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牛肌紅蛋白熱加工過程中多肽穩(wěn)定性影響因素分析及其在真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用

2020-10-29 06:16李瑩瑩康超娣張穎穎趙文濤李家鵬李慧晨王守偉
食品科學(xué) 2020年19期
關(guān)鍵詞:肌球蛋白肌紅蛋白響應(yīng)值

李瑩瑩,康超娣,張穎穎,趙文濤,李家鵬,李慧晨,王守偉

(北京食品科學(xué)研究院,中國肉類食品綜合研究中心,北京 100068)

食品欺詐已成為食品質(zhì)量和安全領(lǐng)域中較為顯著的問題[1-2]。尤其是以肉類為主的高附加值的高度加工食品,屬于摻假風(fēng)險(xiǎn)較高的一類食品。隨著消費(fèi)者的廣泛關(guān)注以及摻假鑒別技術(shù)的涌現(xiàn),摻假手段不斷翻新且越來越隱蔽,通過特定的加工處理,如高溫高壓,或是添加輔料及添加劑(如鹽、辣椒、防腐劑等)用于增強(qiáng)風(fēng)味,遮蔽原有味道[3-4],使得無法從外觀識(shí)別物種形態(tài)[5-6],或采用廉價(jià)肉類代替高價(jià)肉類以達(dá)到摻假的目的[7]。食品摻雜摻假現(xiàn)象不僅侵犯了消費(fèi)者的利益,而且破壞了食品市場(chǎng)的秩序和食品安全質(zhì)量監(jiān)管[8-9],甚至危害了消費(fèi)者的身體健康,在某種程度上還會(huì)引發(fā)宗教問題[10-11]。因此,建立快速、高效、準(zhǔn)確的摻假鑒別方法對(duì)于保障食品安全具有重要意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)以蛋白質(zhì)為研究對(duì)象,具有高選擇性、高通量和全面性等特點(diǎn),可對(duì)一個(gè)基因組或組織、細(xì)胞全部的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分析[12-13],基于蛋白質(zhì)組學(xué)的質(zhì)譜方法作為一種新興的方法是目前食品鑒偽的熱點(diǎn)[14-15]。該技術(shù)將篩選的各物種靶標(biāo)多肽作為分析目標(biāo)[16],不但可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肉類成分的鑒別[17],而且可以實(shí)現(xiàn)植物、動(dòng)物的多物種同時(shí)鑒別,尤其適用于非常復(fù)雜和高度加工的食品基質(zhì)[18-19],是一種快速、靈敏、特異以及高通量判別方法[20],能夠滿足當(dāng)前監(jiān)管的需要,具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

靶標(biāo)多肽的選擇是構(gòu)建質(zhì)譜方法的關(guān)鍵所在[21],當(dāng)前研究多是通過對(duì)比生肉和熟肉制品尋找穩(wěn)定蛋白,進(jìn)而篩選出肉制品中更穩(wěn)定的多肽[22-23],比如Montowska等[23]利用蛋白質(zhì)二維電泳圖譜對(duì)比了豬、牛、雞、驢、鴨、鵝的生肉與加熱處理的熟肉,發(fā)現(xiàn)血清白蛋白、載脂蛋白B、熱休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)、心型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart-type fatty acid binding protein,H-FABP)等加熱前后有很大差別;Sarah等[24]對(duì)豬肉分別進(jìn)行100 ℃煮沸30 min、121 ℃高溫高壓滅菌20 min以及4 ℃冷藏30 min,對(duì)比發(fā)現(xiàn)這3 種處理的豬肉蛋白有4 條多肽始終存在,可以作為豬肉穩(wěn)定性特異標(biāo)記物。在前期研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高度加工的肉制品靶標(biāo)多肽響應(yīng)值和生肉相比明顯下降[25],但對(duì)加工環(huán)節(jié)靶標(biāo)多肽穩(wěn)定性的影響因素缺少系統(tǒng)性研究。

Giaretta等[26]研究發(fā)現(xiàn)牛肌紅蛋白的穩(wěn)定性良好,可以用作牛的特異性標(biāo)記物。該蛋白共有154 個(gè)氨基酸殘基,按照胰蛋白酶酶切位點(diǎn)可獲得13 條多肽,覆蓋了短肽鏈、中肽鏈、長肽鏈,同時(shí)既有牛的獨(dú)有肽段(肽段7#),也有和豬、馬等其他物種共同具有的肽段。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上,以牛肌紅蛋白酶解的多肽和來自于8 種不同蛋白的多肽為研究對(duì)象,探討各條多肽在熱加工環(huán)節(jié)中穩(wěn)定性的變化規(guī)律,從加工方式、加工環(huán)節(jié)的化學(xué)因素中提取出對(duì)多肽穩(wěn)定性影響較大的因素,包括加工方式(蒸煮、油炸、高壓)、加熱溫度及時(shí)間、輔料(氯化鈉添加量、辣椒素含量)、食品添加劑(以亞硝酸鈉、山梨酸為代表的防腐劑)、金屬離子(K+、Ca2+、Mg2+),研究各個(gè)因素對(duì)目標(biāo)蛋白及多肽豐度的影響,為進(jìn)一步選擇熱穩(wěn)定性強(qiáng)的靶標(biāo)多肽用于肉類的真實(shí)性鑒別提供理論依據(jù),并為其他蛋白及多肽在研究熱加工過程中的影響因素提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮牛肉由河北省福成五豐食品股份有限公司燕郊養(yǎng)殖分公司提供。

胰蛋白酶(測(cè)序級(jí))、二硫蘇糖醇(生化級(jí)) 美國Promega公司;碘乙酰胺(生化級(jí)) 美國Sigma公司;甲酸、乙酸、乙腈(均為色譜純) 德國CNW科技公司;HLB固相萃取柱 美國Waters公司;尿素、硫脲、鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ ultra EMR 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源、TraceFinder 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))美國Thermo Fisher公司;往返式水浴恒溫?fù)u床 上海智誠分析儀器制造有限公司;Ultra-Turrax T25均質(zhì)器德國IKA公司;20PR-520離心機(jī) 日本Hitachi公司;MLS-3020高壓鍋 日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉的處理

將牛肉切成4 cm×4 cm×2 cm規(guī)格的小塊,對(duì)其進(jìn)行蒸煮、油炸、高壓和添加添加劑、輔料、金屬離子處理。

蒸煮處理:取18 塊切好的牛肉小塊,隨機(jī)分成6 組(第1組:60 ℃、5 min,第2組:100 ℃、5 min,第3~6組:80 ℃分別加熱5、10、15、30 min),加熱后取出,冷卻至室溫,每組3 個(gè)平行,進(jìn)行加熱時(shí)間和加熱溫度的單因素試驗(yàn)。

油炸處理:取3 塊切好的牛肉小塊,放入100 ℃恒溫油炸鍋內(nèi),油炸5 min后,取出冷卻至室溫。

高壓處理:取3 塊切好的牛肉小塊,放入高壓滅菌鍋內(nèi),121 ℃、15 MPa高壓處理15 min,取出冷卻至室溫。

添加添加劑處理:取18 塊切好的牛肉小塊,隨機(jī)分成6 個(gè)組,加入山梨酸(添加量分別為20、45、75 mg/kg)和亞硝酸鈉(添加量分別為10、30、50 mg/kg)。添加后靜置30 min,均質(zhì)待測(cè)。

添加輔料處理:取18 塊切好的牛肉小塊,隨機(jī)分成6 個(gè)組,分別加入氯化鈉(添加量分別為0.015、0.025、0.035 g/kg)和辣椒素(添加量分別為0.005、0.01、0.02 g/kg)。添加后靜置30 min,均質(zhì)待測(cè)。

添加金屬離子處理:取27 塊切好的牛肉小塊,隨機(jī)分成9 個(gè)組,每組3 個(gè)平行。金屬離子為K+(KCl)、Ca2+(CaCl2)和Mg2+(MgCl2),均分別設(shè)置3 種不同濃度(10、50、250 mmol/L),添加后靜置30 min,均質(zhì)待測(cè)。

1.3.2 多肽的LC-MS/MS分析

參照前期研究中樣品制備的前處理方法獲得多肽,通過LC-MS/MS方法實(shí)現(xiàn)對(duì)特征性多肽的分析[27]。將牛肌紅蛋白按照胰蛋白酶的理論酶解方式得到的13 條多肽鏈導(dǎo)入至Skyline軟件中,從而得到每個(gè)多肽鏈的離子對(duì)信息,將離子對(duì)導(dǎo)入至LC-MS/MS中,對(duì)13 條多肽進(jìn)行檢測(cè),通過對(duì)比離子保留時(shí)間、峰面積、峰形、離子比率等條件,篩選可用于LC-MS/MS分析的多肽離子信息。去掉5 種響應(yīng)值低的多肽,本研究選擇來自牛肌紅蛋白的肽段1#~8#,以及來自于半乳凝集素-1、肌球蛋白輕鏈3、NAD-3-磷酸甘油脫氫酶、血清白蛋白、肌球蛋白-2、L-乳酸脫氫酶A鏈、肌球蛋白-1和α-1,4-葡聚糖磷酸化酶這8 種蛋白的肽段9#~18#作為研究對(duì)象。利用TraceFinder軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring,MRM)掃描,詳細(xì)的離子對(duì)信息見表1。

表1 牛肌紅蛋白和其他蛋白的MRM采集參數(shù)Table 1 MRM MS instrument parameters for bovine myoglobin and other proteins

1.3.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選的多肽在實(shí)際物種鑒別中的適用性,市購11 種不同的牛肉制品進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每批實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 個(gè)平行,通過對(duì)比不同處理?xiàng)l件下每個(gè)多肽定量離子的峰面積,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及最小顯著性差異法多重比較,以進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,最終篩選出對(duì)多肽影響比較顯著的條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱條件對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響

2.1.1 加熱方式對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響

表2 蒸煮、油炸和高壓對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of boiling, frying, and high pressure processing on the stability of peptides

由表2可知,經(jīng)不同加熱方式處理后,肽段1#、肽段2#、肽段3#和肽段6#響應(yīng)值均無顯著變化(P>0.05),說明在蒸煮、油炸和高壓處理?xiàng)l件下這4 種多肽較穩(wěn)定,且肽段2#在這3 種加熱方式處理下響應(yīng)值均較高,而肽段4#、肽段5#、肽段7#和肽段8#響應(yīng)值在經(jīng)這3 種加熱方式處理后均具有顯著性變化,說明這4 種多肽穩(wěn)定性較弱。綜上所述,不同加熱方式對(duì)牛肌紅蛋白中的多肽穩(wěn)定性具有不同程度的影響,說明加熱方式是影響多肽穩(wěn)定的重要原因之一。

2.1.2 加熱溫度對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響

表3 不同溫度加熱5 min對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of heating temperature on the stability of peptides

由表3 可知,經(jīng)6 0、8 0 ℃和1 0 0 ℃處理5 m i n后,牛肌紅蛋白酶解后的多肽響應(yīng)值均無顯著差異(P>0.05),結(jié)果表明,不同加熱溫度處理對(duì)牛肌紅蛋白中多肽穩(wěn)定性均無影響。

2.1.3 加熱時(shí)間對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響

表4 80 ℃條件下加熱時(shí)間對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of heating time on the stability of peptides at 80 ℃

由表4可知,在80 ℃條件下,5~30 min時(shí),隨著加熱時(shí)間的延長,肽段1#、肽段2#、肽段3#、肽段4#、肽段5#、肽段7#和肽段8#響應(yīng)值均無顯著變化(P>0.05),表明在80 ℃條件下不同加熱時(shí)間對(duì)這7 種多肽的穩(wěn)定性無影響,且肽段2#在80 ℃不同加熱時(shí)間下響應(yīng)值均較高。Wang Guiji等[28]對(duì)5 種肉類類型(豬肉、雞肉、鴨肉、牛肉和羊肉)分別進(jìn)行100 ℃煮沸3 min和5 min、150 ℃燒烤7 min和10 min以及180 ℃燒烤5 min和8 min,結(jié)果表明,加工溫度和時(shí)間對(duì)多肽的穩(wěn)定性無顯著影響,本研究結(jié)果與其一致。

2.2 加工因子對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響

2.2.1 添加劑對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響

由表5和表6可知,添加不同劑量的山梨酸和亞硝酸鈉后,肽段1#、肽段3#、肽段5#、肽段6#和肽段8#的響應(yīng)值均無顯著變化(P>0.05),說明添加山梨酸和亞硝酸鈉對(duì)這5 種多肽穩(wěn)定性均無影響。添加不同劑量山梨酸(20、45、75 mg/kg)后,僅肽段7#的響應(yīng)值發(fā)生顯著性變化。添加不同劑量亞硝酸鈉(10、30、50 mg/kg)后,僅肽段2#和肽段4#響應(yīng)值發(fā)生不同程度變化。以上結(jié)果表明,山梨酸和亞硝酸鈉并非是影響多肽穩(wěn)定性的主要因素。

表5 山梨酸添加量對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of sorbic acid content on the stability of peptides

表6 亞硝酸鈉添加量對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 6 Effect of sodium nitrite content on the stability of peptides

2.2.2 輔料對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響

表7 氯化鈉添加量對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 7 Effect of sodium chloride content on the stability of peptides

由表7 可知,添加不同劑量的氯化鈉后,肽段2#、肽段3#、肽段4#和肽段6#響應(yīng)值均無顯著變化(P>0.05),且肽段2#的響應(yīng)值最高,說明肽段2#最穩(wěn)定,而肽段1#、肽段5#、肽段7#和肽段8#響應(yīng)值均發(fā)生變化,說明添加氯化鈉對(duì)多肽穩(wěn)定性影響較大。

由表8可知,添加不同劑量的辣椒素后,僅肽段3#和肽段7#響應(yīng)值發(fā)生不同程度變化,肽段2#響應(yīng)值最高且添加不同劑量辣椒素后無顯著差異。以上結(jié)果表明,添加氯化鈉可能是影響多肽穩(wěn)定性的主要因素之一。

表8 辣椒素添加量對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 8 Effect of capsaicin content on the stability of peptides

2.2.3 金屬離子對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響

表9 K濃度對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 9 Effect of K+content on the stability of peptides

表9 K濃度對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 9 Effect of K+content on the stability of peptides

肽段編號(hào) 峰面積(×106)10 mmol/L 50 mmol/L 250 mmol/L肽段1# 1.723±0.230 1.593±0.045 1.607±0.036肽段2# 9.358±1.548 8.867±0.724 8.846±0.658肽段3# 1.583±0.179 1.479±0.003 1.410±0.111肽段4# 2.365±0.127 2.420±0.057 2.412±0.003肽段5# 1.310±0.057 1.222±0.062 1.000±0.313肽段6# 0.212±0.014 0.199±0.003 0.180±0.030肽段7# 0.531±0.040 0.544±0.008 0.476±0.016肽段8# 3.027±0.258 2.837±0.035 2.646±0.109

表10 Ca2濃度對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 10 ffect of Ca2+content on the stability of peptides

表10 Ca2濃度對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 10 ffect of Ca2+content on the stability of peptides

肽段編號(hào) 峰面積(×106)10 mmol/L 50 mmol/L 250 mmol/L肽段1# 1.508±0.072 1.356±0.156 1.494±0.219肽段2# 8.325±0.275 8.047±0.096 8.085± 0.160肽段3# 1.358±0.049 1.343±0.184 1.369± 0.201肽段4# 2.071±0.232 2.084±0.050 1.871± 0.196肽段5# 1.213±0.141a 0.990±0.065ab 0.781±0.028b肽段6# 0.183±0.002 0.173±0.015 0.173± 0.014肽段7# 0.472±0.010 0.504±0.056 0.472± 0.036肽段8# 2.587±0.084 2.508±0.455 2.524± 0.360

表11 Mg2濃度對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 11 ffect of Mg2+content on the stability of peptides

表11 Mg2濃度對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響Table 11 ffect of Mg2+content on the stability of peptides

肽段編號(hào) 峰面積(×106)10 mmol/L 50 mmol/L 250 mmol/L肽段1# 1.507±0.122a 1.486±0.048a 1.770±0.041b肽段2# 7.746±0.822 7.971±0.431 9.441±0.227肽段3# 1.257±0.244 1.271±0.036 1.544±0.016肽段4# 2.107±0.089 1.949±0.236 2.491±0.110肽段5# 1.157±0.044a 1.058±0.028ab 1.002±0.021b肽段6# 0.184±0.016a 0.185±0.005a 0.228±0.002b肽段7# 0.452±0.043a 0.469±0.015a 0.538±0.007b肽段8# 2.478±0.425 2.667±0.114 2.906±0.017

由表9可知,添加不同濃度的KCl后,牛肌紅蛋白中的多肽穩(wěn)定性均無顯著變化(P>0.05)。添加不同濃度的CaCl2后,僅肽段5#響應(yīng)值發(fā)生變化(表10)。添加不同濃度的MgCl2后,肽段1#、肽段5#、肽段6#和肽段7#響應(yīng)值均發(fā)生顯著性變化(表11),說明Mg2+影響這4 種多肽的穩(wěn)定性;此外,肽段2#在不同金屬離子(K+、Ca2+和Mg2+)濃度下的響應(yīng)值均最高且無顯著性變化,說明穩(wěn)定性較好。綜上,Mg2+可能是影響多肽穩(wěn)定性的主要因素之一。

2.3 不同因素對(duì)來源于其他蛋白的多肽穩(wěn)定性的影響

上述研究結(jié)果表明,加熱方式、氯化鈉和Mg2+顯著影響牛肌紅蛋白中多肽的穩(wěn)定性,因此為了驗(yàn)證加熱方式、輔料、添加劑和Mg2+對(duì)多肽熱穩(wěn)定性的影響規(guī)律,本實(shí)驗(yàn)選用來源于其他蛋白(表1)的多肽再次研究加工過程中重要因素(加熱方式、氯化鈉和Mg2+)對(duì)多肽的影響。

2.3.1 加熱方式對(duì)其他來源多肽穩(wěn)定性的影響

表12 蒸煮、油炸和高壓對(duì)其他來源多肽穩(wěn)定性的影響Table 12 Effect of boiling, frying, and high pressure processing on the stability of peptides from other proteins

由表12可知,經(jīng)蒸煮(100 ℃)、油炸和高壓3 種加熱方式處理后,肽段9#、肽段11#、肽段12#、肽段15#、肽段16#和肽段17#響應(yīng)值發(fā)生顯著性變化,說明這6 種多肽在蒸煮、油炸和高壓3 種處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性較弱,而肽段10#、肽段13#、肽段14#和肽段18#響應(yīng)值未發(fā)生顯著變化(P>0.05),說明這4 種多肽較穩(wěn)定,且肌球蛋白-2的肽段13#在這3 種加熱方式處理下響應(yīng)值均較高,說明肽段13#穩(wěn)定性最強(qiáng)。綜上所述,對(duì)來源于不同蛋白的多肽而言,加熱方式也是影響其穩(wěn)定性的重要因素。

2.3.2 氯化鈉對(duì)其他來源多肽穩(wěn)定性的影響

由表13可知,添加不同劑量的氯化鈉后,肽段10#、肽段11#、肽段13#、肽段16#和肽段18#響應(yīng)值均無顯著變化(P>0.05),且肌球蛋白-2的肽段13#響應(yīng)值較高,說明肌球蛋白-2的肽段13#最穩(wěn)定,而肽段9#、肽段12#、肽段14#、肽段15#和肽段17#響應(yīng)值均發(fā)生顯著變化,說明添加氯化鈉影響多肽穩(wěn)定性。結(jié)果表明,添加氯化鈉也是影響多肽穩(wěn)定性的主要因素之一。

表13 氯化鈉添加量對(duì)其他來源多肽穩(wěn)定性的影響Table 13 Effect of sodium chloride content on the stability of peptides from other proteins

2.3.3 Mg2+濃度對(duì)其他來源多肽穩(wěn)定性的影響

表14 Mg2+濃度對(duì)其他來源多肽穩(wěn)定性的影響Table 14 Effect of Mg2+content on the stability of peptides from other proteins

由表14可知,添加不同劑量的MgCl2后,肽段11#、肽段14#、肽段15#、肽段16#和肽段18#響應(yīng)值均發(fā)生顯著性變化,說明Mg2+影響多肽穩(wěn)定性。由上述結(jié)果可知,對(duì)來源于不同蛋白的多肽而言,加熱方式、氯化鈉和Mg2+顯著影響多肽的穩(wěn)定性,肌球蛋白-2的肽段13#在3 種加熱方式、添加氯化鈉及Mg2+條件下的響應(yīng)值均最高,且在相同處理方式不同組別之間無顯著差異,說明肽段13#易被質(zhì)譜檢測(cè),響應(yīng)值最高,穩(wěn)定性高,且是獨(dú)有多肽(表1),Orduna等[29]建立了一種高分辨率軌道離子阱質(zhì)譜方法來確定肉類真?zhèn)?,同樣發(fā)現(xiàn)肌球蛋白-2可用于肉類的真實(shí)性鑒定,但研究對(duì)象僅限于生肉樣品。本研究通過熱加工過程處理后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源于肌球蛋白-2的肽段13#用于肉制品真實(shí)性鑒別的優(yōu)勢(shì)也更為顯著。

2.4 多肽的物理化學(xué)性質(zhì)

牛肌紅蛋白中的多肽(肽段1#~8#)和來源于不同蛋白的多肽(肽段9#~18#)的物化性質(zhì)見表15。借助多肽計(jì)算器(http://www.chinapeptides.com/tool.aspx)對(duì)多肽分析,序列分析顯示出這些多肽的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、凈電荷和親水殘基比例存在差異,但這些差異并不是影響多肽響應(yīng)值較高的主要因素。肽段2#是疏水性氨基酸的疏水性多肽,但本研究表明肽段2#易被質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè),具有較強(qiáng)的響應(yīng)值且非常穩(wěn)定,這可能與氨基酸組成、多肽結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)參數(shù)有關(guān)。來源于肌球蛋白-2的肽段13#是親水性氨基酸組成的親水性多肽,其溶解性較好,經(jīng)熱加工過程等多種因素處理后易被質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè),其響應(yīng)值均較高,穩(wěn)定性強(qiáng),這可能取決于多肽結(jié)構(gòu)。據(jù)報(bào)道肉經(jīng)腌制、蒸煮、燒烤、干燥、煙熏、殺菌等工藝處理后,會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,其構(gòu)象、分子作用力、三維結(jié)構(gòu)等發(fā)生一系列的變化,但肽段的氨基酸序列(蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu))受影響較小[30-31],考慮到開展真實(shí)性鑒別,需要選擇物種的特異性多肽,結(jié)合表2可知,來源于肌球蛋白-2的肽段13#作為肉制品樣品摻假檢測(cè)所選的特征多肽優(yōu)勢(shì)更為顯著。

表15 多肽的物理化學(xué)性質(zhì)Table 15 Physicochemical properties of peptides

2.5 真實(shí)性鑒別中的應(yīng)用

采用本研究方法對(duì)11 種類型的市售牛肉制品樣品進(jìn)行鑒別(表16),其中5號(hào)樣品五香牛肉干的主成分雖然標(biāo)稱是牛肉,但所有多肽都未檢出,可見此樣品為摻假樣品,其余的10 件產(chǎn)品均含有牛肉成分。對(duì)來源于牛肌紅蛋白的肽段1#~8#而言,其余10 件牛肉制品樣品的肽段1#、2#、3#和8#響應(yīng)值較高,且肽段2#的響應(yīng)值相對(duì)最高;對(duì)來源于不同蛋白的肽段9#~8#而言,其余10 件牛肉制品樣品的肽段13#響應(yīng)值總體考慮相對(duì)較高;因此,本研究結(jié)果選擇穩(wěn)定性較強(qiáng)的靶標(biāo)多肽(牛肌紅蛋白中肽段2#和來源于肌球蛋白-2的肽段13#)用于牛肉制品真實(shí)性鑒別中具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。

表16 選擇的肽段在市售牛肉制品樣品的鑒別應(yīng)用Table 16 Application of selected peptides in the identification of commercially available beef products in markets

3 結(jié) 論

本研究針對(duì)牛肌紅蛋白熱加工過程中多肽穩(wěn)定性影響因素進(jìn)行初步研究,探討加熱條件和加工因子對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響規(guī)律,同時(shí)對(duì)市售牛肉制品進(jìn)行真實(shí)性鑒別。通過研究加熱方式(蒸煮、油炸、高壓)、加熱溫度及時(shí)間、輔料(氯化鈉添加量、辣椒素含量)、食品添加劑(防腐劑代表亞硝酸鈉、山梨酸)、金屬離子(K+、Ca2+、Mg2+)對(duì)各條多肽穩(wěn)定性的影響,結(jié)果表明:加熱方式、氯化鈉和Mg2+是影響多肽穩(wěn)定性較顯著的重要因素,加熱溫度、加熱時(shí)間、添加劑、辣椒素和K+、Ca2+對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響較??;在相同處理?xiàng)l件下,通過對(duì)來源于不同蛋白的多肽的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,加熱方式、氯化鈉和Mg2+添加量也均顯著影響多肽的穩(wěn)定性。經(jīng)熱加工等不同條件處理后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛肌紅蛋白中肽段2#和來源于肌球蛋白-2的肽段13#易被質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè),且均具有響應(yīng)較強(qiáng)的峰值,非常穩(wěn)定。綜合考慮,肽段13#作為肉制品樣品摻假檢測(cè)所選的特征多肽優(yōu)勢(shì)更為顯著。本研究探討了多肽在熱加工環(huán)節(jié)中穩(wěn)定性的影響因素,為肉制品加工過程中熱穩(wěn)定多肽的選擇提供了理論依據(jù),進(jìn)而為深加工肉制品真實(shí)性鑒別提供了技術(shù)支持。

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