG Xiao-yang1, CHEN Jia-li2,3, YANG Sheng-tao2, LIU Yi1, QIAN Zhong-ji1,3

（1.,,524088,; 2.,,524088,; 3.,518108,）

To analyze the anti-inflammatory effect of abalone intestinal polypeptide AATP sequenced KVEPQDPSEW on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) induced by LPS.MTT method was used to detect cell viability; DCFH-DA was used to detect ROS content; western blotting was used to detect the expression of ICAM-1, VCAM-1, ET-1 and other proteins in the NF-κB signaling pathway, and ELISA test to detect the release of IL-6; molecular docking analysis was used to analyze the interaction between AATP and toll-like receptor (TLR4).MMT method showed that AATP had no significant toxic effect on HUVEC(> 0.05). It could improve the HUVEC viability of LPS induced group（< 0.05）. Compared with the control group, AATP concentration in the experimental group increased, ROS content decreased significantly（< 0.05）. The expression of ICAM-1, VCAM-1, ET-1, IL-6 and phosphorylated p65, phosphorylated I-κBα in the NF-κB signaling pathway decreased gradually（< 0.05）. The docking results showed that AATP and TLR4 could form stable hydrogen bonds, which had the possibility of interaction.AATP can clear ROS and inhibit the expression of inflammatory factors and suppress the activation of NF-κB signaling pathway in HUVEC.

abalone; peptide; HUVEC; anti-inflammatory; LPS

Q71

A

1673-9159（2020）06-0108-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.06.017

蕭振邦，黃曉洋，陳佳麗，等. 鮑魚(yú)腸多肽對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC炎癥的抑制作用[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（6）：108-115.

2020-06-18

廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目（2020A1515011075）

蕭振邦（1995－），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ蠡钚晕镔|(zhì)研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：btplk@sina.com。

黃曉洋（1999－），男，本科生，研究方向?yàn)楹Ｑ蠡钚晕镔|(zhì)研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：784030908@qq.com

千忠吉（1978－），男，博士，副教授，研究方向?yàn)槟虾Ｉ锘钚晕镔|(zhì)的研究與利用。E-mail：zjqian78@163.com

（責(zé)任編輯：劉朏）