馬柏林，羅桂杰，劉 博，譚 軍

（1.江蘇省宿遷市宿豫區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇 宿遷 223800；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223800）

大麗花輪枝孢鋅離子結(jié)合蛋白（Verticillium dahlia Asp-f2 Like，VdAL），是一種新型生物工程蛋白。這種新型蛋白是從絲狀真菌中分離得到的一種胞內(nèi)可溶性蛋白，是不同于Harpin和Elicitin的新型蛋白激發(fā)子，擁有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、促進(jìn)植物生長發(fā)育、改善作物品質(zhì)，可作為一種新型的廣譜、高效、多功能且無毒無害（LD50超過5 000 mg）的生物農(nóng)藥[1]。研究表明，施用VdAL對(duì)水稻具有增產(chǎn)作用[2]。但是，葉面噴施VdAL對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)品質(zhì)的影響，目前尚缺乏試驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此，本試驗(yàn)進(jìn)行了宿曉紅葡萄坐果時(shí)在葉面2次噴施不同濃度VdAL的研究，并測定了不同處理宿曉紅葡萄果實(shí)的生理指標(biāo)，旨在評(píng)價(jià)不同濃度VdAL對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)品質(zhì)的影響，從而為VdAL的田間施用提供實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料：4年生中晚熟葡萄品種——宿曉紅；試劑：VdAL，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院自主研發(fā)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理：①葉面噴施清水（CK）；②葉面噴施VdAL，濃度比例為VdAL∶水=1∶15 000（處理1）；③葉面噴施VdAL，濃度比例為VdAL∶水=1∶7 500（處理2）；④葉面噴施VdAL，濃度比例為VdAL∶水=1∶5 000（處理3）；⑤葉面噴施VdAL，濃度比例為VdAL∶水=1∶3 750（處理4）。2019年5月15日、6月15日分2次噴施樹冠，以葉背濕潤不滴水為宜，采用隨機(jī)區(qū)組排列，每小區(qū)每個(gè)處理隨機(jī)選取3株生長健壯、長勢一致的宿曉紅葡萄進(jìn)行試驗(yàn)。從果實(shí)膨大后期開始，每隔7 d 采樣1次，直至果實(shí)采收，每次采樣選取果穗3 穗，每穗不同部位均勻采取10粒果，每次每個(gè)處理共采收30粒果，測定宿曉紅葡萄的生長發(fā)育狀況，計(jì)算平均值。

1.3 生理指標(biāo)測定方法

1.3.1 果實(shí)發(fā)育指標(biāo)的測定 從花后果實(shí)萼片脫落開始，每隔10 d 用游標(biāo)卡尺測定離地面1.2～2.0 m樹冠冠層內(nèi)30粒果實(shí)的橫、縱徑，計(jì)算平均值。用電子天平稱量每個(gè)處理共30粒果實(shí)的單果質(zhì)量，計(jì)算平均值。

1.3.2 果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的測定 葡萄待測樣液提?。喝∑咸褬颖?，洗凈去皮打汁，過8層紗布，移取10 mL濾液于100 mL 容量瓶中，定容，混勻，吸取5 mL的濾液于稱量瓶中，稱重，于100℃恒溫干燥箱中干燥4 h，冷卻（干燥器），稱重，然后再次烘至恒重（兩次稱量相差小于0.1 mg）。稱取烘干樣品0.5～1.0 g（或干樣粉末5～100 mg），放入大試管，加入15 mL 蒸餾水，在沸水浴中煮沸20 min，取出冷卻，過濾，濾液轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶，并用蒸餾水沖洗殘?jiān)鼣?shù)次，定容至刻度。

1.3.2.1 可溶性固形物含量的測定 折光法[3]測定，3次重復(fù)，取平均值。測定方法：用手提式折光儀測量待測樣液的折光率，在折光儀上直接讀出可溶性固形物（TSS）含量，用“%”表示。

1.3.2.2 可滴定酸含量的測定 指示劑滴定法[4]測定，3次重復(fù)，取平均值。測定方法：取50 g 搗碎后的葡萄漿，定容至200 mL 容量瓶中，搖勻過濾，取50 mL 濾液加入酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH滴定至溶液顏色呈淡紅色，且維持1 min 不褪色，記錄消耗NaOH的體積。

1.3.2.3 可溶性總糖含量的測定 蒽酮—硫酸比色法[5]測定，3次重復(fù)，取平均值。測定方法：吸取1 mL適當(dāng)稀釋樣液，加入5 mL 蒽酮試劑，混勻，于試管口蓋上玻璃球，在沸水中煮沸10 min，取出在流水中冷卻20 min后，在分光光度計(jì)620 nm 波長處比色，以樣液蒸餾水調(diào)零，測定A620nm值。

1.3.2.4 VC含量測定 2.6-二氯靛酚滴定法[6（]GB 5009.86—2016）測定，3次重復(fù)，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理

使用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用SAS 9.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和DUNCAN 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施不同濃度VdAL對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)橫、縱徑的影響

由表1可知，不同濃度VdAL處理對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)橫徑有一定影響。整個(gè)果實(shí)膨大期內(nèi)，除處理3的果實(shí)橫徑在果實(shí)膨大后第7天與處理2、處理4相比差異不顯著（P>0.05）外，其他時(shí)期處理3的果實(shí)橫徑均顯著高于對(duì)照和其他處理（P<0.05）。與果實(shí)膨大后第7天相比，果實(shí)膨大后第42天時(shí)，處理1、處理2、處理3、處理4、對(duì)照宿曉紅葡萄果實(shí)橫徑的增幅分別為42.19%、50.00%、60.43%、49.62%、36.00%。果實(shí)膨大后第42天，處理3的果實(shí)橫徑分別比處理1、處理2、處理4、對(duì)照提高22.53%、12.63%、13.78%、31.18%。由此可見，處理3 能夠顯著提高宿曉紅葡萄的果實(shí)橫徑。

表1 不同處理對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)橫徑的影響 單位：mm

由表2可知，VdAL處理宿曉紅葡萄對(duì)果實(shí)縱徑的影響，與對(duì)果實(shí)橫徑影響的規(guī)律基本相似。果實(shí)膨大后第42天，處理1、處理2的果實(shí)縱徑與對(duì)照相比差異不顯著（P>0.05）；處理3、處理4的果實(shí)縱徑顯著高于對(duì)照（P<0.05），且處理3的果實(shí)縱徑顯著高于處理4（P<0.05），處理3的果實(shí)縱徑分別比處理1、處理2、處理4、對(duì)照提高20.67%、16.77%、14.56%、21.48%。

2.2 噴施不同濃度VdAL對(duì)宿曉紅葡萄單果質(zhì)量的影響

由表3可知，噴施不同濃度VdAL 能顯著增加宿曉紅葡萄單果質(zhì)量。自果實(shí)膨大后第14 天開始，不同處理宿曉紅葡萄的單果質(zhì)量均顯著高于對(duì)照（P<0.05）。整個(gè)果實(shí)膨大期內(nèi)，處理3的單果質(zhì)量除在果實(shí)膨大后第7天與處理2 相比差異不顯著（P>0.05）外，其他時(shí)期均顯著高于對(duì)照和其他處理（P<0.05）。果實(shí)膨大后第42天，處理3的單果質(zhì)量分別比處理1、處理2、處理4、對(duì)照提高32.56%、23.15%、22.77%、95.59%。

2.3 噴施不同濃度VdAL對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)可溶性固形物含量的影響

由表4可知，VdAL處理宿曉紅葡萄能夠增加果實(shí)可溶性固形物的含量。在果實(shí)膨大后第7天、第14天時(shí)，處理1、處理2的果實(shí)可溶性固形物含量與對(duì)照相比差異不顯著（P>0.05）；自果實(shí)膨大后第21 天以后，各處理果實(shí)可溶性固形物含量均顯著高于對(duì)照（P<0.05）。處理3、處理4的果實(shí)可溶性固形物含量在整個(gè)果實(shí)膨大期內(nèi)都顯著高于對(duì)照（P<0.05），尤其是處理3 對(duì)提高果實(shí)可溶性固形物含量有最優(yōu)的促進(jìn)效果。果實(shí)膨大后第42天，處理3的果實(shí)可溶性固形物含量分別比處理1、處理2、處理4、對(duì)照提高71.92%、29.19%、28.76%、105.44%。

表3 不同處理對(duì)宿曉紅葡萄單果質(zhì)量的影響 單位：g

表4 不同處理對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)可溶性固形物含量的影響 單位：%

2.4 噴施不同濃度VdAL對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)可滴定酸含量的影響

由表5可知，VdAL處理宿曉紅葡萄能夠顯著降低果實(shí)可滴定酸含量（P<0.05）。整個(gè)果實(shí)膨大期內(nèi)，各處理果實(shí)可滴定酸含量均顯著低于對(duì)照（P<0.05），各處理間果實(shí)可滴定酸含量也存在差異。果實(shí)膨大后第42天，處理3的果實(shí)可滴定酸含量顯著低于其他處理（P<0.05），分別比處理1、處理2、處理4、對(duì)照降低35.98%、28.60%、16.01%、44.92%。

表5 不同處理對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)可滴定酸含量的影響 單位：g/L

2.5 噴施不同濃度VdAL對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)可溶性總糖含量的影響

由表6可知，VdAL處理宿曉紅葡萄能夠增加果實(shí)可溶性總糖含量。整個(gè)果實(shí)膨大期內(nèi)，各處理果實(shí)可溶性總糖含量均顯著高于對(duì)照（P<0.05），各處理間果實(shí)可溶性總糖含量也存在差異；處理3的果實(shí)可溶性總糖含量顯著高于其他處理（P<0.05）；處理2與處理4 相比，二者的果實(shí)可溶性總糖含量差異不顯著（P>0.05）。果實(shí)膨大后第42天，處理3的果實(shí)可溶性總糖含量分別比處理1、處理2、處理4、對(duì)照提高27.19%、11.69%、11.47%、34.89%。

表6 不同處理對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)可溶性總糖含量的影響 單位：g/L

2.6 噴施不同濃度VdAL對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)VC含量的影響

由表7可知，VdAL處理宿曉紅葡萄對(duì)提高果實(shí)VC含量具有明顯促進(jìn)作用。在果實(shí)膨大后第14天和第21天，處理1的果實(shí)VC含量與對(duì)照相比差異顯著（P<0.05），其他時(shí)期與對(duì)照相比差異不顯著（P>0.05）。在整個(gè)果實(shí)膨大期內(nèi)，處理3、處理4的果實(shí)VC含量均顯著高于對(duì)照（P<0.05）。在果實(shí)膨大后第7天，處理3的果實(shí)VC含量與處理4 相比差異不顯著（P>0.05），與處理1、處理2、對(duì)照相比差異顯著（P<0.05）；其他時(shí)期處理3的果實(shí)VC含量均顯著高于處理1、處理2、處理4和對(duì)照（P<0.05）。果實(shí)膨大后第42天，處理3的果實(shí)VC含量分別比處理1、處理2、處理4、對(duì)照提高45.11%、34.61%、32.73%、51.12%。

表7 不同處理對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)VC含量的影響 單位：μg/g

3 結(jié)論與討論

1978年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)有一種蛋白能夠?qū)χ参锂a(chǎn)生過敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR），這種蛋白主要來源于假單胞菌屬和歐文菌屬[7-9]。該蛋白能夠刺激植物生長發(fā)育、改善作物品質(zhì)，這主要是因?yàn)樵摰鞍啄軌蛘T導(dǎo)植物體內(nèi)系列基因表達(dá)，激活植物自身生長防衛(wèi)系統(tǒng)的類分子蛋白質(zhì)產(chǎn)生持久的系統(tǒng)抗性[1，7]。近年來，我國通過遺傳工程技術(shù)開展蛋白基因的研究和應(yīng)用，取得了一定的成效，VdAL 是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)通過工程菌株發(fā)酵，特殊工藝制備而成的一種蛋白干粉。本試驗(yàn)研究表明，噴施不同濃度的VdAL 均能夠改善宿曉紅葡萄果實(shí)品質(zhì)，尤其是噴施VdAL 濃度為1∶5 000時(shí)，可促進(jìn)宿曉紅葡萄果實(shí)橫徑的增粗和縱徑的增長，促進(jìn)果實(shí)膨大，顯著增加單果質(zhì)量（P<0.05），以及提高果實(shí)中可溶性固形物、可溶性總糖、VC的含量，同時(shí)降低果實(shí)中可滴定酸含量。

趙利輝等[10]研究發(fā)現(xiàn)，激活蛋白可誘導(dǎo)植物的防衛(wèi)反應(yīng)。肖慶會(huì)等[11]研究表明，在龍豐蘋果果實(shí)膨大期對(duì)其噴施不同濃度的蛋白制劑VdAL可以顯著改善蘋果果實(shí)品質(zhì)及提高單果質(zhì)量。孫風(fēng)清等[12]研究表明，育苗期葉面噴施1.25 g/L VdAL可以顯著增強(qiáng)黃瓜幼苗的耐貯運(yùn)性，提高黃瓜商品苗的貯藏質(zhì)量。在本試驗(yàn)中，適宜濃度的VdAL可顯著提高宿曉紅葡萄果實(shí)品質(zhì)（P<0.05）。這可能是因?yàn)閂dAL 競爭結(jié)合E3，釋放轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控防衛(wèi)基因表達(dá)促進(jìn)了宿曉紅葡萄果實(shí)細(xì)胞的橫向生長，激活植物自身生長防衛(wèi)系統(tǒng)的分子蛋白質(zhì)，促進(jìn)葉綠素形成，并間接影響光合作用及糖和VC的形成，補(bǔ)充了果實(shí)生長時(shí)所需的營養(yǎng)元素，因此，噴施適宜濃度的VdAL可顯著提高宿曉紅葡萄果實(shí)品質(zhì)。本試驗(yàn)只進(jìn)行了VdAL對(duì)宿曉紅葡萄果實(shí)品質(zhì)影響的初步探討，對(duì)其作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。