張文鵬，張志偉，莊笑梅

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850)

自2019年12月起，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在全球迅速傳播，給全世界人民生命健康帶來巨大威脅[1]。在對(duì)抗新冠病毒的戰(zhàn)役中，最為棘手的就是缺乏特效藥[2]。如何在應(yīng)對(duì)新發(fā)傳染病時(shí)，快速提供特效藥物一直以來都是全世界面臨的重要課題。除了對(duì)抗突發(fā)感染，用于治療和預(yù)防由化學(xué)物質(zhì)、微生物、放射性物質(zhì)等引起的嚴(yán)重威脅生命健康的特殊藥物(包括化學(xué)藥物、生物制品以及疫苗等)，由于開展臨床藥效研究不符合倫理或不可行，研究者和審評(píng)機(jī)構(gòu)需要特殊的方法和策略。基于此，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)率先頒布了“動(dòng)物法則(Animal Rule)”，提出可依據(jù)適當(dāng)?shù)膭?dòng)物有效性實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)支持該類藥物上市或儲(chǔ)備。本文通過回顧總結(jié)目前國(guó)際公認(rèn)的“動(dòng)物法則”以及基于“動(dòng)物法則”獲批的藥物，著重解讀基于動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)/藥效動(dòng)力學(xué)(pharmacokinetics/pharmacodynamics，PK/PD)數(shù)據(jù)獲得安全有效的人用劑量的原理和關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)，為加快我國(guó)應(yīng)急防控所需的超常規(guī)藥物研發(fā)提供借鑒。

1 針對(duì)超常規(guī)藥物研發(fā)國(guó)際通用的“動(dòng)物法則”

針對(duì)超常規(guī)藥物在開展臨床有效性研究(Ⅱ期和Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn))時(shí)，因人體要接觸到致死性或?qū)е掠谰眯該p傷的毒物或微生物，不符合倫理要求而無法進(jìn)行的難題，2002年7月美國(guó)FDA的藥物審評(píng)與研究中心(Center for Drug Evaluation and Research，CDER)和生物制品審評(píng)與研究中心(Center for Biologics Evaluation and Research，CBER)首次頒布“動(dòng)物法則”，針對(duì)化學(xué)藥物的21 CFR 314.600和針對(duì)生物制品藥物的21CFR 601.90[3]；于2015年10月進(jìn)行了修訂，并以“動(dòng)物原則指導(dǎo)下藥品開發(fā)指南”發(fā)布；鑒于“動(dòng)物法則”研究中方案設(shè)計(jì)結(jié)果處理等難點(diǎn)，2017年12月FDA專門補(bǔ)充發(fā)布了“基于動(dòng)物法則設(shè)計(jì)研究方案與FDA溝通指南”；2019年4月再次發(fā)布了在“動(dòng)物法則”指導(dǎo)下進(jìn)行非臨床研究實(shí)驗(yàn)室合規(guī)檢查內(nèi)容”。FDA如此密集的法規(guī)發(fā)布足以說明“動(dòng)物法則”在超常規(guī)特殊藥物審批中的重要性和緊迫性。

受到FDA“動(dòng)物法則”的影響，2004年歐盟藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)發(fā)布了針對(duì)無法開展臨床藥效研究特殊藥物的研究法規(guī)和指南[4]。2014年5月加拿大衛(wèi)生部(Health Canada)也發(fā)布了特殊用途藥物研發(fā)路徑，其中的核心原則也是針對(duì)由化學(xué)物質(zhì)、微生物、放射性物質(zhì)等引起的嚴(yán)重威脅生命健康的特殊藥物，可基于“動(dòng)物法則”研發(fā)。

“動(dòng)物法則”在國(guó)內(nèi)已經(jīng)受到關(guān)注[5]，但作為中國(guó)新藥審批機(jī)構(gòu)的國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥物審批中心，目前還沒有官方發(fā)布基于“動(dòng)物法則”支持超常規(guī)藥物研發(fā)的指南，也沒有申報(bào)和評(píng)審的案例和經(jīng)驗(yàn)。

2 FDA基于“動(dòng)物法則”批準(zhǔn)的新藥及代表性人用劑量外推案例

基于“動(dòng)物法則”研究的藥物，由于無法開展大規(guī)模人體藥效研究(如有限臨床病例研究結(jié)果，作為重要數(shù)據(jù)補(bǔ)充)，非臨床的研究結(jié)果更加重要。因此，“動(dòng)物法則”特別強(qiáng)調(diào)要包含以下4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(表1)，才能保證獲得的外推人用劑量是可信的。同時(shí)，必須有Ⅰ期臨床研究數(shù)據(jù)，以獲得藥物在健康人體中的劑量-暴露(PK)特征，以及安全劑量范圍的數(shù)據(jù)。

到目前為止，F(xiàn)DA基于“動(dòng)物法則”共審批了14個(gè)超常規(guī)藥物用于軍事儲(chǔ)備或應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件，包括針對(duì)化學(xué)物質(zhì)、微生物、放射性物質(zhì)的化藥、生物藥以及疫苗等[6]。表2按照FDA批準(zhǔn)的時(shí)間順序總結(jié)了14個(gè)超常規(guī)藥物的主要信息，包括必須符合的4個(gè)研究標(biāo)準(zhǔn)以及人用劑量橋接策略。從可獲得的信息可以看出，這些藥物分為增加新適應(yīng)癥的“老藥新用”，以及全新的藥物或疫苗兩類。對(duì)于增加新適應(yīng)癥的已上市藥物來說，由于已有完整的臨床前研究數(shù)據(jù)和針對(duì)原適應(yīng)癥的臨床研究數(shù)據(jù)(有時(shí)還包括臨床超標(biāo)簽應(yīng)用的報(bào)道)，可以大大縮短研發(fā)周期。對(duì)這類藥物，不必重復(fù)進(jìn)行臨床前研究及Ⅰ期臨床研究，而是根據(jù)“動(dòng)物法則”4個(gè)研究標(biāo)準(zhǔn)，建立新適應(yīng)癥的動(dòng)物模型及體外模型。所采用的動(dòng)物模型的發(fā)病機(jī)制，臨床表現(xiàn)，以及終點(diǎn)指標(biāo)都要與人體具有高度可比性。在這種情況下，獲得該模型動(dòng)物PK/PD，根據(jù)人體藥代參數(shù)(藥物暴露)及藥效相關(guān)依據(jù)，合理外推患者體內(nèi)暴露及劑量，替代臨床Ⅱ期或Ⅲ期研究。此類藥物包括抗菌素左氧氟沙星，鹽酸環(huán)丙沙星用于治療炭疽感染，非格司亭、培非格司亭、沙格司亭用于治療輻射損傷等。對(duì)于全新的藥物或疫苗來說，按照“動(dòng)物法則”研究和申報(bào)超常規(guī)藥物，必須先進(jìn)行系統(tǒng)的臨床前藥代動(dòng)力學(xué)、安全性評(píng)價(jià)以及臨床Ⅰ期研究，然后按照4個(gè)研究標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行人體藥效劑量的外推。這類藥物包括美軍研發(fā)的預(yù)防梭曼中毒藥物溴吡斯的明、治療炭疽感染的雷昔庫(kù)單抗、奧比妥昔單抗，以及抗天花的特考韋瑞等。

Tab 1 Four criteria for FDA to rely on evidence from studies in animals to provide substantial evidence of effectiveness of these products

Tab 2 Summary of FDA approved drugs under “Animal Rule”

Tab 2

本文以特考韋瑞和奧比妥昔單抗為例，簡(jiǎn)要闡述如何依據(jù)臨床前研究、動(dòng)物有效數(shù)據(jù)以及臨床Ⅰ期研究結(jié)果外推全新結(jié)構(gòu)的小分子化藥和大分子單抗藥物的臨床有效性，并外推人用劑量。

特考韋瑞(Tecovirimat，TPOXX，又名ST-246)是FDA依據(jù)“動(dòng)物法則”最新批準(zhǔn)的首個(gè)抗天花病毒全新化學(xué)藥物，整個(gè)研發(fā)過程非常值得借鑒。天花病毒作為烈性病毒，受到倫理限制，無法進(jìn)行臨床有效性研究，必須依據(jù)“動(dòng)物法則”外推人體有效劑量[7]。天花病毒是痘病毒(Orthopoxvirus)的一種，僅感染人類，出現(xiàn)皮膚發(fā)疹和發(fā)熱，以至死亡，因此，按照動(dòng)物法則要求，建立合適的動(dòng)物模型具有一定的挑戰(zhàn)性。最終，研究人員利用藥物靶點(diǎn)在痘病毒中的保守性，采用猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)與兔痘病毒(rabbitpox virus，RPXV)兩種不同的強(qiáng)致死性痘病毒作為替代，建立了食蟹猴與兔兩種染毒模型[8]，并證明這兩個(gè)動(dòng)物模型中均可出現(xiàn)與人類相似的病毒血癥、皮膚痘疹和高死亡率，成功完成了動(dòng)物模型構(gòu)建。TPOXX抗天花病毒靶點(diǎn)是病毒復(fù)制必須的包封蛋白，這與其在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮抗痘病毒作用是一致的。因此TPOXX在動(dòng)物模型中獲得的藥代和藥效(存活率)數(shù)據(jù)能夠可信地橋接于人體。經(jīng)過臨床前以及動(dòng)物模型中的PK/PD研究，證明了TPOXX對(duì)病毒的有效性(兔模型40 mg·kg-1·d-1，猴模型10 mg·kg-1·d-1，連續(xù)14 d給藥有效率可達(dá)95.5%[14]和96%[10])及其藥物暴露的藥代參數(shù)(藥時(shí)曲線下面積(area under curve，AUC)，峰濃度Cmax和谷濃度Cmin)。通過比較TPOXX健康人體(共449例，其中359例接受了600 mg，每天兩次(Bis in die，BID)，口服劑量)研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)14 d餐后口服600 mg BID，能夠在人體內(nèi)獲得超出動(dòng)物有效劑量水平的暴露量(表3[9-10])，并且是安全的。同時(shí)，能否將藥物的正常人體PK數(shù)據(jù)基于“動(dòng)物法則”外推到感染患者，還需證明病毒感染是否影響藥物在體內(nèi)的PK暴露特征，以及影響藥物在動(dòng)物和人體PK特征的因素是否存在明顯物種差異。在這個(gè)案例中，研究者應(yīng)用群體藥動(dòng)模型(Population Pharmacokinetics，PopPK)，首先證明了正常動(dòng)物與病毒感染動(dòng)物PK特征無明顯差別，并進(jìn)一步證明了(影響藥物在動(dòng)物和人體PK特征的因素?zé)o明顯的種屬差異[11]。最終，TPOXX的人用劑量被設(shè)定為餐后口服600mg BID，連續(xù)給藥14 d。在缺乏臨床有效性研究的情況下，TPOXX應(yīng)用動(dòng)物-人體在PK/PD的橋接獲得了FDA的認(rèn)可。

Tab 3 PK parameters of TPOXX in uninfected human, MPXV infected macaques and RPXV infected rabbits [9-10]

奧比妥昔單抗(ANTHIM)是FDA繼批準(zhǔn)瑞西巴庫(kù)單抗以后，依據(jù)“動(dòng)物法則”批準(zhǔn)的第二個(gè)治療和預(yù)防炭疽感染的單抗。機(jī)制研究證明，ANTHIM可以特異性中和炭疽毒素-保護(hù)性抗原(protective antigen，PA)，后者是炭疽桿菌造成機(jī)體損傷的毒素蛋白。新西蘭兔和食蟹猴吸入炭疽孢子后建立的動(dòng)物模型與人體的發(fā)病機(jī)制和特點(diǎn)一致[12]，因此用于動(dòng)物有效性研究。兔和猴吸入感染200×LD50氣溶膠態(tài)炭疽桿菌后，應(yīng)用ANTHIM(靜注劑量為1～32 mg·kg-1，并包括安慰劑對(duì)照組)對(duì)抗，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)指標(biāo)是28 d存活率，并測(cè)定血清中ANTHIM和PA含量。動(dòng)物模型表明ANTHIM 16 mg·kg-1能明顯提高兔和猴生存率(超過ED90的概率80%)，并達(dá)到藥效平臺(tái)[13]。同時(shí)進(jìn)行聯(lián)合左氧氟沙星實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)合用抗生素未明顯提高生存率。在臨床Ⅰ期超過500例健康受試者進(jìn)行了4～24 mg·kg-1劑量范圍的安全性和PK研究，還包括了合用抗生素的PK研究。比較ANTHIM的在染毒后兔和猴的PK以及健康人體PK，發(fā)現(xiàn)同樣靜注16 mg·kg-1后人體中藥物峰濃度(Cmax)與動(dòng)物模型相當(dāng)，但AUC幾乎是動(dòng)物的兩倍(圖2，表4)[14]，合用抗生素不改變ANTHIM 的PK。由于抗體藥物的體內(nèi)清除具有明顯的種屬差異，人體的半衰期明顯高于動(dòng)物，因此人體內(nèi)暴露量高于動(dòng)物[15]。考慮到靶點(diǎn)介導(dǎo)的清除(Target Mediated Drug Disposition，TMDD)是抗體藥物的另一個(gè)重要清除機(jī)制，而在健康人體中缺乏PA這一特異靶點(diǎn)，研究人員應(yīng)用PopPK進(jìn)行了建模和模擬。模型結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)的Cmax和AUC在健康人體體內(nèi)與實(shí)測(cè)結(jié)果吻合度良好，而感染后患者體內(nèi)的AUC比健康人體降低了18%(表4)，主要是由于TMDD造成的，但是這并不會(huì)降低藥物的抗毒作用。因此，最終確定16 mg·kg-1為成人患者用量。在PopPK建模過程中，通過考察年齡、性別、種族等各種協(xié)變量對(duì)PK/PD的影響，發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量是個(gè)敏感參數(shù)。因此，為了給兒童患者提供有效劑量，將體質(zhì)量作為協(xié)變量，獲得了不同體質(zhì)量?jī)和腁UC和Cmax，計(jì)算出兒童給藥劑量為15 kg以下32 mg·kg-1，15～40 kg按24 mg·kg-1給藥。

Tab 4 Overview of pharmacokinetic analyses for i.v. dose of 16 mg·kg-1 ANTHIM in animal models and humans[14]

Fig 1 Plasma concentration-time curves (A) and individual exposure levels (AUC, B) for uninfected humans and NHPs over a range of TPOXX doses relevant to efficacious-dose.

Fig 2 ANTHIM exposure in animal models and humans after i.v. dose of 16 mg·kg-1 (a) Cmax, (b) AUC [14]

3 超常規(guī)抗毒藥動(dòng)物劑量外推人用劑量的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)

“動(dòng)物法則”用于指導(dǎo)無法開展臨床有效研究但具有重要需求的特殊藥物，它制定的4個(gè)基本標(biāo)準(zhǔn)比一般藥物研發(fā)的臨床前研究標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格得多，目的就是保障動(dòng)物有效劑量的人化外推是安全有效的。鑒于人化劑量的獲得是“動(dòng)物法則”中的核心步驟，比較體內(nèi)暴露是橋接動(dòng)物和人的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。結(jié)合動(dòng)物法則指南要求、已獲批特殊藥物的研究以及作者的實(shí)踐工作體會(huì)，總結(jié)主要關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)如下。

3.1 PK/PD(藥代動(dòng)力學(xué)/藥效動(dòng)力學(xué))雖然PK研究是獲得藥物體內(nèi)暴露特征的關(guān)鍵，但在正常動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的PK由于忽略了病理狀態(tài)對(duì)藥物體內(nèi)處置的影響，不能作為外推人體劑量的唯一參考。只有在動(dòng)物疾病模型中獲得的PK，同時(shí)結(jié)合PD指標(biāo)，才是外推人體的重要依據(jù)。因此，動(dòng)物模型中PK/PD關(guān)聯(lián)是動(dòng)物有效劑量外推至人的最重要方法。具體應(yīng)用時(shí)，針對(duì)不同藥物可采取不同策略。

(1)如果藥物的抗毒機(jī)制是直接對(duì)抗外源毒物而不是作用于機(jī)體本身，體外模型上獲得的有效暴露濃度可用于估算體內(nèi)暴露所需的有效濃度。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可以首先在動(dòng)物模型上進(jìn)行PK/PD驗(yàn)證，再根據(jù)人體Ⅰ期臨床獲得的PK結(jié)果，反推人體得到相應(yīng)PD指標(biāo)所需的人化劑量?；谶@一思路，抗菌素基于PK/PD人用劑量的預(yù)測(cè)比較準(zhǔn)確。反之，如果藥物的作用機(jī)制或靶點(diǎn)是機(jī)體本身，通過改變機(jī)體細(xì)胞蛋白的內(nèi)在功能而抵御感染或外源毒物，應(yīng)用動(dòng)物模型PK/PD外推人體時(shí)可能因存在宿主特異性的障礙，使得依據(jù)“動(dòng)物法則”進(jìn)行有效劑量外推的可靠性大打折扣。目前，F(xiàn)DA按照“動(dòng)物法則”批準(zhǔn)的抗毒藥物中，其作用靶點(diǎn)都是直接針對(duì)病毒或細(xì)菌的。

(2)如果受試藥已被批準(zhǔn)用于其他適應(yīng)癥，參考已有的人體PK/PD數(shù)據(jù)，在新的動(dòng)物模型中獲得的PK/PD可進(jìn)行針對(duì)新適應(yīng)癥的人用劑量轉(zhuǎn)換，也是非?？尚械?。

(3)如果藥物的臨床藥效基于合適的生物標(biāo)志物，則必須證明這個(gè)生物標(biāo)志物與產(chǎn)生臨床期望療效相關(guān)聯(lián)，并且在動(dòng)物模型中必須能夠檢測(cè)到相同的生物標(biāo)志物，這時(shí)動(dòng)物的PK/PD也可以轉(zhuǎn)化為人體的PK/PD。其中必須注意的是，在沒有足夠證據(jù)證明動(dòng)物和人體的反應(yīng)(生物標(biāo)志物，MIC等)一致或相關(guān)時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)獲得的PK/PD不能直接外推到人。在這種情況下，我們只能假定建立的動(dòng)物E/R(暴露/反應(yīng))關(guān)系與人是類似的，并應(yīng)用保守的方法進(jìn)行動(dòng)物到人體的外推。同時(shí)，由于沒有替代指標(biāo)，可以根據(jù)藥物的暴露參數(shù)(AUC、Cmax、Css)確定人用劑量。

(4)需要確定產(chǎn)生藥效的是藥物原型還是其代謝產(chǎn)物，如果是代謝產(chǎn)物，必須建立活性代謝產(chǎn)物的PK/PD，同時(shí)要證明代謝轉(zhuǎn)化模式在動(dòng)物模型和人是一致的。

3.2 物種差異由于藥物的體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄(ADME)等關(guān)鍵因素存在物種差異，影響藥物濃度-時(shí)間曲線，在進(jìn)行動(dòng)物劑量人化外推時(shí)必須根據(jù)種屬差異適當(dāng)調(diào)整。

(1)為了充分獲得PK物種差異，至少要在動(dòng)物模型中進(jìn)行3個(gè)劑量的PK研究，以繪制出完整的暴露-效應(yīng)曲線，獲得最大藥效劑量和動(dòng)物模型體內(nèi)的PK特征。

(2)藥物ADME的物種差異比較可在體外模型上進(jìn)行。其中，人和動(dòng)物肝細(xì)胞或肝微粒體模型能夠較快速地準(zhǔn)確獲得小分子藥物經(jīng)肝臟代謝的種屬差異。

(3)藥物蛋白結(jié)合率的物種差異也是非常重要的影響因素，但常常被忽略。由于只有游離的藥物才能夠發(fā)揮藥效，在進(jìn)行PK/PD的體內(nèi)外和種屬橋接轉(zhuǎn)化時(shí)，必須根據(jù)血漿，以及組織、細(xì)胞的蛋白結(jié)合率校正后[16]，按照游離藥物濃度進(jìn)行，否則可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重偏差。

(4)充分獲得藥物在模型動(dòng)物和人的ADME物種差異后，可通過調(diào)整動(dòng)物的給藥劑量和方式，使血藥濃度-時(shí)間曲線更接近人體，獲得精準(zhǔn)的人化劑量。隨著模型介導(dǎo)新藥研發(fā)(model based drug development，MBDD)模式的發(fā)展，基于生理藥動(dòng)學(xué)(physiologically based pharmacokinetic，PBPK)模型和群體藥動(dòng)學(xué)(PopPK)模型也為人用劑量的獲得提供了更好的技術(shù)平臺(tái)，同時(shí)還為特殊人群(兒童、老人等)用藥劑量的調(diào)整提供了可能[17]。

3.3 藥物相互作用對(duì)于致命性毒物、微生物等造成的損傷，臨床救治時(shí)除了抗毒藥以外，通常會(huì)合并使用多種藥物。藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)由于受到基于ADME的藥物-藥物相互作用影響，常常會(huì)發(fā)生藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的改變，影響藥效和安全性。因此在動(dòng)物劑量人化時(shí)也需根據(jù)受試藥的代謝特征進(jìn)行必要的藥物相互作用研究。藥物-藥物相互作用(Drug-drug Interaction，DDI)可以在體外模型或健康人體內(nèi)進(jìn)行，具體可參考FDA發(fā)布的DDI指南[18]。

綜上，“動(dòng)物法則”對(duì)于無法開展臨床有效性研究的超常規(guī)抗毒藥的研發(fā)具有顯著的科學(xué)指導(dǎo)意義。盡管無法開展臨床有效性研究，如果嚴(yán)格滿足FDA“動(dòng)物法則”的基本標(biāo)準(zhǔn)，將有足夠的信心根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推獲得準(zhǔn)確的人用有效劑量，解決這類藥物研發(fā)的瓶頸。在當(dāng)前形勢(shì)下，我國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)需要盡快制訂符合我國(guó)醫(yī)療實(shí)踐和國(guó)情的“動(dòng)物法則”指南。國(guó)內(nèi)藥物研究機(jī)構(gòu)也需著眼這一重大需求，建立相關(guān)技術(shù)平臺(tái)，多學(xué)科密切協(xié)作，提高國(guó)家生物安全防御能力。