李 祥， 張婷婷

(1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院， 天津 300457；2.鹽城師范學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院， 江蘇 鹽城 224051)

長期高脂飲食會增加人類和其他動物的發(fā)病率和死亡率已被廣泛證實[1]。高脂飲食引起的代謝綜合征可以通過多種作用機(jī)制導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙[2]，如高脂飲食會增加機(jī)體的炎癥和氧化應(yīng)激水平[3-4]、減少大腦組織中的神經(jīng)生長因子和神經(jīng)再生[5]。高脂飲食會導(dǎo)致與衰老相似的行為缺陷，如學(xué)習(xí)記憶能力退化、神經(jīng)退行性疾病等[6]。Carey等研究了藍(lán)莓花青素對高脂膳食的中年小鼠記憶力的影響，結(jié)果表明高脂膳食可引起小鼠的認(rèn)知障礙，當(dāng)膳食添加w=4%的藍(lán)莓粉4個月后小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力得到了明顯的改善，并在Morris水迷宮的空間探索實驗中穿越平臺的次數(shù)顯著增加[7]。

花青素屬于黃酮類多酚物質(zhì)，在我們?nèi)粘ｏ嬍持泻艹Ｒ姡绕湓诩t色、藍(lán)色、黑色和紫色谷類、水果和蔬菜中[8]?；ㄇ嗨鼐哂休^強(qiáng)的清除氧自由基和抗氧化能力。近年來，花青素因其對人類的健康作用，引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注[9]。本研究探討長期高脂膳食中添加黑米花青素對小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響及可能機(jī)制，以期為黑米保健食品的開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米花青素由天津尖峰天然產(chǎn)物研究院提供，花青素成分為cyanidin-3-O-glucoside (w=83.89%)，cyanidin-3,5-diglucoside (w=3.12%)和peonidin-3-O-glucoside (w=5.45%)；血清總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)檢測試劑盒，均購買于中生北控生物有限公司；小鼠去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、小鼠多巴胺(dopamine，DA)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和小鼠5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，均購買于上海生工生物有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒，均購買于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

XR-XM101型Morris水迷宮(配有行為學(xué)測試系統(tǒng)、圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理分析系統(tǒng))，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；MyiQ2 Real Time型PCR儀，美國BIO-RAD公司；UVmini-1240型紫外可見分光光度計，日本島津公司；SMZ140型酶標(biāo)儀，廈門麥克奧迪公司。

1.3 實驗方法

1.3.1動物飼養(yǎng)與分組

SPF級4周齡雄性C57BL/6小鼠48只，體重約18 g/只，由北京維通利華實驗動物公司提供，動物飼養(yǎng)符合國家實驗動物福利指南及動物實驗倫理規(guī)范。實驗動物生產(chǎn)許可證號：20170930A。

飼養(yǎng)條件：標(biāo)準(zhǔn)屏障系統(tǒng)動物房，溫度(22±2) ℃，相對濕度40%～60%，12 h晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食及飲水。

分組：將48只小鼠放到標(biāo)準(zhǔn)屏障系統(tǒng)動物房內(nèi)普通飼料喂養(yǎng)1周，使小鼠適應(yīng)實驗環(huán)境。適應(yīng)期后將小鼠按照體重，每組12只，隨機(jī)分成4組：對照組(normal chow group，NCD)為正常膳食；高脂對照組(high fat diet，HFD)為膳食中含w=15%豬油；高脂低劑量黑米花青素組(40 mg/kg anthocyanins from black rice，LBA)為膳食中含w=15%豬油、w=40 mg/kg黑米花青素；高脂高劑量黑米花青素組(200 mg/kg anthocyanins from black rice，HBA)為膳食中含w=15%豬油、w=200 mg/kg黑米花青素。小鼠每籠4只，每7 d記錄1次體重，每2 d記錄1次進(jìn)食量，定期更換墊料。各組實驗小鼠飼料配方見表1。

表1 4組小鼠飼喂的飼料組成Tab.1 Composition of diet for four mice groups g/kg

1.3.2Morris水迷宮實驗

采用Morris[10]建立的水迷宮實驗方法評估小鼠對空間定位的空間學(xué)習(xí)記憶能力。小鼠適應(yīng)環(huán)境2 d后進(jìn)行MWM測試，整個測試包括定位航行實驗和空間探索實驗兩個部分。定位航行實驗測試周期為5 d，每天在9：00～12：00的時間段將小鼠面向池壁依次從4個象限的固定位置放入水中，電腦追蹤小鼠尋找隱匿在水下平臺所花的時間和游泳路徑，以小鼠開始尋找到爬到平臺的時間為逃避潛伏期。若小鼠在60 s內(nèi)找到隱匿平臺，則讓其保持在平臺上10 s；若60 s內(nèi)未能找到隱匿平臺，則操作員用小木棍引導(dǎo)小鼠游至平臺并停留10 s，記錄逃避潛伏期為60 s。小鼠每天訓(xùn)練3次，訓(xùn)練間隔為3 min，記錄小鼠逃避潛伏期和游泳距離。定位巡航實驗結(jié)束后的第2天進(jìn)行空間探索實驗，將隱匿平臺移除，開始60 s的探索實驗。將小鼠從第1象限放入水中，記錄小鼠在第3象限所花的時間和游泳距離，以及穿越隱匿平臺位置的次數(shù)。

1.3.3血清指標(biāo)的測定

按照試劑盒的使用操作說明書分別檢測小鼠血清TC、TG的含量。

1.3.4小鼠海馬體中氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定

小鼠海馬體的GSH-Px、SOD和MDA的測定根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，海馬體的蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定。

1.3.5小鼠海馬體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的測定

小鼠海馬體中NE、DA和5-HT這3種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平分別按照ELISA試劑盒定量分析方法進(jìn)行測定。

1.3.6小鼠大腦組織中炎癥相關(guān)因子基因的mRNA表達(dá)水平測定

用Trizol法[8]提取腦組織中總RNA，用隨機(jī)引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因序列設(shè)計特異性引物，通過qPCR的方法，使用SYBR GREEN染料法，以GAPDH為內(nèi)參基因，做相對定量檢測小鼠大腦組織的TNFα、COX-2、IL-1β基因表達(dá)水平。實驗中所用引物見表2。

表2 qPCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Graphpad Prism 5.01軟件統(tǒng)計，通過單因素ANOVA分析數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行Tukey多重比較進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗，標(biāo)注不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米花青素對小鼠Morris水迷宮表現(xiàn)的影響

MWM測試常被用來評估小鼠空間定位的學(xué)習(xí)和記憶能力[11]。對小鼠進(jìn)行了5 d的定位航行實驗，得到了5 d訓(xùn)練期小鼠的逃避潛伏期和尋找平臺的游泳距離，見圖1。如圖1(a)所示，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠的逃避潛伏期用時均逐漸縮短。在第5天時，與NCD組比較，HFD組的航行潛伏期顯著延長(P<0.05)，說明高脂膳食對小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力造成損傷。然而HBA組較HFD組小鼠的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，說明高劑量黑米花青素可以改善高脂膳食引起的學(xué)習(xí)和記憶能力損傷。在第5天的整個測試期間，HFD組、LBA組和HBA組小鼠游泳距離均明顯長于NCD組(P<0.05)，而HBA組小鼠的游泳距離顯著小于HFD組(P<0.05)，見圖1(b)，說明黑米花青素改善了高脂膳食小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力后可以有效地改善其尋找平臺的模式。

不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖1 小鼠水迷宮定位航行實驗結(jié)果Fig.1 Navigation test of mice in Morris water maze

不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖2 小鼠水迷宮空間探索行為實驗結(jié)果Fig.2 Space exploratory test of mice in Morris water maze

在定位航行實驗結(jié)束的第2天移走平臺，進(jìn)行空間探索實驗，測定小鼠在60 s內(nèi)停留在第3象限的時間和運動距離，以及穿越平臺的次數(shù)，如圖2。HFD組小鼠在原隱蔽平臺象限區(qū)(第3象限)所花費的時間和路徑較NCD組小鼠明顯減少。而經(jīng)過黑米花青素干預(yù)的小鼠，尤其是HBA組小鼠在第3象限的時間和路徑較HFD組均明顯延長(P<0.05)。如圖2(c)和(d)所示，HFD組小鼠穿越原平臺的次數(shù)較NCD組也明顯減少(P<0.05)，表明高脂飲食降低了小鼠空間記憶的鞏固能力。而經(jīng)過黑米花青素干預(yù)的小鼠，其越過隱蔽平臺的次數(shù)與HFD組小鼠相比顯著增加(P<0.05)，且與黑米花青素有劑量效應(yīng)關(guān)系。綜合以上結(jié)果表明，黑米花青素的膳食補(bǔ)充可以改善高脂對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的損傷。

2.2 黑米花青素對小鼠血清TC和TG的影響

長期高脂膳食會增加肥胖及其他代謝綜合征等疾病的患病風(fēng)險，TC和TG與這些疾病的形成密切相關(guān)[12]。本研究中，與NCD組比較，HFD組的TC和TG均明顯升高(P<0.05)；與HFD組比較，LBA組和HBA組的TC和TG均有所下降，且HBA組的血清TC和TG分別降低了37.4%(P<0.05)和38.2%(P<0.05)，結(jié)果表明黑米花青素可以有效地降低高脂膳食引起的高膽固醇和高甘油三酯。

2.3 黑米花青素對小鼠海馬體中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

SOD酶是清除超氧陰離子自由基的主要抗氧化酶，其活力可反映機(jī)體清除超氧陰離子自由基的能力。GSH-Px酶能催化GSH變?yōu)镚SSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護(hù)了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受損害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。黑米花青素對小鼠腦內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響見圖3。從圖3中可以看出，與NCD組比較，HFD組小鼠海馬體中SOD和GSH-Px酶活力顯著降低(P<0.05)，而HBA組SOD和GSH-Px酶活力較HFD組有顯著提高(P<0.05)，分別提高了30.6%和36.3%。Wu等[13]研究了黑米、黑豆和紫玉米來源的3種花青素分別對高脂膳食誘導(dǎo)肥胖小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)200 mg/kg劑量的3種花青素均能提高機(jī)體SOD和GSH-Px的活力，與本研究結(jié)果一致。MDA是氧自由基作用于不飽和脂肪酸而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是膜脂過氧化作用的最重要產(chǎn)物之一。MDA的產(chǎn)生會加劇細(xì)胞膜的損傷，因此在抗衰老生理研究中MDA含量是一個常用研究指標(biāo)，可通過MDA含量了解生物體的脂過氧化的程度，以間接測定機(jī)體內(nèi)受損程度。本研究中高脂膳食對照組組小鼠海馬體中的MDA含量較正常對照組明顯增多(P<0.05)，而高劑量黑米花青素組較高脂膳食對照組顯著降低了21.6%(P<0.05)。結(jié)果與Saliu等的研究結(jié)果一致，添加10%紫蘇葉可以顯著降低高脂膳食大鼠腦中的MDA含量，緩解了其氧化應(yīng)激狀態(tài)[14]。本研究表明黑米花青能夠有效提高高脂膳食小鼠腦組織中抗氧化酶活力，抑制脂質(zhì)過氧化。

表3 黑米花青素對小鼠血脂指標(biāo)的影響

不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖3 黑米花青素對小鼠腦內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of anthocyanins from black rice on antioxidative indexs of brain in mice

2.4 黑米花青素對小鼠海馬體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一類調(diào)節(jié)生物體生理活動的重要物質(zhì)，它調(diào)控認(rèn)知過程，如去甲腎上腺素在注意力保持方面起著重要作用，多巴胺可以改善記憶，5-羥色胺則參與調(diào)節(jié)情緒、動機(jī)和食欲[15]。黑米花青素對小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響見圖4，由圖4可知，和NCD組比較，HFD組小鼠腦中的去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺含量均有下降趨勢，其中多巴胺含量極顯著降低(P<0.01)。與HFD組比較，LBA組和HBA組的去甲腎上腺素和5-羥色胺含量有上升趨勢，而多巴胺含量顯著提高，且有劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明黑米花青素可以改善高脂膳食引起的小鼠海馬體單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的降低。

不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖4 黑米花青素對小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of anthocyanins from black rice on monoamine neurotransmitters content of brain in mice

2.5 黑米花青素對小鼠腦組織中炎癥相關(guān)因子基因表達(dá)水平的影響

炎癥是身體對感染或損傷的應(yīng)激反應(yīng)，能夠幫助機(jī)體盡快恢復(fù)正常。然而炎癥因子持續(xù)存在并損傷組織是發(fā)生慢性疾病的根本原因，比如腦中風(fēng)、血管動脈硬化及癌癥等疾病都跟炎癥因子有直接的關(guān)聯(lián)[16]。炎癥因子的失調(diào)也跟大腦老化的疾病有關(guān)，如抑郁癥、阿爾茲海默癥以及其他神經(jīng)疾病[17]。為了了解黑米花青素干預(yù)大腦衰老的進(jìn)程，本研究測定了黑米花青素對高脂膳食小鼠大腦組織的TNFα、COX-2、IL-1β基因表達(dá)水平，結(jié)果見圖5。HFD組的IL-1β、TNFα和COX-2基因表達(dá)水平較NCD組顯著升高(P<0.05)。與HFD組比較，LBA組和HBA組的IL-1β、TNFα和COX-2基因表達(dá)水平均有下降趨勢，HBA組分別下降了60.3%(P<0.05)、53.9%(P<0.05)和48.4%(P<0.05)。結(jié)果表明，高脂飲食會誘發(fā)小鼠大腦中的炎癥因子基因的高表達(dá)，降低小鼠的認(rèn)知能力，加速大腦衰老，而黑米花青素的干預(yù)后會抑制高脂飲食誘導(dǎo)的大腦衰老，抑制炎癥因子基因的表達(dá)。

不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖5 黑米花青素對小鼠大腦炎癥相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.5 mRNA expression of inflammation related genes in brain

3 結(jié) 論

長期高脂飲食可引起小鼠體質(zhì)量增加和血脂異常，可損傷小鼠的空間記憶。多酚類化合物具有良好的抗氧化生物活性。有研究報道，花青素等化合物能夠穿越血腦屏障[2]，保護(hù)腦組織不被氧化，能穩(wěn)定腦組織功能。在本實驗中，以高脂膳食小鼠為模型，研究了黑米花青素對小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

MWM測試常被用來評估小鼠空間定位的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究發(fā)現(xiàn)，200 mg/kg黑米花青素飼喂小鼠12周后小鼠的逃避潛伏期明顯降低(P<0.05)，穿越隱蔽的次數(shù)也顯著增加(P<0.05)，且與黑米花青素有劑量效應(yīng)關(guān)系，表明了黑米花青素可以改善高脂膳食引起的學(xué)習(xí)和記憶能力損傷。

高脂飲食可增加了小鼠腦組織中氧化應(yīng)激水平。經(jīng)過200 mg/kg黑米花青素干預(yù)后，小鼠海馬體中MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力顯著提高(P<0.05)，DA含量顯著提高(P<0.05)，IL-1β、TNFα和COX-2基因表達(dá)水平亦顯著降低(P<0.05)，表明黑米花青素的干預(yù)后會抑制高脂飲食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平，抑制炎癥基因的表達(dá)。

本研究證實了長期高脂膳食導(dǎo)致慢性氧化應(yīng)激損傷了小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能，膳食補(bǔ)充黑米花青素可改善小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能是通過改善腦組織氧化應(yīng)激狀態(tài)和降低炎癥水平實現(xiàn)的。