焦健， 朱振軍， 佟志晏，馬俊杰，辛丘巖，張彤彤，李凌霄，孫娜，宋爽*

(1.北京同仁堂健康(大連)海洋食品有限公司， 遼寧 大連 116045; 2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，海洋活性多糖開發(fā)應(yīng)用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116034; 3.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院， 廣西 南寧 530004)

海參是中國的傳統(tǒng)補(bǔ)益食品。其中，刺參(Apostichopusjaponicus)是中國養(yǎng)殖量最大的海參品種，其市場認(rèn)可度高，價格也較高。但目前市場上刺參產(chǎn)品質(zhì)量參次不齊，存在以次充好的現(xiàn)象。海參多糖是海參的重要營養(yǎng)功效成分，大量研究證實(shí)，海參多糖具有抗血栓、降血脂、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤及調(diào)節(jié)腸道菌群等多種功效[1-5]。海參多糖主要包括巖藻糖基化硫酸軟骨素和巖藻聚糖硫酸酯[6-7]。目前刺參中多糖含量的數(shù)據(jù)有限[8]，還未見對海參多糖含量影響因素研究的報(bào)道，因此有必要獲得更多刺參及其制品中海參多糖的含量數(shù)據(jù)，并研究養(yǎng)殖地、養(yǎng)殖方式對海參多糖含量的影響，為刺參產(chǎn)品的質(zhì)量控制和品質(zhì)提升提供參考。

速發(fā)海參是近年盛行的一種新工藝，其優(yōu)勢是泡發(fā)時間短、流程簡單快捷，深受廣大消費(fèi)者喜愛，而目前并未有相關(guān)文獻(xiàn)對速發(fā)海參多糖含量的報(bào)道。針對上述問題，本研究依據(jù)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 3049—2015)的方法[9]，通過高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS/MS)對采集自大連4個不同養(yǎng)殖地的4批次共16份海參樣本中的海參多糖含量進(jìn)行分析測定，比較了養(yǎng)殖地對海參多糖含量的影響，分析了速發(fā)海參產(chǎn)品的多糖含量及其與海參原料中多糖含量的相關(guān)性，并測定了大連和山東地區(qū)46批次海參樣品的多糖含量數(shù)據(jù)，旨在為海參多糖含量研究及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制修訂提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

1.1.1 海參

本實(shí)驗(yàn)所用海參樣本均為刺參(Apostichopusjaponicus)，每份樣本包括5～10只海參，每只新鮮海參重量范圍為100～200 g。

考察養(yǎng)殖地對海參多糖含量影響的實(shí)驗(yàn)中，從4個養(yǎng)殖地(1#～4#)采集了生鮮刺參樣本，4個養(yǎng)殖地均在大連地區(qū)，具體地點(diǎn)為皮口平島(1#)、瓦房店沙山(2#)、瓦房店沙坨子(3#)和鹽場(4#)，其中1#和2#為圈養(yǎng)養(yǎng)殖，3#和4#為底播養(yǎng)殖。在2016年10月至2017年5月間從每個養(yǎng)殖地采集4批生鮮海參，共計(jì)16份生鮮海參樣本。

研究速發(fā)海參多糖含量的實(shí)驗(yàn)中，將采集自1#～4#養(yǎng)殖地的16份生鮮海參分別加工成速發(fā)海參，用于檢測分析。速發(fā)海參加工由北京同仁堂健康(大連)海洋食品有限公司完成。

在海參多糖含量數(shù)據(jù)積累與分析實(shí)驗(yàn)中，又從46個不同的養(yǎng)殖地各采集了一份生鮮海參樣本。這46個養(yǎng)殖地包括大連地區(qū)圈養(yǎng)養(yǎng)殖地4個，底播養(yǎng)殖地8個；山東(包括威海、煙臺、東營和日照等)地區(qū)圈養(yǎng)養(yǎng)殖地16個，底播養(yǎng)殖地18個。采集時間為2016年10月至2017年6月。另外整合了1#～4#養(yǎng)殖地的16份生鮮海參的檢測數(shù)據(jù)，共使用了62份生鮮海參的數(shù)據(jù)。

1.1.2 試劑與設(shè)備

木瓜蛋白酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司。巖藻糖(純度≥99%)和乳糖(純度≥99%)購自Sigma公司。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、半胱氨酸鹽、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、乙酸鉀和甲醇均購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。其他試劑均為分析純。Seven Compact pH計(jì)購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。臺式冷凍離心機(jī)購自Thermo Scientific公司。LC-10AD/4000QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜儀購自日本島津公司和美國ABscix公司。

1.2 海參多糖含量測定

1.2.1 海參多糖制備

參照SC/T 3049—2015[9]方法制備海參多糖：新鮮與速發(fā)海參，剪成0.5 cm ×0.5 cm的小塊，70 ℃烘干12 h，粉碎，過10目篩，混勻備用。準(zhǔn)確稱取各樣品的海參干粉0.1 g，置于錐形瓶中，加入12.5 mL的含有5 mmol/L EDTA溶液和5 mmol/L半胱氨酸的0.1 mol/L乙酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)和10 mg木瓜蛋白酶，于60 ℃恒溫水浴下攪拌，酶解反應(yīng)24 h。然后，將反應(yīng)后的混合物在8 500 rpm/min、20 ℃條件下離心10 min，取上清，加3.10 g乙酸鉀，超聲振蕩混合均勻，于4 ℃靜置12 h。最后，離心(8 000×g，10 min，20 ℃)取沉淀，定容于10 mL容量瓶中，即得海參多糖溶液。

1.2.2 酸水解

取0.5 mL海參多糖溶液于水解管中，加入0.5 mL 4 mol/L的三氟乙酸，密封，在110 ℃條件下水解3 h。冷卻后減壓除去溶劑，再加入0.5 mL甲醇，減壓除去溶劑，重復(fù)以上步驟3次，達(dá)到去除三氟乙酸的目的。配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.20 mg/mL的巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液按以上步驟水解。

1.2.3 PMP衍生化

水解產(chǎn)物用400 μL的氨水溶解，再加入400 μL 0.3 mol/L的PMP甲醇溶液和100 μL 0.5 mg/mL的乳糖內(nèi)標(biāo)溶液，密封，70 ℃水浴30 min。冷卻后減壓除去溶劑，再加入1 mL甲醇，減壓除去溶劑，重復(fù)以上步驟3次。然后加入1%的乙酸水溶液，再加入1 mL的氯仿，振蕩后除去氯仿，重復(fù)萃取3次，水層作為供試液。供試液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，進(jìn)行HPLC-MS/MS液質(zhì)分析。

1.2.4 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：采用Thermo Scientific Hypersil Gold(150.0 mm× 2.1 mm，5 μm)色譜柱。柱溫30 ℃，流動相為20 mmol/L乙酸銨-乙腈(88∶12，V/V)，體積流量0.5 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源ESI+源，噴霧電壓5.5 kV，輔助加熱氣溫度600 ℃，氮?dú)庾鳛榕鲎矚夂蛧婌F氣，多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。其它質(zhì)譜分析參數(shù)見表1[8]。

表1 巖藻糖和乳糖的PMP衍生物的質(zhì)譜分析條件Tab.1 Parameters for MRM analysis of PMP-labeled fucose and lactose

1.3 海參多糖含量計(jì)算

1.3.1 巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線建立

以巖藻糖與乳糖標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度比為橫坐標(biāo)x，以其峰面積比為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在本實(shí)驗(yàn)條件下，配制質(zhì)量濃度為0.02～0.20 mg/mL范圍的系列標(biāo)準(zhǔn)液，最終得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：y=1.579 9x-0.103 1，(R2=0.996)。將得到的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，可得出供試樣品中巖藻糖的濃度，由此濃度轉(zhuǎn)化為海參多糖的濃度。

1.3.2 海參多糖含量計(jì)算

海參多糖含量按照SC/T 3049—2015[9]中的公式計(jì)算，根據(jù)海參樣品中巖藻糖的含量和巖藻糖在海參多糖中的比例，將巖藻糖的含量乘比例系數(shù)(20)，即可計(jì)算出海參多糖的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。利用SPSS 19軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，檢驗(yàn)方差齊性，對不同數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan多重比較，P<0.05表示數(shù)據(jù)差異顯著。采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。利用Excel和Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 養(yǎng)殖地對海參多糖含量的影響

本研究首先分析了采集自4個養(yǎng)殖地的同一批次海參中多糖含量的差異，結(jié)果如圖1A～圖1D所示，所有批次中，2#養(yǎng)殖地的海參中多糖的含量都高于其他3個產(chǎn)地，含量為(94.36±15.71) mg/g(P<0.05)，其次是4#養(yǎng)殖地的海參，為(70.24±8.12) mg/g。整合每個養(yǎng)殖地4個批次海參多糖含量數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖1E，也顯示2#養(yǎng)殖地的海參中多糖含量最高，其次為4#養(yǎng)殖地。以上結(jié)果表明，養(yǎng)殖地對海參中多糖的含量有明顯影響，相較之下2#養(yǎng)殖地海參多糖含量最高。

已有研究表明，養(yǎng)殖方式對海參的生長、存活率、感官、加工性能以及營養(yǎng)成分都有顯著的影響[10-11]。圈養(yǎng)海參蛋白、粗脂肪含量均高于底播養(yǎng)殖海參，而微量元素如硼、鉻和銅元素含量均低于底播養(yǎng)殖海參[12]，但圈養(yǎng)海參常量元素含量卻高于底播養(yǎng)殖海參[10]。本研究中，1#和2#為圈養(yǎng)養(yǎng)殖，3#和4#為底播養(yǎng)殖，兩組間未呈現(xiàn)明顯差異，不能說明養(yǎng)殖方式對海參多糖含量有顯著影響。綜上所述，不同養(yǎng)殖地的生鮮海參中多糖含量差異較大，但原因還有待進(jìn)一步揭示。

2.2 速發(fā)海參多糖含量

表2 速發(fā)海參多糖含量Tab.2 Polysaccharide contents of Sufa sea cucumbers

將2.1部分的16份生鮮海參分別加工為速發(fā)海參后，檢測它們的多糖含量。如表2所示，速發(fā)海參多糖含量在70.9～178.4 mg/g之間波動，其中1# 養(yǎng)殖地的第4批次海參制成的速發(fā)海參多糖含量相對較低，而4# 養(yǎng)殖地的第2批次的含量相對較高。速發(fā)海參相對于生鮮海參原料，多糖含量增加，這可能是因?yàn)楹⒈旧砗?6%(以干海參計(jì))的鹽分[13]，在速發(fā)海參產(chǎn)品加工過程中鹽分被除去使多糖含量相對提高。

為了考察海參原料中多糖的含量與其制成的速發(fā)海參制品多糖含量間的關(guān)系，本研究對16批次生鮮海參與其制成的速發(fā)海參中的多糖含量的進(jìn)行了相關(guān)性分析。由圖2可知，生鮮海參多糖含量與其制成速發(fā)海參的多糖含量不存在顯著相關(guān)性(r=0.16，P>0.05)。該研究結(jié)果說明，海參原料并不能顯著決定其制成的速發(fā)海參產(chǎn)品中的多糖含量，產(chǎn)品的加工過程對速發(fā)海參產(chǎn)品的多糖含量有重要影響。

2.3 海參多糖含量數(shù)據(jù)的積累與分析

限制海參多糖的含量范圍對提升海參的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)有重要意義。為了確定海參多糖的含量范圍，本研究進(jìn)一步檢測了刺參主要養(yǎng)殖區(qū)(大連、煙臺及威海等)46個養(yǎng)殖地的生鮮海參樣本中的多糖含量，并整合前文2.1部分的16份生鮮海參多糖數(shù)據(jù)，共積累了62份生鮮海參多糖含量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果如圖3所示，62份樣本中，生鮮海參中多糖含量最低為39.4 mg/g，最高為164.5 mg/g，差異非常大。將這些海參樣本根據(jù)養(yǎng)殖方式分為底播養(yǎng)殖(n=34)和圈養(yǎng)養(yǎng)殖(n=28)兩組，分析后發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖方式的海參多糖含量不具有顯著差異(P>0.05)。進(jìn)一步分析海參多糖的含量分布，發(fā)現(xiàn)海參多糖含量主要集中在62～108 mg/g，如圖4所示。目前對海參多糖含量數(shù)據(jù)報(bào)道非常有限，本研究結(jié)果可為海參多糖含量標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定提供數(shù)據(jù)參考。

3 結(jié)論

本研究通過對不同養(yǎng)殖地的海參及其速發(fā)海參產(chǎn)品中多糖含量的分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖地對海參多糖含量有顯著影響(P<0.05)；速發(fā)海參多糖含量范圍為70.9～178.4 mg/g，速發(fā)海參多糖含量高于生鮮海參，但與作為其原料的生鮮海參多糖含量不存在顯著相關(guān)性(r=0.16，P>0.05)；本研究匯總了62個生鮮海參樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)生鮮海參多糖含量范圍為39.4～164.5 mg/g，主要集中在62 ～108 mg/g；養(yǎng)殖方式對海參多糖含量沒有顯著影響(P>0.05)。本研究結(jié)果揭示了養(yǎng)殖地、養(yǎng)殖方式對海參多糖含量的影響，可為海參產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中多糖含量的設(shè)定提供參考。