王喜波 王玉瑩 周 淼 姜 朔 付 玲

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院, 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白是以低溫脫脂豆粕為原料，經(jīng)堿溶酸沉法制備的全價(jià)蛋白質(zhì)[1]。大豆分離蛋白應(yīng)用于食品中不僅能提高產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值，還可以調(diào)節(jié)功能特性[2]。在運(yùn)輸儲(chǔ)藏中，乳液食品通常需要冷藏或冷凍來保證品質(zhì)[3]或延長(zhǎng)保質(zhì)期，但乳液體系經(jīng)過冷凍后，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)脂肪聚結(jié)、冰晶析出、奧氏熟化等不穩(wěn)定的現(xiàn)象，嚴(yán)重破壞了乳液的結(jié)構(gòu)，使食品品質(zhì)發(fā)生劣變[4]。大豆分離蛋白常用作乳化劑以維持乳液食品體系的穩(wěn)定。天然大豆蛋白結(jié)構(gòu)較為致密，在食品體系中乳化功能較差，必須對(duì)其進(jìn)行適度改性才能滿足食品工業(yè)的要求。

美拉德反應(yīng)是一種公認(rèn)的蛋白質(zhì)改性方法。糖的加入會(huì)改變蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使其柔性和疏水性增大，而復(fù)合物能迅速吸附至油水界面形成立體網(wǎng)絡(luò)，增加界面膜的厚度，抵抗外界環(huán)境造成的干擾[5]。輻照作為一種新興的冷處理方法，能夠最大程度保證食物的原有風(fēng)味，同時(shí)還具有低能耗、低成本等優(yōu)點(diǎn)[6]。2003年國際食品法典委員會(huì)規(guī)定，在保證食品結(jié)構(gòu)的完整性、功能性和安全性的情況下，輻照劑量可大于10 kGy，這給輻照技術(shù)應(yīng)用于食品行業(yè)提供了保障[7]。研究表明，輻照通過改變蛋白分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的功能特性。輻照后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致性質(zhì)發(fā)生變化，增加輻射劑量，大豆分離蛋白乳化性提高[8]，α-螺旋含量下降，熒光光譜出現(xiàn)藍(lán)移[9]。經(jīng)伽馬射線輻照后，紅豆分離蛋白蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開、疏水基團(tuán)暴露，各種功能性質(zhì)均有所改善，但輻照劑量進(jìn)一步增加時(shí)，紅豆蛋白分子發(fā)生聚集，部分功能特性下降[10]。

目前，利用輻照技術(shù)輔助糖基化改性大豆蛋白的研究鮮有報(bào)道。本文利用γ射線輻照處理大豆分離蛋白與麥芽糖混合物，使其發(fā)生美拉德反應(yīng)，進(jìn)而改善大豆蛋白質(zhì)乳液體系的凍融穩(wěn)定性，旨在建立Box-Behnken模型、優(yōu)化出抗凍融大豆分離蛋白，以擴(kuò)大大豆蛋白在食品中的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂豆粕，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司;麥芽糖，湖北信康藥化有限公司;九三大豆油，黑龍江九三油脂有限責(zé)任公司;其他試劑均為分析純。

FJ300S型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司; 高壓均質(zhì)機(jī)，常州市超力均質(zhì)泵廠; 高速冷凍離心機(jī)，廣州吉迪儀器有限公司; 紫外可見分光光度計(jì)，菲勒儀器有限公司; 恒溫磁力攪拌器，天津合普公司；MS104TS型分析天平，上?；ǔ睂?shí)業(yè)有限公司；數(shù)顯型恒溫水浴鍋，江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司；YS-100YS-100型生物顯微鏡，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；FTIR-1500型傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技股份有限公司；掃描電子顯微鏡，德國卡爾蔡司公司；FD系列冷凍干燥機(jī)，上海豫明儀器設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法與指標(biāo)測(cè)定

1.2.1大豆分離蛋白制備

根據(jù)文獻(xiàn)[11]所述方法，略有改進(jìn)。將經(jīng)60目篩磨碎的低溫脫脂豆粉與去離子水按料液比10 g/mL混勻2 h后調(diào)pH值至8.5，除去離心后的不溶物，用HCl調(diào)pH值至4.5，靜置2 h后離心得沉淀。洗滌3次后用NaOH調(diào)pH值至7.0，冷凍干燥后得大豆分離蛋白。

1.2.2輻照糖基化大豆分離蛋白制備

將大豆分離蛋白(SPI)與麥芽糖(M)以一定質(zhì)量比(3、4、5)溶解于磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol/L、pH值7.0)中，充分混勻配制一定質(zhì)量濃度(30、40、50 mg/mL)的溶液。靜置12 h使其完全水化。取樣品溶液置于60Coγ 輻射源下進(jìn)行輻照反應(yīng)(輻照劑量為5、7.5、10 kGy)。將輻照后樣品冷凍干燥即得輻照SPI-M(輻照糖基化大豆分離蛋白)。

1.2.3接枝度

根據(jù)文獻(xiàn)[12]所述方法，略有改進(jìn)。將40 mg鄰苯二甲醛溶于1 mL甲醇、25 mL的0.1 mol/L四硼酸鈉后，分別加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的SDS(十二烷基硫酸鈉)和100 μL β-巰基乙醇，混勻后用超純水定容至50 mL即為OPA試劑，OPA試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。將4 mL OPA試劑與200 μL樣品溶液混合放入35℃水浴鍋中反應(yīng)2 min后于340 nm處測(cè)吸光度，以去離子水作空白。接枝度計(jì)算公式為

(1)

式中A1——接枝反應(yīng)前溶液吸光度

A2——接枝反應(yīng)后溶液吸光度

1.2.4傅里葉紅外光譜

根據(jù)文獻(xiàn)[13]所述方法，略有改進(jìn)。將樣品粉末壓制成薄片放于樣品臺(tái)的金剛石ATR(衰減全反射)附件上，調(diào)分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)8次，測(cè)量范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.5乳化性

根據(jù)文獻(xiàn)[14]所述方法，略有改進(jìn)。取30 mL 2 mg/mL樣品溶液與10 mL大豆油以轉(zhuǎn)速11 000 r/min均質(zhì)1 min后，分別于0 min和10 min在底部取100 μL分散在10 mL的SDS中，于500 nm測(cè)吸光度。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)計(jì)算公式為

(2)

式中A0——0 min時(shí)的吸光度

T——常數(shù)，取2.303

N——稀釋倍數(shù)，取100

φ——體系中油相所占的體積分?jǐn)?shù)，取25%

C——蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/mL

L——比色池光徑，cm

(3)

式中A10——10 min時(shí)的吸光度

ΔT——時(shí)間差，取10 min

1.2.6乳析指數(shù)

取90 mL樣品溶液與10 mL大豆油以轉(zhuǎn)速11 000 r/min均質(zhì)3 min后再60 MPa高壓均質(zhì)形成微乳液。將乳液于-22℃冰箱中冷凍22 h后在水浴鍋中解凍，進(jìn)行3次凍融循環(huán)[15-16]。乳析指數(shù)計(jì)算公式為

(4)

式中HS——乳清層高度，cm

HT——乳液總高度，cm

1.2.7出油率

根據(jù)文獻(xiàn)[17]所述方法，略有改進(jìn)。將8 g樣品乳液和2 g蘇丹Ⅲ油溶液充分混合以10 000 r/min離心20 min后取上清液于508 nm測(cè)定吸光度，大豆油為空白。出油率計(jì)算公式為

(5)

式中m0——蘇丹Ⅲ油溶液的質(zhì)量，g

me——乳液的質(zhì)量，g

a——離心前后蘇丹Ⅲ油溶液吸光度比值

φd——乳液中油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)，取20%

1.2.8掃描電鏡觀察分析

取一定量?jī)龈珊蟮臉悠?，采用?dǎo)電膠貼于載物臺(tái)上，并使用離子濺射儀鍍金。之后在S-3500N型掃描電子顯微鏡放大3 000倍下觀察樣品的微觀形貌，加速電壓為5 kV。

1.2.9光學(xué)顯微鏡觀察分析

根據(jù)文獻(xiàn)[18-19]所述方法，略有改進(jìn)。將凍融后的樣品乳液搖勻后取8 μL置于載玻片中，蓋上蓋玻片后置于顯微鏡的觀察區(qū)，調(diào)整倍數(shù)為400倍來觀察樣品乳液微觀狀態(tài)。

1.2.10輻照SPI-M制備工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果[20]，接枝度與第1次凍融后的乳析指數(shù)Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.915，呈顯著負(fù)相關(guān)，以其為響應(yīng)值，以SPI與M質(zhì)量比、SPI質(zhì)量濃度和輻照劑量為變量，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)方案，優(yōu)化高凍融穩(wěn)定性大豆蛋白制備工藝，因素編碼見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與編碼Tab.1 Box-Behnken experimental factors and codes

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用PeakFit 4.12軟件對(duì)紅外光譜進(jìn)行擬合計(jì)算，采用OriginPro 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1試驗(yàn)結(jié)果

在前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上[20]，對(duì)SPI與M質(zhì)量比、SPI質(zhì)量濃度和輻照劑量3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，以接枝度和第1次凍融后的乳析指數(shù)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)分析試驗(yàn)，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)為零點(diǎn)，析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3(SPI與M質(zhì)量比、SPI質(zhì)量濃度、輻照劑量的編碼值)所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，其中零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，以估計(jì)試驗(yàn)誤差。結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimental results of Box-Behnken experiment

2.1.2模型建立及顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到響應(yīng)值對(duì)SPI與M質(zhì)量比、SPI質(zhì)量濃度和輻照劑量3個(gè)因素的回歸方程為

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)方差分析Tab.3 Variance and significant analysis of Box-Behnken design test

為了更合理表現(xiàn)各因素交互作用對(duì)大豆分離蛋白凍融特性的影響，對(duì)各因素與響應(yīng)面值構(gòu)成的三維空間響應(yīng)面圖進(jìn)行分析。由圖2知，當(dāng)SPI與M質(zhì)量比、SPI質(zhì)量濃度和輻照劑量中的1個(gè)因素固定在0水平時(shí)，另外2個(gè)因素都對(duì)接枝度和乳析指數(shù)有交互影響。由圖2a知，當(dāng)輻照劑量一定時(shí)，隨著SPI質(zhì)量濃度的增加，輻照SPI-M的接枝度先上升后下降，可能是因?yàn)榈鞍追肿雍康脑黾樱哟罅伺c麥芽糖分子的碰撞幾率，接枝程度增加，但蛋白含量過大導(dǎo)致反應(yīng)體系黏度過大不利于發(fā)生美拉德反應(yīng)[21]。當(dāng)輻照劑量一定時(shí)，糖比例降低時(shí)，糖分子移動(dòng)空間大，能迅速與蛋白分子發(fā)生接枝反應(yīng)，接枝度增加，但糖進(jìn)一步降低，不足以與蛋白質(zhì)充分發(fā)生反應(yīng)，接枝度下降[22]。同樣，當(dāng)SPI與M質(zhì)量比和SPI質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著輻照劑量的增加，輻照SPI-M的接枝度依然呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，可能是因?yàn)檩椪仗幚泶蜷_了蛋白分子的結(jié)構(gòu)，增加了與糖的結(jié)合機(jī)率[23]。接枝度和乳析指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，接枝度越大乳析指數(shù)越小[24]。由圖2b知，乳析指數(shù)隨SPI質(zhì)量濃度和輻照劑量的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，當(dāng)SPI與M質(zhì)量比減小的時(shí)候，也表現(xiàn)出了同樣的變化?？赡苁禽椪仗幚砀淖兞说鞍踪|(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，隨著糖鏈的引入，增加了界面膜的機(jī)械強(qiáng)度，阻止了尖銳的冰晶對(duì)界面膜破壞，改善了凍融特性[25-26]。通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，預(yù)測(cè)在穩(wěn)定狀態(tài)下的最佳工藝條件為SPI與M質(zhì)量比4.04、SPI質(zhì)量濃度39.01 mg/mL、輻照劑量7.49 kGy?？紤]到試驗(yàn)條件的可操作性，將優(yōu)化的最佳條件修改為：SPI與M質(zhì)量比4、SPI質(zhì)量濃度40 mg/mL、輻照劑量7.5 kGy。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，接枝度平均值為34.56%和第1次凍融后的乳析指數(shù)平均值為27.18%，模型預(yù)測(cè)值接枝度為34.55%和第1次凍融后的乳析指數(shù)為27.16%，證明本模型優(yōu)化工藝參數(shù)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

圖1 預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的對(duì)照?qǐng)DFig.1 Comparison of predicted and observed values

2.1.3響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖2 各因素對(duì)大豆分離蛋白凍融特性的影響Fig.2 Effect of various factors on freeze-thaw properties of soy protein isolate

2.2 不同樣品凍融特性分析

在冷凍和解凍處理之后，由于油相和水相之間的密度差異，乳劑顯示出乳化或沉降現(xiàn)象，乳液中的不穩(wěn)定性主要?dú)w因于冷凍過程中冰晶形成的不穩(wěn)定效應(yīng)[3]。本試驗(yàn)設(shè)定了SPI和SPI+M(無輻照)2個(gè)對(duì)照組，分析進(jìn)行3次凍融循環(huán)后樣品的凍融特性。由表4可知，經(jīng)過凍融循環(huán)后，樣品乳液的乳析指數(shù)顯著增加，尤其是SPI。單純添加麥芽糖的SPI+M對(duì)比SPI凍融特性雖有改善，但效果不明顯。而輻照SPI-M在經(jīng)歷凍融循環(huán)后，乳析指數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，表現(xiàn)出較好的凍融特性。對(duì)比SPI，乳析指數(shù)分別降低了22.98、28.40、30.70個(gè)百分點(diǎn)。可能是因?yàn)檩椪沾蜷_了蛋白分子的結(jié)構(gòu)，釋放了更多的游離氨基，增加了與糖分子的碰撞機(jī)會(huì)，引入的糖鏈在界面膜附近形成立體網(wǎng)絡(luò)，增加了界面膜的厚度，抵抗形成的冰晶對(duì)界面膜的破壞，防止液滴間的聚集，其凍融穩(wěn)定性顯著提高[23,27]。文獻(xiàn)[28]的研究表明，多糖可以吸附到蛋白質(zhì)層形成較厚的界面膜，增加乳液的穩(wěn)定性。

表4 SPI、SPI+M及輻照SPI-M乳析指數(shù)分析Tab.4 SPI, SPI+M and irradiated SPI-M creaming index analysis %

表5為SPI、SPI+M及輻照SPI-M的乳化性和經(jīng)歷凍融后的出油率變化。由表5可知，輻照SPI-M乳化活性和乳化穩(wěn)定性比SPI和SPI+M要好，而SPI和SPI+M乳化性相差不大，說明單純的添加糖并不會(huì)對(duì)乳化性有所改變。文獻(xiàn)[29]也表明蛋白質(zhì)-糖綴合物的乳化性能優(yōu)于蛋白質(zhì)和糖的混合物。輻照SPI-M的乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)對(duì)比SPI分別提高了9.26 m2/g和3.76 min?？赡苁且?yàn)檩椪仗幚硪胩擎?，溶解性增加，進(jìn)而提高了乳化性[22]。出油率是表征凍融特性的重要指標(biāo)之一，出油率越低，乳液越穩(wěn)定[30]?？蓮谋?明顯看出，歷經(jīng)凍融循環(huán)后，SPI和SPI+M出油率急劇增加，SPI+M比SPI雖有降低，但總體改善不大。輻照SPI-M具有較低出油率，與SPI相比，出油率分別降低了9.7、21.2、26.4個(gè)百分點(diǎn)?？赡苁且?yàn)槿榛栽黾樱瑴p少了油滴的碰撞，穩(wěn)定了乳液[31]。

表5 SPI、SPI+M及輻照SPI-M乳化性和出油率分析Tab.5 Analysis of emulsification and oiling off of SPI, SPI+M and irradiated SPI-M

2.3 紅外光譜分析

紅外光譜是分析糖是否與蛋白質(zhì)共價(jià)相連的重要手段之一，光譜圖吸收峰的變化與樣品各基團(tuán)的改變相對(duì)應(yīng)。紅外光譜圖上—OH基團(tuán)在3 700～3 200 cm-1處出現(xiàn)較寬的伸縮振動(dòng)峰，C—N鍵在1 260～1 000 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)的振動(dòng)[32-33]。由圖3可知，與SPI對(duì)比，輻照SPI-M在1 260～1 000 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了較強(qiáng)的振動(dòng)，新吸收峰出現(xiàn)，說明C—N鍵的數(shù)量增加，新生成了C—N基團(tuán)，證明大豆分離蛋白與麥芽糖是以共價(jià)鍵的方式結(jié)合[34]。文獻(xiàn)[35]通過超聲波和微波輔助糖基化制備大豆分離蛋白-葡聚糖綴合物，傅里葉變換紅外分析證明大豆分離蛋白和葡聚糖通過美拉德反應(yīng)形成了共價(jià)鍵。與SPI對(duì)比，輻照SPI-M在3 700～3 200 cm-1處出現(xiàn)了較寬的吸收峰，是由—OH的伸縮振動(dòng)引起的，表明大豆分離蛋白與麥芽糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，糖分子的接入使輻照SPI-M的親水性羥基數(shù)量增加。SPI+M混合物的紅外光譜中并未在3 700～3 200 cm-1處出現(xiàn)較寬的吸收峰，表明單純的混合糖后，SPI結(jié)構(gòu)并未產(chǎn)生新的基團(tuán)。

圖3 SPI、SPI+M及輻照SPI-M紅外光譜圖Fig.3 SPI, SPI+M and irradiated SPI-M infrared spectroscopy

2.4 掃描電鏡分析

蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)變化影響其功能性質(zhì)，掃描電鏡圖像可以提供樣品精細(xì)的表面形貌。圖4為凍干后未經(jīng)處理的SPI和輻照SPI-M的放大3 000倍的微觀結(jié)構(gòu)圖。從圖中可見輻照處理前后大豆分離蛋白的微觀結(jié)構(gòu)具有明顯的區(qū)別。大豆分離蛋白在未處理之前表面平滑，而輻照SPI-M表現(xiàn)為出現(xiàn)細(xì)小空隙的凹洞，呈蜂窩狀，形成疏松孔洞，呈現(xiàn)出良好的持水性。文獻(xiàn)[36]也支持本文假設(shè)，即均勻的網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)有利于吸水能力的提高。文獻(xiàn)[37]表明大豆分離蛋白與葡聚糖緊密結(jié)合，得出了與本文相似的結(jié)果。

圖4 SPI及輻照SPI-M微觀結(jié)構(gòu)Fig.4 SPI and irradiation SPI-M microstructure

2.5 光學(xué)顯微鏡分析

圖5為SPI及輻照SPI-M乳液凍融前后的光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)，由圖5可知，SPI和輻照SPI-M初始乳液并沒有出現(xiàn)明顯區(qū)別，但經(jīng)過冷凍處理后，可明顯看出SPI出現(xiàn)許多較大油滴和團(tuán)塊，可能是因?yàn)槔鋬龊?，乳液中水分遇低溫體積變大，形成尖銳的冰晶刺破界面膜，油滴滲透聚集形成大油滴[38]。而輻照SPI-M只出現(xiàn)部分小油滴，乳液性質(zhì)穩(wěn)定。文獻(xiàn)[35,39]的研究結(jié)果也表明糖基化改性產(chǎn)物在凍融后表現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖5 SPI及輻照SPI-M乳液凍融前后的光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)Fig.5 Optical microstructures of SPI and irradiated SPI-M emulsion before and after freeze-thaw

3 結(jié)束語

利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)建立Box-Behnken模型，對(duì)輻照?qǐng)鱿绿腔男灾苽涓邇鋈诜€(wěn)定性大豆蛋白工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳制備條件為：SPI與M質(zhì)量比4、SPI質(zhì)量濃度40 mg/mL、輻照劑量7.5 kGy。在此條件下得到的改性SPI與對(duì)照SPI相比，乳析指數(shù)分別降低了22.98、28.40、30.70個(gè)百分點(diǎn)，出油率分別降低了9.7、21.2、26.4個(gè)百分點(diǎn)。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)對(duì)比SPI分別提高了9.26 m2/g和3.76 min。說明該模型合理、可靠，能夠改善大豆分離蛋白的凍融性。紅外光譜表明，大豆分離蛋白與麥芽糖發(fā)生美拉德反應(yīng)。掃面電鏡表明，輻照SPI-M呈蜂窩狀，具有良好的持水性。光學(xué)顯微鏡分析表明，在冷凍和解凍處理之后，輻照SPI-M乳液更穩(wěn)定。說明采用輻照處理能使大豆分離蛋白與麥芽糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，并改善大豆分離蛋白凍融特性。