張曉涵，田淑芬*，張娜

（1. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，天津 300381；3. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

無核鮮食葡萄由于其食用方便、口感獨(dú)特，受到了世界各地消費(fèi)者的喜愛。1995年，董新平[3]利用赤霉素處理有核葡萄的花序，出現(xiàn)了無核性狀的葡萄。相較于二倍體葡萄來說，三倍體葡萄無核、果粒大，食用方便方面更具優(yōu)勢[1]，是育種工作者培育無核葡萄的主要途徑之一。三倍體葡萄在培育的過程中往往會發(fā)生胚的敗育現(xiàn)象，而不能正常結(jié)實(shí)。胚挽救育種是獲得三倍體無核葡萄的主要方法[2-5]，利用胚挽救技術(shù)可提高后代雜交胚的成活率。1993年，山下用四倍體和二倍體雜交，取其雜交胚進(jìn)行人工培養(yǎng)獲得了三倍體的試管苗，但并未對雜交株進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)實(shí)研究。目前，成功培育出的三倍體葡萄品種有‘夏黑’（Summer Black）、‘尾玲’（Yileyi）、‘蜜無核’（Honey Seedless）、‘早紅’（Earlyred Seedless）等[6-8]。二倍體葡萄‘紅巴拉多’是極早熟的歐亞雜種，具有皮薄肉脆、果穗大、不掉粒的特點(diǎn)[9]。本試驗(yàn)以其為母本，四倍體葡萄‘戶太八號’‘巨玫瑰’為父本培育三倍體葡萄，探究不同的取樣時(shí)期、胚發(fā)育天數(shù)及不同父本對其胚挽救結(jié)果的影響，提高雜種胚后代的發(fā)育率和萌發(fā)率，以獲得無核、大粒、耐貯運(yùn)的葡萄新品種。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)親本選自天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新基地，于2015年定植。試驗(yàn)于2019年3月開始在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新基地、天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。親本倍性及雜交組合如表1所示。

表1 胚挽救雜交組合及親本倍性Table 1 Embryo rescue hybrid combination and ploidy of parents

1.2 方法

1.2.1 田間雜交

于2019年4月進(jìn)行父本花粉的采集，待大部分花穗中的小花蕾開放5%左右時(shí)，將其整穗剪下并用鑷子剝?nèi)』ㄋ帯４ㄋ幾匀魂幐珊蠹尤敫稍飫ㄗ兩枘z）放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。在母本‘紅巴拉多’開花前3～4 d進(jìn)行人工去雄，每種組合雜交10穗。于去雄后第2天開始授粉，連續(xù)授粉3 d。每次授粉后的花穗套袋，并標(biāo)注雜交組合及授粉時(shí)間。

1.2.2 幼果采集與消毒

雜交幼果于授粉后45 d、52 d、59 d和66 d分別取樣，共計(jì)4次。將采下的幼果去除果柄，用洗潔精清洗果實(shí)表面后放入流水中沖洗10 min，沖洗過的幼果置于超凈工作臺進(jìn)行消毒，先用75%酒精浸泡30 s，用無菌水沖洗3次，再放入2%次氯酸鈉中浸泡3 min，用無菌水沖洗3次。

1.2.3 胚珠的發(fā)育培養(yǎng)

將雜交幼果置于超凈工作臺中，用解剖針將胚珠取出，接種在發(fā)育培養(yǎng)基（Nitsch＋1.5mol/L IAA＋0.5 mol/L 6-BA＋0.5 mol/L GA3）中，并添加60 g/L蔗糖、5 g/L 瓊脂和1 g/L 活性炭，調(diào)pH至5.8。

1.2.4 胚的萌發(fā)培養(yǎng)

在胚珠發(fā)育培養(yǎng)60、90、120 d后，進(jìn)行胚的萌發(fā)培養(yǎng)，用解剖針剝?nèi)∨呓臃N到萌發(fā)培養(yǎng)基（WPM＋0.2 mg/L 6-BA）中并添加30 g/L蔗糖、5 g/L瓊脂及1.5 g/L活性炭進(jìn)行發(fā)育培養(yǎng)，調(diào)pH為5.8。培養(yǎng)30 d后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)方法如下：

胚發(fā)育率/%＝(發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù))×100胚萌發(fā)率/%＝(萌發(fā)胚數(shù)/接種胚珠數(shù))×100采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05）

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取樣時(shí)期對胚挽救結(jié)果的影響

如表2所示，發(fā)現(xiàn)‘紅巴拉多’ב戶太八號’的雜交胚在45 d取樣時(shí)胚發(fā)育率最高，胚發(fā)育率在52 d最高達(dá)到25%，胚發(fā)育率在66 d最高為11%。而‘紅巴拉多’ב巨玫瑰’雜交胚的發(fā)育率和萌發(fā)率都在授粉后59 d取樣達(dá)到最高分別為26%和14%。

2.2 胚發(fā)育培養(yǎng)天數(shù)對胚萌發(fā)率的影響

試驗(yàn)中將胚分別發(fā)育培養(yǎng)60 d、90 d、120 d，觀察其胚萌發(fā)率，如表3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘紅巴拉多’ב戶太八號’的雜交胚在培養(yǎng)90 d時(shí)胚萌發(fā)率高于其他兩個時(shí)期，而‘紅巴拉多’ב巨玫瑰’雜交胚達(dá)到最大胚萌發(fā)率的培養(yǎng)天數(shù)較長，為120 d。

2.3 不同父本對胚挽救結(jié)果的影響

從表4中可以看出，以‘紅巴拉多’為母本，通過對比胚發(fā)育率和萌發(fā)率，‘巨玫瑰’要比‘戶太八號’對于母本的親和性高，雜種胚生命力強(qiáng)，胚發(fā)育率及萌發(fā)率可分別達(dá)到26%和14%。但‘紅巴拉多’ב戶太八號’形成的胚珠數(shù)量明顯高于‘紅巴拉多’ב巨玫瑰’。

表 2 不同取樣時(shí)期對胚挽救結(jié)果的影響Table 2 Effect of different sampling time on embryo rescue

表 3 不同胚培養(yǎng)天數(shù)對胚萌發(fā)率的影響Table3 Effect of different training dates on germination emberyo

表4 不同父本對胚挽救結(jié)果的影響Table 4 Effect of different male parent genotypes on embryo rescue

3 討論與結(jié)論

獲得三倍體無核葡萄最有效的方法是通過二倍體與四倍體葡萄雜交。在二倍體與四倍體的雜交實(shí)驗(yàn)中，以二倍體為母本的組合，胚珠萌發(fā)率普遍高于以四倍體為母本的組合[10-12]。由于不同倍性父母本的遺傳背景不同，導(dǎo)致其具有遺傳差異，因而導(dǎo)致雜交障礙[13]，會使雜種胚在未成熟前發(fā)生敗育，胚挽救技術(shù)是克服這一障礙的有效手段，從而獲得大量的雜交后代。雜交胚珠的取樣時(shí)期是胚挽救成功的重要因素，郭修武等[14-15]發(fā)現(xiàn)最佳取樣時(shí)期與母本成熟期有很大關(guān)系。本試驗(yàn)以二倍體葡萄‘紅巴拉多’為母本，發(fā)現(xiàn)當(dāng)父本為‘戶太八號’時(shí)獲得的胚珠數(shù)量較多，且在授粉后45 d胚發(fā)育率最高，但萌發(fā)率為0，其原因可能是由于胚發(fā)育不夠成熟，過早取樣的胚生命力弱導(dǎo)致其不能萌發(fā)。‘紅巴拉多’ב巨玫瑰’的雜交胚在授粉后59 d時(shí)接種，胚發(fā)育率和萌發(fā)率都是最高，為其最佳的取樣時(shí)間。因此推測不同父本對取樣時(shí)間也有一些影響，這與徐海英等[11,16]的結(jié)果有差異，還需進(jìn)一步研究。除取樣時(shí)期外，胚的發(fā)育天數(shù)對胚的萌發(fā)率也有一定影響。本試驗(yàn)研究表明，‘紅巴拉多’ב戶太八號’的雜交胚，胚發(fā)育培養(yǎng)90 d時(shí)的胚萌發(fā)率明顯高于其他兩個時(shí)期，為最佳的胚發(fā)育培養(yǎng)時(shí)間?！t巴拉多’ב巨玫瑰’的雜交胚，胚萌發(fā)率隨培養(yǎng)天數(shù)的增加呈遞增趨勢，其最佳胚發(fā)育培養(yǎng)天數(shù)還有待進(jìn)一步研究。