張永慧，瞿 艷，牟金阿哥，張昊洋，劉 丹，付 菲，劉 奉

( 1. 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W?；A(chǔ)醫(yī)學部藥理學教研室；2. 重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心；3. 重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校藥學院，重慶 404020)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是世界最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均居所有癌癥的第三位[1]。隨著科學的發(fā)展，雖然涌現(xiàn)許多新的結(jié)直腸癌治療方式及藥物，但手術(shù)和術(shù)后化療仍是目前治療結(jié)直腸癌的主要手段，然而結(jié)直腸癌手術(shù)治療效果不夠理想、術(shù)后復(fù)發(fā)率高且常伴有急性腸梗阻，而化學藥物治療過程中常出現(xiàn)耐藥性等問題，這些問題為結(jié)直腸癌的治療帶來很大的難度，深入探究結(jié)直腸癌的發(fā)病機制及增加對結(jié)直腸癌的預(yù)防和預(yù)后監(jiān)測勢在必行。腫瘤標志物是腫瘤細胞本身存在或分泌的特異性物質(zhì), 在腫瘤的預(yù)防、診斷和治療中均發(fā)揮重要作用。現(xiàn)階段腫瘤標志物監(jiān)測診斷某一種惡性腫瘤的準確率不是很高，特異性也會受到一定的限制。因此，找到針對某種腫瘤的特異性和靈敏度均很高的腫瘤標志物具有重要的臨床應(yīng)用價值。

生長分化因子11(growth differentiation factor，GDF11)是轉(zhuǎn)化生長因子超家族的一員，參與胚胎發(fā)育、紅細胞生成、衰老和心血管疾病等生理病理過程[2-5]。以往研究顯示，GDF11參與肝癌、乳腺癌、口腔癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展，僅有一篇臨床研究證明GDF11參與結(jié)直腸癌病理過程，與結(jié)直腸癌預(yù)后具有相關(guān)性[6-10]。而對于我國結(jié)直腸癌患者組織GDF11表達水平及GDF11與患者預(yù)后相關(guān)性研究仍處于空白階段。本研究采用Oncomine數(shù)據(jù)庫、結(jié)腸癌cDNA芯片和組織芯片利用qPCR技術(shù)檢測正常癌旁組織與結(jié)腸癌患者組織GDF11表達水平的變化。體外培養(yǎng)HCT116和SW480結(jié)腸癌細胞，分為3組：正常對照組(C)、GDF11低劑量組(50 μg·L-1)、GDF11高劑量組(100 μg·L-1)，利用CCK-8法檢測GDF11對結(jié)腸癌細胞活力的影響，流式細胞術(shù)檢測GDF11對結(jié)腸癌細胞周期的影響，Transwell實驗檢測GDF11對結(jié)腸癌細胞遷移的影響，Western blot技術(shù)檢測GDF11、p-smad3、p-smad2、smad2/3、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、fibronectin、ZEB1、SNAIL、TWIST1、p21表達水平，探討GDF11在結(jié)腸癌組織中表達差異和GDF11對結(jié)腸癌細胞活力、遷移的影響及機制。

1 材料

1.1 細胞株與分組SW480和HCT116結(jié)腸癌細胞株，購自上海中喬新舟生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)達80%～90%融合后，將細胞隨機分為3組：正常對照組(C)、GDF11低劑量組(50 μg·L-1)、GDF11高劑量組(100 μg·L-1)。

1.2 藥物與試劑cDNA芯片購自上海芯超生物，批號：cDNA-HColA030CS01；組織芯片購自上海芯超生物，批號：HColA030PG02；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，批號：RR820Q)；重組人/大鼠/小鼠源GDF11(PeproTech，批號：120-11)；CCK-8(Dojindo，批號：CK04)；Transwell小室(Corning，批號：3422)；細胞周期檢測試劑盒(凱基生物，批號：KGA512)；L-15 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(上海中喬新舟生物科技有限公司，批號：ZQ-1100)；胎牛血清(Quacell biotechnology，批號：B21001)；Smad2/3 Antibody Sampler Kit(CST公司，批號：12747)；GDF11抗體(Abcam公司，批號：ab71347)；p-p38(CST公司，批號：4511)；p38(Santa Cruz公司，批號：sc-81621)；p-ERK1/2(CST公司，批號：4370)；ERK(Santa Cruz公司，批號：sc-514302)；p-JNK(CST公司，批號：9255)；JNK(Santa Cruz公司，批號：sc-7345)； p21(CST公司，批號：2947T)；E-cadherin(CST公司，14472);Vimentin(CST公司，5741T)；N-cadherin(CST公司，批號：13116)；fibronectin(Santa Cruz公司，批號：sc-8422)；ZEB1(Santa Cruz公司，批號：sc-515797)；SNAIL(Santa Cruz公司，批號：sc-271977)；TWIST1(Santa Cruz公司，批號：sc-81417)；ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(伯樂公司，批號：1705060)。

1.3 儀器7900HT實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司); ChemiDoc Touch化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國伯樂公司); ELX800TM酶標儀(美國BioTek公司)；DXFlex臨床分析型三激光流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)設(shè)定篩選條件為：① “Cancer Type: Colorectal Cancer”；② “Gene: GDF11”；③ “Analysis Type:Cancer vs. Normal Analysis”；④ “Data Type: mRNA copy number”；⑤ “Sample type: Clinical Specimen”數(shù)據(jù)記錄保存為excel表格。

2.2 qPCR檢測cDNA基因芯片GDF11 mRNA水平cDNA芯片是一種通過實時熒光定量的方法來檢測目的基因的表達的cDNA陣列，本實驗購買的結(jié)腸癌cDNA基因芯片包含結(jié)腸癌30例，癌/癌旁各1點，通過實時熒光定量PCR，檢測目的基因GDF11表達，內(nèi)參基因為β-actin。GDF11引物序列:Forward 5′-GCCATCAACACCACTCACATT-3′；Reverse 5′-CCAATCCCTACTCTGCCAAG-3′。β-actin引物序列：Forward 5′-GAAGAGCTACGAGCTGCCT GA-3′；Reverse 5′-CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3′。

2.3 免疫組化檢測結(jié)腸癌組織芯片GDF11蛋白質(zhì)水平組織芯片購買于上海芯超生物科技有限公司，對組織芯片進行免疫組化染色，GDF11蛋白表達定位于細胞質(zhì)和(或)細胞膜，觀察到深褐色或棕黃色顆粒為陽性細胞。

2.4 細胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞株SW480接種于包含10%血清的L-15培養(yǎng)基，HCT116接種于包含10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.5CCK-8法檢測細胞活力將HCT116和SW480細胞培養(yǎng)至密度為90%左右，進行細胞計數(shù)，按實驗分組接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔的細胞數(shù)為5×103個，每組設(shè)6個復(fù)孔，接種后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h。分別在給藥組中加入終濃度為50、100 μg·L-1的GDF11，培養(yǎng)24、48和72 h后，加入10 μL CCK-8溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，在酶標儀上測定其在450 nm處OD值，進行數(shù)據(jù)分析。

2.6 Transwell檢測細胞遷移在Transwell上層小室加入200 μL調(diào)整好濃度的結(jié)腸癌細胞懸液，分為3組：正常對照組(C)、GDF11低劑量組(50 μg·L-1)、GDF11高劑量組(100 μg·L-1)，培養(yǎng)24～48 h，用鑷子取出Transwell小室進行染色。吸干上清液體，移入預(yù)先添加甲醇的孔中，室溫固定15 min，再移入添加結(jié)晶紫溶液的孔中，染色15 min。將Transwell小室從結(jié)晶紫溶液中取出，用去離子水清洗去除結(jié)晶紫染料。吸去Transwell小室中殘余的水，用棉簽擦去Transwell小室上層未穿膜細胞，顯微鏡下觀察Transwell小室下層細胞穿膜的情況，每個小室隨機選擇5個視野拍攝計數(shù)。

2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞周期根據(jù)凱基細胞周期試劑盒說明書，收集細胞，用PBS洗滌細胞并制備單細胞懸液離心后，在細胞中加入70%冷乙醇500 μL固定，4 ℃保存；加入提前配制好的500 μL PI/RNaseA染色工作液，室溫避光30～60 min；上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。

2.8 Western blot檢測提取總蛋白，進行電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體、ECL顯色發(fā)光，利用 Bio-Rad Image Lab Software軟件測定蛋白條帶的積分光密度值，目的蛋白包括：GDF11、p-smad2、p-smad3、p-p38、Vimentin、N-cadherin、fibronectin、ZEB1、SNAIL、TWIST1、E-cadherin和p21，β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參照。

3 結(jié)果

3.1 GDF11在人結(jié)腸癌組織的表達差異cDNA組織芯片包含30例結(jié)腸癌組織，年齡在31～84歲，平均年齡64歲；男性19人，女性11人；AJCC病理分期：1期4人，2期12人，3期12人，4期2人(Tab 1)。Fig 1A結(jié)果顯示，與正常癌旁組織相比，GDF11在癌癥組織高表達(P<0.01)，Oncomine數(shù)據(jù)庫結(jié)果和組織芯片與此結(jié)果一致(Fig 1B，1C)。

Tab 1 Relationship between GDF11 expression and clinicopathological characteristics in tissue microarray of 30 colorectal cancer patients

3.2 GDF11對人結(jié)腸癌細胞株smad2/3、AMPK和MAPK信號通路的影響用外源性GDF11處理人結(jié)腸癌細胞株HCT116和SW480可以增加細胞內(nèi)GDF11表達水平(Fig 2A)。GDF11屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的一員，與其他TGF-β成員類似，smad信號通路為其經(jīng)典信號通路。本實驗用GDF11處理細胞后，可以增加p-smad2，p-smad3表達水平，暗示GDF11可能通過激活smad2/3信號通路發(fā)揮其生理功能(Fig 2B)。同時，我們檢測了GDF11對人結(jié)腸癌細胞株p-AMPK、AMPK、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK蛋白質(zhì)表達的影響，結(jié)果顯示，GDF11可明顯激活p-p38表達水平(Fig 2C～2F)。

3.3 GDF11對人結(jié)腸癌細胞株細胞活力的影響用不同濃度GDF11(50 μg·L-1和100 μg·L-1)處理人結(jié)腸癌細胞株后，F(xiàn)ig 3結(jié)果顯示，GDF11作用48、72 h后，與對照組相比，GDF11處理組細胞活力明顯增加(P<0.01)。

Fig 1 Cancer tissues had significantly higher GDF11 mRNA and protein expression than normal tissues

3.4 GDF11對人結(jié)腸癌細胞株細胞遷移及EMT相關(guān)蛋白的影響Fig 4A結(jié)果顯示，GDF11處理后可促進人結(jié)腸癌細胞株縱向遷移(P<0.01)。GDF1處理后可增加Vimentin、N-cadherin、fibronectin、ZEB1、SNAIL、TWIST1表達水平、降低E-cadherin表達水平(Fig 4B)。

Fig 2 Effect of GDF11 on GDF11 expression, smad2/3 signals and non-smad signals in human colon cancer cell line HCT116 and SW480

Fig 3 GDF11 increased cell viability of HCT116 and SW480 for long-term

3.5 GDF11對人結(jié)腸癌細胞株細胞周期及周期相關(guān)蛋白的影響Fig 5A結(jié)果顯示，GDF11處理可降低G0/G1期，增加G2/M期和S期。GDF11處理可降低p21表達水平(Fig 5B)。

4 討論

雖然結(jié)直腸癌早期診斷和治療有所改善，但患者5年生存率仍較低。傳統(tǒng)的結(jié)直腸癌血清標志物包括血清癌胚抗原(CEA)、糖蛋白抗原19-9(CA 19-19)，但在診斷時僅使用CEA或CA 19-9缺乏靈敏性和特異性[11]。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，涌現(xiàn)出愈來愈多的新型腫瘤標志物，例如循環(huán)腫瘤細胞、DNA、RNA、基因甲基化等，但大多數(shù)新型腫瘤標志物缺乏大規(guī)模臨床實驗驗證?，F(xiàn)階段腫瘤標志物監(jiān)測診斷某一種惡性腫瘤的準確率不是很高，特異性也會受到一定的限制。因此，找到針對某種腫瘤的特異性和靈敏度均很高的腫瘤標志物具有重要的臨床應(yīng)用價值。

研究證明，GDF11參與結(jié)直腸癌病理過程，結(jié)直腸癌組織GDF11表達水平增高；具有GDF11高表達的腫瘤患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險更高，腫瘤相關(guān)的死亡率增加，患者存活率下降，暗示GDF11可作為結(jié)直腸癌預(yù)后的指標之一[10]。而對于我國結(jié)直腸癌患者組織GDF11表達水平改變及GDF11參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展機制仍處于空白階段。本研究首先探究GDF11 mRNA和蛋白質(zhì)在結(jié)腸癌組織表達水平的改變，結(jié)果顯示，與正常癌旁組織相比，結(jié)腸癌組織GDF11表達水平明顯增加；通過查閱Oncomine數(shù)據(jù)庫，進一步驗證此結(jié)論。我們探究GDF11在體外對人結(jié)腸癌細胞株細胞活力、細胞遷移表型的影響。購買人源GDF11細胞因子處理細胞，可明顯增加細胞內(nèi)GDF11表達，證明外源性GDF11處理可使細胞內(nèi)GDF11高表達，進而探索GDF11高表達水平條件下對人結(jié)腸癌細胞株的影響。與TGF-β家族其他成員一樣，GDF11首先與細胞膜表面的Ⅱ型受體ActRⅡ(包括ActRⅡA和ActRⅡB)結(jié)合，進而募集Ⅰ型受體ActRⅠ(ALK4，ALK5，ALK7)。與相應(yīng)受體結(jié)合后可以激活下游通路，下游通路主要分為兩類：即smad和非smad信號通路[3]。已有多篇文章報道GDF11可在不同組織或細胞內(nèi)通過激活smad2/3信號通路，再與Smad4形成復(fù)合物被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)，在胞核內(nèi)該復(fù)合物與特定的DNA位點結(jié)合，進而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[3,12]。本實驗用GDF11處理細胞后，可激活人結(jié)腸癌細胞株smad2/3信號通路，暗示其對結(jié)腸癌表型的作用可能通過smad2/3信號通路。同時，我們也檢測了GDF11對non-smad信號通路的影響，結(jié)果顯示，GDF11可以明顯增加p-p38表達。用不同濃度GDF11(50 和100 μg·L-1)處理人結(jié)腸癌細胞株后，可明顯增加細胞活力，其機制可能為降低細胞周期相關(guān)蛋白p21表達，加速細胞周期過程。同時，GDF11可通過影響EMT相關(guān)蛋白表達，促進細胞遷移。

Fig 4 GDF11 promoted cell migration of HCT116 and vs CTL group.

Fig 5 GDF11 promoted cell cycle progress of HCT116 and

綜上所述，GDF11在結(jié)腸癌組織高表達，并發(fā)揮促進結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，其可能機制為加速細胞周期過程，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究闡明GDF11參與結(jié)直腸癌病理過程的機制，為臨床通過調(diào)控GDF11表達防治結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展提供新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。同時，GDF11有望成為新型的結(jié)直腸癌預(yù)警標志物，對結(jié)直腸癌患者早期診斷及抗癌藥理機制提供新的靶點。

(致謝: 感謝重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校工程中心實驗室為本課題研究提供儀器設(shè)備和技術(shù)支持。)